Влияние индуцированной стрептозотоцином гипергликемии на уровень тревожности и физическую выносливость у крыс линии Вистар

Резюме

Цель работы - исследовать в 70-суточном эксперименте медикаментозную биомодель сахарного диабета (СД) 2 типа на крысах линии Вистар. Животные контрольной группы (n=10) на протяжении всего эксперимента получали питьевую воду ad libitum, животные опытной группы (n=40) на протяжении 2 первых недель эксперимента вместо воды получали 20% раствор фруктозы ad libitum. На 15-е сутки эксперимента животным опытной группы со средней массой тела 257±8 г однократно внутрибрюшинно вводили раствор стрептозотоцина (СТЦ) в дозе 40 мг на 1 кг массы тела. На протяжении последующих 3 нед на 22, 28 и 36-е сутки эксперимента проводили мониторинг уровня глюкозы в крови, отобранной из хвостовой вены с помощью портативного электрохимического глюкометра. На 37-е сутки эксперимента отбирали в группу опытных животных с индуцированным СТЦ СД 2 типа крыс с уровнем глюкозы не менее 11,0 ммоль/л для проведения дальнейших исследований. На 44-е и 60-е сутки производили контрольное определение уровня глюкозы в крови из хвостовой вены. На 70-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. В сыворотке крови определяли содержание глюкозы, гликированного гемоглобина, триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой и низкой плотности. Дополнительно оценивали уровень тревожности животных в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" до и после введения СТЦ. Для сравнения выносливости крыс с индуцированным СД 2 типа и животных контрольной группы физическую нагрузку моделировали на беговой дорожке.

На 37-е сутки эксперимента содержание глюкозы в крови у животных контрольной группы составило 6,6±0,4 ммоль/л. Во 2-ю опытную группу животных с уровнем глюкозы более 11 ммоль/л было отобрано 13 (33%) из 40 крыс, средний уровень глюкозы составил 16,2±1,3 ммоль/л, у остальных 27 крыс уровень глюкозы был в пределах нормы - 7,1± 0,2 ммоль/л. У животных с индуцированным СД 2 типа выявлен повышенный уровень тревожности по сравнению с крысами контрольной группы. По результатам тренировок на беговой дорожке показан достоверно более низкий уровень физической выносливости у животных с индуцированным СД 2 типа по сравнению с крысами контрольной группы. На 44-е и 60-е сутки эксперимента уровень глюкозы крови у животных 2-й опытной группы (соответственно 15,5±1,4 и 14,8±1,2 ммоль/л) был статистически достоверно выше данного показателя для животных контрольной группы (соответственно 7,0±0,5 и 6,8±0,3 ммоль/л, р≤0,05). Уровень гликированного гемоглобина в сыворотке крови животных "диабетической" группы (7,2±0,7%) был достоверно выше по сравнению с животными контрольной группы (3,3±0,2%, р≤0,05), что подтверждает длительную устойчивую гипергликемию. Согласно полученным данным, воспроизведенная модель может быть использована для предварительной экспериментальной оценки влияния тестируемых биологически активных соединений антидиабетического действия.

Ключевые слова:сахарный диабет 2 типа, биологическое моделирование, стрептозотоцин, уровень глюкозы, гликированный гемоглобин, физическая выносливость

Вопр. питания. 2015. № 6. С. 38-45.

Оценка эффективности и безопасности тестируемых биологически активных соединений в эксперименте является, как известно, необходимым этапом, предшествующим клиническим испытаниям их применения в составе специализированных диетических профилактических и/или лечебных продуктов, в частности она позволяет оптимизировать поиск микроингредиентов для пищевых специализированных продуктов антидиабетического действия.

Экстраполяции результатов, полученных при моделировании сахарного диабета (СД) 2 типа с ис- пользованием генетических линий лабораторных животных, на организм человека существенно более оправданна по сравнению с так называемыми медикаментозными моделями [1, 2]. Медикаментозные вмешательства при моделировании СД 2 типа априори не могут достаточно полно отражать процесс развития этого заболевания. Тем не менее, как отмечается в обзорной статье [3], выбор той или иной экспериментальной модели СД 1 или 2 типа во многом определяется целью исследования: тестированием фармакологической активности, генетическими исследованиями или выяснением механизмов развития заболевания.

