Оценка роли бактерий рода Campylobacter в возникновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя

Резюме

Гастроэнтероколиты, вызванные термофильными бактериями рода Campylobacter, являются наиболее распространенными острыми инфекционными зоонозными заболеваниями с пищевым путем передачи. Наибольшую эпидемиологическую значимость представляют Campylobacter jejuni, которые обусловливают до 90% подтвержденных лабораторных случаев пищевого кампилобактериоза. Частота обнаружения кампилобактеров у клинически здоровых сельскохозяйственных животных и домашней птицы, а также в полученном от них сырье свидетельствует о значительном распространении этих зоонозных патогенов и о высоких рисках контаминации ими пищевых продуктов и воды. Основными факторами передачи при кампилобактериозах являются птицепродукты (до 70% от общего числа случаев), питьевая вода (8%), сырое молоко (5%). Важным фактором риска распространения этого эмерджентного патогена является его способность персистировать в водных экосистемах. Интенсификация сельского хозяйства, расширение спектра применяемых дезинфектантов и антисептиков, неконтролируемое использование антибиотиков в животноводстве все чаще приводит к селективному отбору наиболее устойчивых форм Campylobacter spp., обладающих антибиотикорезистентостью и множественными факторами патогенности. Дан обзор современных методов детекции Campylobacter spp., подробно изложены культуральные методы детекции C. jejuni, основанные на применении селективных питательных сред и диагностических наборов для характеристики фенотипических профилей штаммов. Подчеркивается, что основой микробиологического контроля должны стать молекулярные методы на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени, позволяющие проводить оценку присутствующих в пищевых продуктах термотолерантных кампилобактеров, включая C. jejuni.

Ключевые слова:Сampylobacter jejuni, пищевой кампилобактериоз, факторы патогенности, пищевые продукты, методы детекции

Вопр. питания. 2015. № 6. С. 5-18.

Cовременные системы обеспечения безопасности пищевых продуктов требуют детального знания и исследования особенностей новых патогенов, биохимических и генетических механизмов формирования их вирулентности, адаптации к неблагоприятным условиям внешней среды и трансформации бактериальных геномов. Установление эпидемической значимости тех или иных пищевых патогенов предполагает комплексный анализ фено- и генотипических признаков, определяющих таксономическую принадлежность и наличие факторов патогенности микроорганизмов, профиль резистентности к антимикробным препаратам, а также их идентификацию как факторов риска в пищевой цепочке.

Изменение свойств микроорганизмов в условиях антропогенной трансформации внешней среды сопровождается появлением новых или эволюционно измененных возбудителей заболеваний с пищевым путем передачи (эмерджентных пищевых патогенов), обладающих множественными факторами патогенности и устойчивостью к антимикробным средствам. Жизнедеятельность микроорганизмов в той или иной экологической нише непосредственно связана с генетически закрепленной способностью включать регуляторные системы изменчивости на разных стадиях развития микробной клетки. В свете современных концепций перестройка популяционных структур патогенов по факторам патогенности в условиях окружающей среды существенно отличается от характера персистенции возбудителя в клеточных системах макроорганизма при различных типах пищевых инфекций, что требует углубленного изучения биохимических и генетических аспектов этой проблемы.

Обширная группа условно-патогенных и патогенных бактерий включает значительное число микроорганизмов, из которых наиболее опасными в эпидемиологическом отношении являются отдельные представители родов Salmonella, Escherichia, Enterobacter, Listeria и Campylobacter и другие микроорганизмы, способные в определенных условиях вызывать заболевания с пищевым путем передачи.

Оценивая рейтинг вышеназванных микроорганизмов по частоте возникновения вспышек, числу пострадавших и тяжести заболевания, международные организации относят к числу наиболее важных эмерджентных патогенов следующие виды: бактерии рода Salmonella, энтерогеморрагические E. coli (ЕНЕС), Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica. Доминирующее влияние этих микроорганизмов в возникновении пищевых инфекций было установлено в результате анализа массовых вспышек заболеваний в разных странах мира с 1970-1980-х гг. [1].

В подавляющем большинстве они относились к зоонозам и возникали как вследствие потребления продуктов, полученных от больных животных, так и в результате вторичной контаминации при заготовке и переработке животноводческого сырья, в процессе приготовления и хранения пищи [2].

Гастроэнтероколиты, вызванные бактериями рода Campylobacter, являются наиболее распространенными острыми инфекционными зоонозными заболеваниями с пищевым путем передачи. Микроорганизмы Campylobacter spp. известны более 80 лет как возбудители заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц, в 1957 г. они впервые были выделены от больных людей с клиническими признаками гастроэнтерита. В результате установленной взаимосвязи между кишечными инфекциями, обусловленными термофильными кампилобактериями, в животноводческих хозяйствах и заболеваниями человека экспертный комитет ВОЗ в 1982 г. включил этот микроорганизм в официальный перечень возбудителей пищевых токсикоинфекций [3]. В настоящее время общепризнано, что заболевание людей кампилобактериозом вызывают бактерии Campylobacter jejuni (ранее известные как Campylobacter fetus ssp. jejuni).

В некоторых странах, таких как США и Великобритания, отмечается резкий рост случаев заболеваемости кампилобактериозом, число которых превалирует над другими распространенными пищевыми инфекциями - сальмонеллезом и шигеллезом. Широкое распространение кампилобактериозного энтерита в различных странах мира и большой социально-экономический ущерб от этого заболевания объясняют его включение ВОЗ в список эмерджентных пищевых инфекций [4].

Рассматривая таксономию возбудителей кампилобактериоза, следует отметить, что семейство Campylobacteriaceae включает 3 рода - Campylobacter, Arcobacter и Sulfurospirillum [5], каждый из которых включает несколько видов: Campylobacter spp. - 16 видов, Arcobacter spp. - 4 вида, Sulfurospirillum spp. - 5 видов.

Род Campylobacter, впервые описанный M. Veron и R. Chatelain в 1973 г., представлен грамотрицательными неспорообразующими палочками изогнутой или спиральной формы, с полярным расположением жгутиков на одном или двух концах, которое обусловливает специфическую штопорообразную подвижность бактериальной клетки. Эти бактерии являются каталазо- и оксидазоположительными микроаэрофилами; оптимальная атмосфера для роста: 3-15% кислорода, 2-10% углекислого газа и 85-87% азота. Шесть таксонов: Campylobacter jejuni subsp. jejuni, Campylobacter jejuni subsp. doylei, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis и Campylobacter helveticus образуют генетически родственную группу термофильных кампилобактеров с оптимальной температурой роста +42 °С, обладающих способностью инфицировать человека и теплокровных животных.

Большинство видов семейства Campylobacteriaceae характеризуется широкой распространенностью и разнообразием источников выделения (табл. 1), наибольшее значение в возникновении пищевых инфекций имеют C. jejuni и C. coli.

В развивающихся странах эпидемически значимым считают также вид C. upsaliensis.

Видовая идентификация Campylobacter spp. основана на определении фенотипических характеристик, включающих биохимические тесты, профили антибиотикорезистентности и температурные значения роста. Специфические свойства вида Campylobacter jejuni включают анаэробные/микроаэрофильные условия роста, температурный оптимум 42-43 °С, неспособность расти при температуре ниже 30 °С, что ассоциируется с отсутствием генов, ответственных за синтез белков холодового шока, играющих ведущую роль в адаптации многих бактерий к низким температурам [6].

Другие фенотипические характеристики C. Jejuni приведены в табл. 2.

Эпидемиология кампилобактериоза в настоящее время является объектом пристального внимания и детального изучения в большинстве развитых стран мира, поскольку бактерии рода Campylobacter все чаще регистрируются в качестве этиологического агента при пищевых вспышках, а также в спорадических случаях бактериальных гастроэнтеритов и диарейных заболеваний.

ВОЗ признает, что около 1% населения Западной Европы ежегодно инфицируется кампилобактерами [7], поэтому Campylobacter считается одним из наиболее значимых "новых" зоонозных патогенов, способных вызывать заболевания человека и животных.

Кампилобактериоз в большинстве случаев протекает с симптомами энтероколита и гастроэнтерита, продолжительность заболевания составляет от 2-3 дней до 2 нед и более, человек также может быть бессимптомным носителем в течение длительного времени.