В силу различных причин, в том числе и экономических, медикаментозные модели СД 2 типа, несомненно, сыграли и продолжают играть свою роль для оценки эффективности природных биологически активных соединений в терапии и профилактике данного заболевания. Для медикаментозного воспроизведения СД 2 типа, как известно, широко используется стрептозотоцин (СТЦ), действие которого выражается прежде всего в деструкции панкреатических β-клеток островков Лангерганса. Наряду с моделью стрептозотоцинового СД 2 типа разработаны и используются модели стрептозотоцинового СД 2 типа на грызунах, потребляющих рационы с высоким содержанием фруктозы. Инсулинорезистентность, нарушения углеводного и липидного обмена, часть диабетических симптомови осложнений у лабораторных грызунов индуцируются поступлением с пищей в течение относительно продолжительно времени большого количества фруктозы, которая может потребляться ad libitum с питьевой водой или рационом [4-6].

Сочетанное действие СТЦ в низкой дозировке и высокофруктозного рациона позволяет в относительно короткий период времени индуцировать развитие СД 2 типа у крыс, как это показано в работе [7]. Эта модель, не требующая составления специального рациона, перспективна для предварительного скрининга антидиабетических препаратов. Для оценки эффективности новых биологически активных соединений в составе специализированных пищевых продуктов для лиц, страдающих СД 2 типа, представляет существенный интерес исследовать их влияние на такие показатели, как физическая работоспособность и тревожное поведение.

С этой целью в работе была осуществлена попытка охарактеризовать влияние введения крысам линии Вистар СТЦ и поступления с пищей большого количества фруктозы, моделирующих СД 2 типа, на уровень тревожности в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" и физическую выносливость при тестировании животных на беговой дорожке.

Материал и методы

Эксперимент проводили на 50 крысах-самцах линии Вистар, полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Исходная масса тела животных на начало эксперимента составила 199±1 г.

Животных разделили на 2 группы: контрольную группу составили 10 особей с массой тела 195±4 г, опытную - 40 крыс с массой тела 200±3 г (р>0,05).

Животные обеих групп на протяжении всего эксперимента получали ad libitum коммерческий гранулированный полноценный корм для содержания крыс и мышей ("Лабораторкорм", РФ).

Животные контрольной группы на протяжении всего эксперимента получали питьевую воду ad libitum. Животные опытной группы (n=40) на протяжении двух первых недель эксперимента вместо воды получали 20% раствор фруктозы, далее этих животных переводили на воду питьевую.

Ежесуточно на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма и жидкости животными обеих групп, 1 раз в неделю животных взвешивали.

На 15-е сутки эксперимента животным опытной группы (n=40) массой тела 257±8 г однократно внутрибрюшинно делали инъекцию раствора СТЦ в дозировке 40 мгм на 1 кг массы тела. СТЦ растворяли в 0,1 М цитратном буфере, pH 4,4. Объем вводимого раствора не превышал 1 мл. Животным контрольной группы массой тела 250±5 г вводили внутрибрюшинно цитратный буфер [8].

На 22, 29 и 36-е сутки эксперимента у всех животных отбирали кровь из хвостовой вены для определения уровня глюкозы в крови с помощью портативного электрохимического глюкометра ("ЭЛТА", РФ).

На 37-е сутки по результатам определения содержания глюкозы в крови отбирали животных с уровнем глюкозы не менее 11,0 ммоль/л для проведения дальнейшего эксперимента. Выбракованных животных подвергали декапитации под легким эфирным наркозом.

На 44-е и 60-е сутки производили забор крови из хвостовой вены животных всех групп для определения глюкозы. На 70-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. У них отбирали кровь, часть из которой непосредственно в пробирку с заранее добавленным антикоагулянтом для определения гликированного гемоглобина. Измерение его концентрации осуществляли в течение 10 сут после отбора крови с использованием коммерческого набора "Гликогемотест" ("ЭЛТА", РФ). Оставшуюся кровь центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин, отбирали сыворотку и хранили при -20 °С. В сыворотке крови на автоматическом анализаторе "Konelab 20i" ("Thermo Scientific", Финляндия) определяли содержание триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП).

В ходе эксперимента дополнительно оценивали некоторые физиологические параметры в тестах "Приподнятый крестообразный лабиринт" и "Беговая дорожка".

Уровень тревожности животных в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт" оценивали на 14-е сутки эксперимента (за день до введения СТЦ) и на 37-е сутки после формирования группы диабетических животных для сравнительной оценки уровня тревожности животных опытной группы с крысами контрольной группы. Перемещение крыс регистрировали при помощи специализированной системы видеонаблюдения "Smart 3.0.04" ("Panlab Harvard Apparatus", Испания). Животное помещается в центр установки, в место пересечения "рукавов" платформы.

Предполагается, что оно будет стремиться к исследованию незнакомого окружения, при этом вступая в борьбу с врожденным страхом открытого пространства, а также высоты (на открытых плечах). Время пребывания крысы в лабиринте составило 5 мин. Система "Smart" фиксировала количество переходов из одной зоны в другую, процент посещения зон, время, проведенное в рукавах [9].

Беговую нагрузку моделировали, используя 5-полосную беговую дорожку "Treadmill LE8710R" ("Panlab Harvard Apparatus", Испания) с регулируемой скоростью и наклоном. В ходе эксперимента животных принуждали к бегу воздействием электрического тока при помощи электрода, помещенного на нижнем конце дорожки на электрической решетке (сила тока может варьировать от 0 до 2 мА). Измеряемые параметры - общая протяженность пройденного расстояния, полное время шока для каждого животного, количество контактов с электрической решеткой. Система включает программное обеспечение "SeDaCom" (Испания), позволяющее не только выводить результаты на экран компьютера, но и контролировать ход эксперимента. На 37-е сутки эксперимента животные контрольной группы и животные опытной группы с индуцированным СТЦ СД 2 типа преступили к тренировкам на беговой дорожке. Животных подвергали физической нагрузке через каждые 2 дня на протяжении 30 сут. Продолжительность тренировки составляла 10 мин. Минимальная скорость движения ремня беговой дорожки - 8 см/c, максимальная - 17 см/с. Минимальную и максимальную скорости постепенно увеличивали до соответственно 16 и 20 см/с, угол наклона беговой дорожки всегда был равен нулю [10].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ "SPSS Statistics 20", используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты

Общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению и скорости роста при ежедневном осмотре на протяжении первых 2 нед эксперимента не отличалось. Прирост массы тела животных контрольной и опытной групп за первые 2 нед эксперимента достоверно между группами не различался, составил соответственно 28,4±3,4 и 28,6±1,9% и соответствовал скорости роста, характерной для животных данного вида и возраста.

Было отмечено достоверно более высокое потребление раствора фруктозы животными опытной группы (74,1±4,0 мл/сут) по сравнению с животными контрольной группы, получавшими воду (47,5±0,6 мл/сут). Животные опытной группы достоверно меньше потребляли корм (19,1±1,2 г/сут) по сравнению с животными контрольной группы (28,4±0,6 г/сут).

На 15-е сутки эксперимента масса тела животных контрольной группы составила 250±5 г и достоверно не отличалась от массы тела опытных животных (257±8 г).

На рис. 1 приведен график изменения массы тела животных обеих групп за 3-недельный промежуток времени после инъекции СТЦ (опытная группа) или воды (контрольная группа). Не было выявлено достоверных изменений массы тела животных опытной группы по сравнению с крысами контрольной группы.

После введения СТЦ проводили мониторинг уровня глюкозы, на рис. 2 приведена динамика изменения содержания глюкозы в крови животных контрольной и опытной групп на 22, 29 и 36-е сутки после введения инъекции.

На 22-е сутки эксперимента, через 7 сут после введения СТЦ по результатам измерения глюкозы крови животных было выявлено, что у 50% животных (20 из 40 животных) уровень глюкозы был выше 11 ммоль/л, таких животных принято относить к диабетическим. Различная индивидуальная чувствительность крыс к индукции гипергликемии путем введения СТЦ, сочетающегося с потреблением рациона с высоким содержанием фруктозы, проявилась в том, что только у половины животных уровень глюкозы в крови превысил 11 ммоль/л. Полученный результат качественно согласуется с данными ряда публикаций [11, 12, 14, 16]. К 29-м суткам эксперимента уровень глюкозы выше 11 ммоль/л был отмечен у 15 из 40 животных, к 36-м суткам количество животных с концентрацией глюкозы крови выше 11 ммоль/л составило 13 из 40 животных. Тенденция к снижению уровня глюкозы после 3 нед с момента введения СТЦ также отмечалась другими исследователями [13, 15, 16].