Экстраинтестинальные кампилобактериозные инфекции преимущественно включают бактериемию, гемолитический уринарный синдром, перитониты, очаговые инфекции. У иммунокомпромиссных групп населения персистирующие диарейные заболевания и бактериемия с трудом поддаются лечению. Кампилобактериозы редко имеют летальный исход, однако уровень смертности при этой инфекции может недооцениваться, поскольку ассоциируется с другими этиологическими факторами.

Достаточно хорошо изучены такие осложнения кампилобактериоза, как синдром Гийена-Барре (GBS), синдром Миллера-Фишера (MFS) и реактивные артриты, которые являются иммунным ответом на гастроинтестинальную инфекцию [8].

GBS - это обратимый паралич, поражающий периферическую нервную систему. C. jejuni способен к ганглиозидоподобной мимикрии в липополисахаридном слое, вызывая иммунный ответ этих структур, что приводит к повреждению периферических нервных тканей, богатых ганглиозидами.

Основными серотипами при GBS являются HS:19 и HS:41. Реактивные артриты возникают после кампилобактериозной инфекции, по данным разных авторов, в 2,6-45% случаев, и ассоциируются с обнаружением C. jejuni [7].

Учитывая значительную распространенность и циркуляцию кампилобактеров в природе, исследователи уделяют большое внимание частоте обнаружения этих микроорганизмов в различных объектах. Они присутствуют в окружающей среде как комменсалы или патогены в организме домашней птицы или животных, и могут персистировать длительное время при неблагоприятных условиях.

В первую очередь C. jejuni рассматривается как нормальный обитатель кишечника птиц. Степень бактерионосительства у домашней птицы очень высока и достигает 90% [9]. В содержимом кишечника кур количество C. jejuni может достигать 106 КОЕ/г.

Однако частота обнаружения бактерий рода Campylobacter у других видов сельскохозяйственных животных и птицы, а также в полученном от них сырье свидетельствует о значительном распространении этих микроорганизмов и о возможной контаминации вырабатываемых пищевых продуктов. Данные о частоте выделения кампилобактеров обобщены Т. Humphrey и соавт. в 2007 г. [7] и приведены в табл. 3.

Представленный анализ сделан по результатам исследований, опубликованных в различных странах мира (более 20 стран). Показано, что при сравнительно высокой частоте обнаружения этих бактерий в разных видах мясного сырья наибольший риск для здоровья человека связан с употреблением куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик.

Основными источниками спорадических кампилобактерных токсикоинфекций являются домашняя птица (до 70% от общего числа случаев), контакты с домашними животными (6-30%), питьевая вода (8%), сырое молоко (5%).

Вспышки инфекций, связанных с заражением питьевой воды возбудителем Campylobacter jejuni, в последние годы стали довольно частым явленим в Скандинавских странах (Швеции, Норвегии и Финляндии), Новой Зеландии, США. Это связано с тем, что в районах с редким населением пресноводные экосистемы подвержены микробному загрязнению со стороны сельскохозяйственных предприятий. Выявлены сезонные колебания уровней зараженности Campylobacter водоемов: более высокие средние значения установлены летом, в сезон с максимальным использованием воды в рекреационных целях. Вспышки кампилобактериоза, связанные с водой и молочными продуктами, преимущественно регистрируются весной и осенью, в то время как спорадические заболевания наиболее часто наблюдаются в летний период.

Особенности возникновения этих заболеваний связаны в значительной мере с физиологическими свойствами возбудителя: C. jejuni являются термофильными микроорганизмами и не развиваются при температурах ниже 30 °С; они погибают при высушивании, в присутствии высоких концентраций кислорода и при низких значениях рН среды.

Обычные дезинфицирующие средства весьма эффективны против бактерий рода Campylobacter, солнечная радиация также губительно действует на эти микроорганизмы. Вместе с тем персистенция возбудителя в водных экосистемах является одним из основных факторов риска и обусловливает особенности экологии этого эмерджентного патогена.

Продолжающиеся изменения в структуре землепользования и интенсификация сельского хозяйства в ряде стран могут стать причиной даль- нейшего усиления микробного заражения пресных водоемов и грунтовых вод и связанного с этим увеличения количества случаев кишечных заболеваний с водным путем передачи, в том числе таких, как кампилобактериоз.