По результатам измерения концентрации глюкозы в крови животных на 37-е сутки из эксперимента было выведено 27 (67,5%) из 40 животных опытной группы, уровень глюкозы у которых был ниже 11 ммоль/л. 13 животных с уровнем глюкозы не менее 11,0 ммоль/л отобрали для проведения дальнейших экспериментов. Эти крысы составили 2-ю опытную группу животных с индуцированным СД 2 типа с массой тела 275±5 г и уровнем глюкозы крови 16,2±1,3 ммоль/л. Масса тела животных контрольной группы (n=10) составила 308±7 г, уровень глюкозы крови - 6,6±0,4 ммоль/л, оба показателя статистически достоверно отличались от соответствующих показателей 2-й опытной.

В табл. 1 представлены результаты определения глюкозы крови на 44-е и 60-е сутки эксперимента.

Уровень глюкозы крови в оба срока у 2-й опытной группы был статистически достоверно выше данного показателя у животных контрольной группы. Следует отметить, что концентрация глюкозы у 2-й опытной группы на 44-е сутки не отличалась достоверно от данного показателя на 60-е сутки, что говорит об относительной устойчивости вызванной введением СТЦ гипергликемии.

На 70-е сутки эксперимента масса тела животных 2-й опытной группы составила 295±9 г, что статистически достоверно ниже массы тела животных контрольной группы (335±9 г, р0,05). В табл. 2 представлена относительная масса органов животных обеих групп.

Относительная масса печени и почек у животных с индуцированным СТЦ СД 2 типа была достоверно увеличена по сравнению с животными контрольной группы.

В табл. 3 представлены результаты определения показателей липидного обмена. Как видно из представленных данных, статистических различий параметров для обеих групп не обнаружено.

Уровень гликированного гемоглобина в сыворотке крови животных 2-й опытной группы с индуцированным СД 2 типа был достоверно выше по сравнению с контрольными животными (рис. 3), что подтверждает длительную и достаточно устойчивую гипергликемию, так как концентрация гликированного гемоглобина в крови отражает содержание глюкозы в крови за длительный период.

На воспроизведенной модели СД 2 типа, вызванной введением СТЦ и кормлением высокоуглеводным рационом, нами были получены результаты, характеризующие уровень тревожности и физическую выносливость тестируемых крыс.

Не выявлено достоверных различий уровня тревожности животных обеих групп до введения СТЦ.

Время, проведенное в закрытых рукавах лабиринта, для контрольной и опытной групп составило соответственно 207,0±18,2 и 206,2±12,0 с, в открытых рукавах лабиринта - соответственно 32,8±6,7 и 34,6±7,7 с и в центре лабиринта - соответственно 40,5±3,0 и 39,8±4,6 с. Различия между группами недостоверны.

На 37-е сутки эксперимента проводили повторное тестирование на крестообразном приподнятом лабиринте для сравнительной оценки влияния введения СТЦ в дозе 40 мг на 1 кг массы тела животных на поведение и уровень тревожности животных с индуцированным СТЦ диабетом по сравнению с животными контрольной группы.

На рис. 4 отражено среднее время, проведенное в закрытых, открытых рукавах и в центре лабиринта для контрольной и 2-й опытной групп.

Полученные данные свидетельствовали о повышенном уровне тревожности животных с индуцированным СТЦ диабетом по сравнению с контрольными животными.

Результаты тренировок на беговой дорожке показали достоверно более высокий уровень физической выносливости у животных контрольной группы по сравнению с животными с индуцированным СД 2 типа, о чем свидетельствовали данные об изме- рении среднего количества контактов с токовой решеткой. Результаты представлены на рис. 5.

На протяжении всех тренировок различия, наблюдаемые у опытной группы животных по сравнению с контрольной группой, достоверны согласно критерию Стьюдента и критерию Манна-Уитни (р≤0,05).