Заболеваемость кампилобактериозом в европейских странах в 1993-2000 гг. показана в табл. 4, которая включает данные 7-го и 8-го докладов Программы ВОЗ по надзору и контролю за пищевыми инфекциями и интоксикациями в Европе.

Во всех европейских странах на протяжении описанного периода отмечена четкая тенденция увеличения числа заболеваний, вызванных бактериями рода Campylobacter. Наибольший уровень заболеваемости зарегистрирован в Англии и Уэльсе.

Сведений о вспышках или спорадической заболеваемости, связанных с Campylobacter, в Российской Федерации на сегодняшний день недостаточно, поскольку эта нозологическая форма включается в общий перечень заболеваний без указания источников инфекции. При этом учитывается только заболеваемость детей в возрасте до 14 лет (см. рисунок), и диагноз устанавливается на основании клинической картины или косвенных иммунологических тестов. Лабораторное подтверждение роли пищевых продуктов как факторов передачи этих инфекций и квалификация последних как пищевых в настоящий момент практически не проводятся [10].

Следует отметить, что причины подъема заболеваемости кампилобактериозом остаются неизвестными. Имеются предположения о его взаимосвязи с повышением доли в питании населения продуктов из птицы, обычным обитателем кишечника которой являются бактерии рода Campylobacter, и распространением новых технологий упаковки пищевых продуктов в пленки и модифицированную газовую атмосферу, способствующих сохранности и проявлению биологических свойств возбудителя. Высказываются гипотезы о роли в инфицировании некультивируемых форм возбудителя при контактно-бытовом и пищевом пути передачи и перекрестном заражении готовых продуктов от сырой птицы.

Микроорганизмы Campylobacter jejuni обладают несколькими факторами вирулентности, которые определяются такими свойствами возбудителя, как хемотаксис и подвижность, адгезия и инвазия, гликозилирующие системы, продукция ци- толетального токсина CDT, капсулообразование, образование липоолигосахаридов (LOS) и др.

Способность колонизации интестинального тракта Campylobacter связана с хемотаксисом, который на уровне генома кодируется системами, близкими к таковым у E. coli, воздействуя на муцин, L-серин и L-фукозу слизистой кишечника.

Ряд других компонентов системы хемотаксиса C. jejuni идентифицированы как специфичные для данного возбудителя - CheY, CheV, CetA, CetB [11, 12]. Ведущим фактором, определяющим колонизацию кишечника, является образование полярных флагелл (жгутиков), обеспечивающих подвижность и способность к клеточной инвазии кампилобактеров. При этом флагеллы могут вызывать аутоагглютинацию бактериальных клеток, формируя микроколонии как in vitro, так и in vivo, адаптированные к существованию на эпителиальных поверхностях. Функционирование флагелл в качестве секреторных органелл является одним из факторов инвазии, определяющих патогенность C. jejuni [13, 14].

Одним из важных факторов вирулентности C. jejuni является способность к образованию цитолетального токсина СDT, который поражает эукариотические клетки в определенных стадиях деления [15]. Это связывающийся с мембраной клетки токсин, состоящий из трех субъединиц CdrA, CdrB и CdrC. Проникающая в клеточное ядро субъединица CdrB повреждает хромосомную ДНК.

Наличие СDT характерно для всех представителей C. jejuni, этот токсин может обнаруживаться также у Shigella dysenteriae, Helicobacter hepaticus и некоторых E. coli.

Выявление причин пищевого кампилобактериоза весьма важно для разработки профилактических мероприятий и снижения уровней заболеваемости. Ведущую роль в выявлении источников инфекции призваны сыграть современные методы эпидемиологических исследований и лабораторного анализа, позволяющие определить природу заболевания.

Методы выделения и детекции

Традиционные микробиологические методы позволяют определить наличие Campylobacter в пищевых продуктах, они основаны на применении селективных питательных сред и специальных условий культивирования бактерий. Процедура выделения Campylobacter из образцов пищевых продуктов включает:

- предобогащение в селективном бульоне (например, бульон Престона, среда Парка и Сандерса) при 37 °С в течение 4 ч в микроаэрофильных условиях (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота);

- обогащение в селективном бульоне Престона в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 18 ч;

- пересев на 2 агаровые среды для выделения изолированных колоний (агар Кармали, агар Престона и др.), инкубирование в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 24-72 ч.