Выводы

1. В результате проведенного в течение 70 сут исследования in vivo была воспроизведена модель СД 2 типа при использовании крыс линии Вистар с индуцированной гипергликемией.

2. У животных с индуцированным диабетом выявлен повышенный уровень тревожности по сравнению с контрольными животными в тесте "Приподнятый крестообразный лабиринт".

3. Согласно результатам тренировок на беговой дорожке показан достоверно более низкий уровень физической выносливости у животных с индуцированным СД 2 типа по сравнению с животными контрольной группы.

4. Воспроизведенная модель может быть использована для предварительной экспериментальной оценки влияния тестируемых биологически активных веществ антидиабетического действия. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-36-00041)

Литература

1. Мазо В.К., Мурашев А.Н., Сидорова Ю.С., Зорин С.Н. и др. Генетические модели диабета типа 2 на крысах для оценки эффективности минорных биологически активных веществ пищи // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 6. С. 25-31.

2. Sos Skovso. Modeling type 2 diabetes in rats using high fat diet and streptozotocin // J. Diabetes Invest. 2014. Vol. 5, Issue 4. P. 349-358.

3. Aileen J.F. King The use of animal models in diabetes research // Br. J. Pharmacol. 2012. Vol. 166, N 3. P. 877-894.

4. Olatunji L.A., Okwusidi J.I., Soladoye A.O. Antidiabetic effect of anacardium occidentale stem-bark in fructose-diabetic rats // Pharm. Biol. 2005. Vol. 43, N 7. P. 589-593.

5. Potel J. Evaluation of the chronic complications of diabetes in a high fructose diet in rats // Indian J. Biochem. Biophys. 2009. Vol. 46. P. 66-72.

6. Zohreh Elahi-Moghaddam, Morteza Behnam-Rassouli, Naser Mahdavi-Shahri Comparative study on the effects of type 1 and type 2 diabetes on structural changes and hormonal output of the adrenal cortex in male Wistar rats // J. Diabetes Metab. Dis. 2013. Vol. 12. P. 9.

7. Wilson R.D. Fructose-fed streptozotocin-injected rat: аn alternative model for type 2 diabetes // Pharmacol. Rep. 2012. Vol. 64. P. 129-139.

8. Islam M.S., Wilson R.D. Experimentally induced rodent models of type 2 diabetes // Methods Mol. Biol. 2012. Vol. 933. P. 161-174.

9. Rodgers R.J., Cole J.C. The elevated plus-maze: pharmacology, methodology and ethology // Ethology and Psychopharmacology / eds S.J. Cooper, C.A. Hendrie. Chichester : John Wiley and Son Ltd, 1994. P. 9-44.

10. Rahmati M., Movahedin M. Treadmill training modifies KIF5B motor protein in the STZ-induced diabetic rat spinal cord and sciatic nerve // Arch. Iranian Med. 2015. Vol. 18, N 2. P. 94-101.

11. Srinivasan K., Viswanad B., Asrat L. et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat: a model for type 2 diabetes and pharmacological screening // Pharmacol. Res. 2005. Vol. 52. P. 313-320.

12. Якимова Т.В., Насанова О.Н., Мелешко М.В., Буркова В.Н. Метаболические эффекты экстракта крапивы при модели сахарного диабета // Бюл. сибир. мед. 2011. № 5. С. 116-120.

13. Wilson R.D., Islam M.S. Fructose-fed streptozotocin-injected rat: an alternative model for type diabetes // Pharmacol. Rep. 2012. Vol. 64, N 1. P. 129-139.

14. Байрашева В.К. Моделирование сахарного диабета и диабетической нефропатии в эксперименте // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 4. 11 с.

15. Doan Viet Binh, Nguyen Thi Kim Dung, Le Thi Bich Thao, Nguyen Bich Nhi, Phan Van Chi. Macro- and microvascular complications of diabetes induced by high-fat diet and low-dose streptozotocin injection in rats model // Int. J. Diabetes Res. 2013. Vol. 2, N 3. P. 50-55.

16. Kumar C., Kumar R., Nehar S. Induction of type-II diabetes by high fructose diet and low dose of intraperitoneal injection of streptozotocin in albino rats // Int. J. Pharm. Res. Scholar. 2014. Vol. 3, N 1-1. P. 196-202.