Для повышения селективных свойств жидких и плотных питательных сред применяют антибиотики (полимиксин В, рифампицин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин и другие в различных комбинациях). Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализации токсического действия кислорода и света в состав большинства сред вводят стерильную дефибринированную баранью или лошадиную кровь.

Поскольку использование крови в лабораториях, контролирующих пищевые продукты, вызывает затруднения, в настоящее время взамен этого компонента рекомендуют применять добавки на основе активированного угля, гематина, а также комбинации из сульфата железа, метабисульфита натрия и пирувата натрия. Для создания микроаэрофильных условий используют различные микроаэробно-генерирующие системы: газ-пакеты, СО2-инкубаторы. Перечень наиболее часто используемых селективных сред для выделения Campylobacter приведен в табл. 5.

Выросшие типичные или подозрительные колонии исследуют по основным морфологическим и биохимическим признакам, в том числе: окраска по Граму, подвижность, оксидазный и каталазный тесты, нитрат/нитрит редукция, гидролиз гиппурата, ферментация углеводов, чувствительность к антибиотикам, температура роста и др. (табл. 6).

Биохимическая дифференциация различных видов Campylobacter вызывает определенные затруднения в связи с общностью большинства признаков и возможным присутствием атипичных вариантов, например гиппуратнегативных или каталазоотрицательных штаммов C. jejuni [16].

Открытые в 1986 г. некультивируемые формы Campylobacter [17] являются фактором риска ввиду возможного присутствия их в пищевых продуктах и воде; тем самым возникают дополнительные затруднения в выявлении возбудителя и оценке безопасности зараженных объектов. Поскольку эти формы (VBNC) не способны расти на культуральных средах, они не могут быть обнаружены традиционными бактериологическими методами, в связи с чем возникает необходмость применения более точных методов, основанных на принципах молекулярной детекции.

Наиболее часто для детекции и типирования термотолерантных Campylobacter используют ме- тоды на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленные на выявление специфичных поверхностно экспрессируемых маркеров (липополисахаридов, антигенных детерминант, флагеллярных генов), консервативных последовательностей 16SРНК, а также генетических детерминант факторов вирулентности и токсинообразования C. jejuni (табл. 7).

Существует большое количество модификаций ПЦР-методов, предназначенных для детекции и идентификации C. jejuni, основная часть которых была разработана для исследования чистых культур кампилобактеров или клинических образцов (в том числе фекалий). Значительно меньше вариантов постановки ПЦР предназначено и используется для прямого об- наружения C. jejuni в пищевых продуктах, которые обычно содержат малые количества возбудителя и характеризуются высоким уровнем сопутствующей микрофлоры [18]. Перечень опубликованных молекулярных методов детекции термотолерантных видов Campylobacter приведен в табл. 8.

При исследовании пищевых продуктов наиболее часто применяются методы, основанные на ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) или изотермальной амплификации нуклеиновых кислот NASBA, которые обладают наибольшей чувствительностью и позволяют выявлять ДНК преимущественно жизнеспособных Campylobacter spp. Проведение ПЦР-РВ требует тщательного подбора способов пробоподготовки, включая селективное обогащение образцов в питательных бульонах, иммуномагнитную сепарацию и др.

В зависимости от выбранного целевого гена или нуклеотидной последовательности можно проводить межвидовую дифференциацию термотолерантных представителей рода Campylobacter с достаточной степенью достоверности. Наиболее специфичным для идентификации C. jejuni считают последовательность ceuE, амплификация которой позволяет обнаружить видоспецифические фрагменты ДНК у близкородственных микроорганизмов C. jejuni и С. coli.

Ниже приведено краткое описание постановки мультиплексной ПЦР и дуплексной ПЦР-РВ. Олигонуклеотидные праймеры и размеры ампликонов представлены в табл. 9.

При проведении мультиплексной ПЦР [48] используют 3 пары праймеров для детекции последовательности 16s rRNA (Campylobacter spp.), генов mapA (C. Jejuni ) и ceuE (С. coli). В состав ПЦР-смеси (30 мкл) входят 1хПЦР буфер, 1,5 мM MgCl2, 0,2 мM dNTPS, 0,6 е.а./мкл Taq-полимеразы, 0,5мкM MD16S1 и MD16S1 праймеров, 0,42мкM праймеров MDmapA1, MDmapA2, COL3 и MDCOL2, 100 нг пробы исследуемой ДНК. Амплификацию проводят в следующем режиме: 1 цикл при 95 °С -10 мин, 35 циклов: при 95 °С - 30 с, при 59 °С -90 с, при 72 °С - 1 мин и один цикл при 72 °С -10 мин. Продукты амплификации (10 мкл) анализируют методом электрофореза в 2% TBE-агарозном геле.

Дуплексная ПЦР-РВ направлена на одновременную детекцию двух генов mapA (C. jejuni) и ceuE (С.coli) с использованием TaqMan-зондов для получения флюоресцентного сигнала [49].

Смесь для ПЦР (20 мкл) включает TaqMan универсальную смесь, по 0,3 мкM каждого праймера, 0,1 мкM mapA-зондов, 0,05мкM ceuE-зондов и 100 нг исследуемой пробы ДНК. Амплификацию проводят в термоциклере ABI PRISM при следующих параметрах: 95 °С - 10 мин, 40 двухэтапных циклов 95 °С - 15 с, 60 °С - 60 с. Как и в традиционной ПЦР, включают позитивные и негативные контроли для каждой пары используемых праймеров.

Оценку результатов ПЦР проводят по нарастанию флюоресцентного сигнала в определенном диапазоне циклов амплификации.

В Российской Федерации разработана, стандартизована и внедрена в практику лабораторий методика детекции Campylobacter jejuni с использованием ПЦР-РВ, подробное описание которой приведено в Методических указаниях МУ 4.2.2872-2011 "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией".

Основные этапы метода включают:

1. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Campylobacter в среде селективного обогащения. Для этого к необходимому количеству подготовленной пробы добавляют 9-кратный объем селективного бульона Престона или селективного бульона Дойла. Полученную взвесь инкубируют в течение 4 ч при 37 °С и в течение 18-24 ч при (42±1) °С. Инкубация осуществляется в микроаэрофильных условиях.

2. Экстракция ДНК. Применяются коммерчески доступные комплекты реагентов на основе методов преципитации или сорбции ДНК на силикагеле.

3. ПЦР для выявления ДНК Campylobacter spp. осуществляется с использованием наборов реагентов, обеспечивающих гибридизационно-флуоресцентную детекцию продуктов амплификации по конечной точке (вариант FEP) и в режиме реального времени (вариант FRT). Для подтверждения жизнеспособности бактериальных клеток Campylobacter методом ПЦР-FRT одновременно тестируют инокуляты пищевых продуктов, подвергавшиеся и не подвергавшиеся инкубации в селективной среде обогащения.

4. Заключение о присутствии Campylobacter spp. в исследованной массе продукта выдают при получении положительного результата ПЦР (выявлении ДНК) и подтверждения их жизнеспособности. Отставание сигнала по каналу JOE/HEX на 3 и более пороговых цикла (Ct) для образца, не подвергавшегося инкубации (Ctне инк.-Ctинк.≥3), свидетельствует о наличии в продукте жизнеспособных клеток Campylobacter.

В целом, учитывая большую значимость проблемы, представляется необходимым проведение углубленного изучения природных источников распространения Campylobacter jejuni, факторов вирулентности, патогенеза и механизмов возникновения инфекций, обусловленных этими эмерджентными патогенами. Наиболее перспективные исследования в изучении возбудителей пищевого кампилобактериоза будут основаны на применении инновационных геномных технологий, включающих методы ДНК-типирования патогенов на основе "microarray"-технологий, мультиплексных форматов ПЦР и секвенирования геномов Campylobacter spp. Это позволит сформировать расширенную базу данных о генетических регуляторных механизмах экспрессии вирулентных свойств этих микроорганизмов для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого кампилобактериоза.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).

Литература

1. Ефимочкина Н.Р. Некоторые закономерности появления эмерджентных пищевых патогенов // Вопр. питания. 2006. № 4. С. 9-15.

2. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н. Изучение загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания. 2006. № 6. С. 38-43.

3. John T., Prescott M., Munroe L. Campylobacter jejuni enteritis in man and domestic animals // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1982. Vol. 181, N 12. P. 1524-1530.

4. Schmidt K. WHO Surveillance Programme for control of foodborne infections and intoxications in Europe. 6th Report - FAO/WHO Collaborating Centre for Research and Training in Food Hygiene and Zoonosis. Berlin, 1995.

5. Nachamkin I., Guerry P. Campylobacter infections // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005. P. 285-293.

6. Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Pathogens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010. 592 p.

7. Humphrey T., O’Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, N 03. P. 237-257.

8. Nachamkin I. Chronic effects of Campylobacter infections // Microbes Infect. 2002. Vol. 4, N 4. P. 399-403.

9. Куликовский А.В. Эмерджентные пищевые зоонозы. М., 2004. 174 с.

10. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. Иванов А.А. и др. Пищевые отравления и инфекции в Российской Федерации за период 1992-2001 гг.: состояние проблемы и тенденции // Гиг. и сан. 2003. № 3. С. 38-45.

11. Marchant J., Wren B., Ketley J. Exploiting genome sequence: predictions for mechanisms of Campylobacter chemotaxis // Trends Microbiol. 2002. Vol. 10, N 4. P. 155-159.

12. Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacterjejuni: molecular biology and pathogenesis // Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5, N 9. P. 665-679.

13. Kopecko D.J., Hu L., Zaal K.J. Campylobacterjejuni - microtubuledependent invasion // Trends Microbiol. 2001. Vol. 9, N 8. P. 389-396.

14. Pei Z., Burucoa C., Grignon B. et al. Mutation in the peb1A locus of Campylobacterjejuni reduces interactions with epithelial cells and intestinal colonization of mice // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, N 3. P. 938-943.

15. Lara-Tajero M., Galan J.E. Cytolethal distending toxin: limited damage as a strategy to modulate cellular functions // TrendsMicrobiol. 2002. Vol. 10. P. 147.

16. Paulsen P., Kanzler P., Hilbert F. et al. Comparison of three methods for detecting Campylobacter spp. in chilled or frozen meat // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 103, Issue 2. P. 229-233.

17. Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment // Appl. Environ. Microbiol. 1986. Vol. 52, N 3. P. 531-538.

18. Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, № 3. С. 24-29.

19. Cheng Z., Griffiths M.W. Rapid Detection of Campylobacter jejuni in Chicken Rinse Water by Melting-Peak Analysis of Amplicons in RealTime Polymerase Chain Reaction // J. Food Protection. 2003. Vol. 66, N 8. P. 1343-1352.

20. Sails A.D., Fox A.J., Bolton F.J. et al. A Real-Time PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Foods after Enrichment Culture // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 3. P. 1383-1390.

21. Josefsen M.H., Cook N., D’Agostino M. et al. Validation of a PCRbased method for detection of food-borne thermotolerant Campylobacters in a multicenter collaborative trial // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 7. P. 4379-4383.

22. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. Detection of Campylobacter jejuni in naturally contaminated chicken skin by melting peak analysis of amplicons in real-time PCR // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 104, Issue 1. P. 105-111.

23. Abu-Halaweh M., Bates J., Patel B.K.C. Rapid detection and differentiation of pathogenic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by real-time PCR // Res. Microbiol. 2005. Vol. 156, N 1. P. 107-114.

24. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. A Robotic DNA purification protocol and real-time PCR for the detection of Campylobacter jejuni in foods // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 10. P. 2131-2135.

25. Wolffs P., Norling B., Hoorfar J. et al. Quantification of Campylobacter spp. in Chicken Rinse Samples by Using Flotation prior to Real-Time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 10. P. 5759-5764.

26. Krause M., Josefsen M. H., Lund M. et al. Comparative, collaborative, and on-site validation of a TaqMan PCR method as a tool for certified production of fresh, Campylobacter-free chickens // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, N 8. P. 5463-5468.

27. Debretsion A., Habtemariam N., Wilson S. et al. Real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Campylobacter jejuni on chicken rinses from poultry processing plant // Mol. Cell. Probes. 2007. Vol. 21, Issue 3. P. 177-181.

28. Fukushima H., Katsube K., HataY. et al. Rapid separation and concentration of food-borne pathogens in food samples prior to quantification by viable-cell counting and real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 1. P. 92-100.

29. Wolffs P.F.G., Glencross K., Norling B., Griffiths M.W. Simultaneous quantification of pathogenic Campylobacter and Salmonella in chicken rinse fluid by a flotation and real-time multiplex PCR procedure // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, Issue 1. P. 50-54.

30. Hong J., Jung W.K., Kim J.M. et al. Quantification and differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in raw chicken meats using a real-time PCR Method // J. Food Protection. 2007. Vol. 70, N 9. P. 2015-2022.

31. Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J. et al. Identification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37, N 3. P. 510-517.

32. Waage A.S., Vardund T., Lund V., Kapperud G. Detection of Small Numbers of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli cells in environmental water, sewage, and food samples by a seminested PCR assay // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, N 4. P. 1636-1643.

33. Waller D.F., Ogata S.A., Quantitative immunocapture PCR assay for detection of Campylobacter jejuni in foods // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66, N 9. P. 4115-4118.

34. Thunberg R. L., Tran T.T., Walderhaug M.O. Detection of thermophilic Campylobacter spp. in blood-free enriched samples of inoculated foods by the polymerase chain reaction // J. Food Protection. 2000. Vol. 63, N 3. P. 299-303.

35. Denis M., Refregier-Petton J., Laisney M.J. et al. Campylobacter contamination in French chicken production from farm to consumers. Use of a PCR assay for detection and identification of Campylobacter jejuni and Camp. coli // J. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 91, N 2. P. 255-267.

36. Moreno Y., Hernandez M., Ferrus M. A. et al. Direct detection of thermotolerant campylobacters in chicken products by PCR and in situ hybridization // Res. Microbiol. 2001. Vol. 152, N 6. P. 577-582.

37. Bolton F.J., Sails A.D., Fox A.J. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay // J. Food Protection. 2002. Vol. 65, N 5. P. 760-767.

38. Hong Y., Berrang M.E., Liu T. et al. Rapid detection of Campylobacter coli, C. jejuni, and Salmonella enterica on poultry carcasses by using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 6. P. 3492-3499.

39. Josefsen M.H., Jacobsen N.R., Hoorfar J. Enrichment followed by quantitative PCR both for rapid detection and as a tool for quantitative risk assessment of food-borne thermotolerant Campylobacters // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 3. P. 3588-3592.

40. Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence of foodborne pathogens // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 12. P. 2637-2647.

41. Mateo E., Carcamo J., Urquijo M. et al. Evaluation of a PCR assay for the detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in retail poultry products // Res. Microbiol. 2005. Vol. 156, N 4. P. 568-574.

42. Quinones B., Parker C.T., Janda J.M. Jr. et al., Detection and genotyping of Arcobacter and Campylobacter isolates from retail chicken samples by use of DNA oligonucleotide arrays // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 11. P. 3645-3655.

43. Schmid M.W., Lehner A., Stephan R. et al. Development and application of oligonucleotide probes for in situ detection of thermotolerant Campylobacter in chicken faecal and liver samples // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 105, Issue 2. P. 245-255.

44. Uyttendaele M., Schukkink R., van Gemen B., Debevere J. Detection of Campylobacter jejuni added to foods by using a combined selective enrichment and nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61, N 4. P. 1341-1347.

45. Uyttendaele M., Bastiaansen A., Debevere J. Evaluation of the NASBA® nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni // Int. J. Food Microbiol. 1997. Vol. 37, Issue 1. P. 13-20.

46. Uyttendaele M., Debevere J., Lindqvist R. Evaluation of buoyant density centrifugation as a sample preparation method for NASBAELGA detection of Campylobacter jejuni in foods // Food Microbiol. 1999. Vol. 16, N 6. P. 575-582.

47. Churruca E., Girbau C., Martinez I. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in chicken meat samples by realtime nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacons // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, Is. 1. P. 85-90.

48. Denis M., Soumet C., Rivoal K. et al. Development of a m-PCR assay for simultaneous identification of Campylobacter jejuni and C. coli. // Lett. Appl. Microbiol. 1999. Vol. 29, Is. 6. P. 406-410.

49. Best E.L., Powell E.J., Swift C. et al. Applicability of a rapid duplex real-time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates // FEMS Microbiol. Lett. 2003. Vol. 229, N 2. P. 237-241.