Методика количественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра

РезюмеРазработана методика одновременного определения водорастворимых витаминов В1, В2, В6, В12, РР, В5, В9, С, В8 в обогащенных пищевых продуктах и премиксах с помощью системы капиллярного электрофореза Agilent 3D CE, диодно-матричного детектирования, кварцевого капилляра HPCE stndrd cap Lэфф/Lобщ - 36/56 см, ID - 50 мкм, 50 мМ боратного буфера с рН=9,3, 100 мМ натрия додецилсульфата. Методика отработана на 6 витаминных премиксах и 28 видах обогащенной витаминами пищевой продукции. Полученные нами данные совпадают с результатами исследований по определению витаминов, проведенных с помощью других методов. Разработанная нами методика может быть использована при анализе указанных выше водорастворимых витаминов в премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктов.

Ключевые слова:водорастворимые витамины, капиллярный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография

Согласно статистическим данным, до 30 % населения Российской Федерации испытывают недостаток в поступлении аскорбиновой кислоты (витамина С), более 60% недостаточно обеспечены витаминами группы В и каротиноидами [2, 3]. Это связано с сезонными изменениями состава пищевого рациона (например, неравномерным употреблением овощей и фруктов в разные времена года), хранением и технологической обработкой пищевых продуктов, условиями среды, труда и быта, индивидуальной особенностью организма и т.д.

При таких условиях для нормального функционирования организма возникает необходимость в восполнении дефицита витаминов в виде дополнительного приема обогащенных витаминами пищевых продуктов или биологически активных добавок к пище (БАД) и поливитаминных комплексов [2]. Для обогащения пищевых продуктов и БАД чаще всего используют сухие витаминные премиксы, в состав которых могут входить как водо-, так и жирорастворимые витамины. Анализ содержащих витамины БАД показал, что номенклатура этих БАД (по данным реестра Федеральной службы по надзору в сфере прав защиты потребителей и благополучия человека за 2005-2010 гг.) [22] увеличивается (см. рис. 1).

Рис. 1. Количество зарегистрированных БАД, содержащих витамины, за 2005-2010 гг.

В настоящее время наиболее часто в питании, особенно детском, используются обогащенные витаминами пищевые продукты - молочные и кисломолочные (молоко, творожки, йогурты, сухие и жидкие молочные смеси, молочно-фруктовые пюре), зерновые (каши, сухие завтраки, хлеб, хлебцы), напитки (безалкогольные, тонизирующие, кисели), специализированные продукты для спортсменов, специализированные продукты для энтерального питания.

В связи с расширением списка витаминных премиксов и обогащенных витаминами пищевых продуктов и БАД актуальным является проведение в них качественного и количественного контроля витаминов. В настоящее время существует несколько официальных методов определения содержания лишь отдельных витаминов. К этим методам прежде всего относятся титрование, спектрофотометрия, полярография, флуорометрия, фотоэлектроколориметрия, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (см. табл. 1).

Таблица 1. Сравнительный анализ методов количественного определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах, премиксах и БАД к пище, закрепленных в нормативных документах РФ

Таблица 2. Методики определения водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Из перечисленных методов только метод капиллярного электрофореза (КЭ), описанный в ГОСТ Р 52741-2007, позволяет в исследуемом образце определить одновременно 8 водорастворимых витаминов, но он может быть использован только для исследования этих витаминов в премиксах, а не пищевых продуктах и БАД.

Актуальной является разработка методики, которая позволила бы определить их содержание одновременно и в обогащенных пищевых продуктах, премиксах и БАД, уменьшая при этом затраты времени и средств на проведение исследований. В настоящее время для этих целей традиционно используются различные методики определения витаминов, основанные на методе ВЭЖХ (см. табл. 2) [4, 6, 9, 10, 12-15, 17, 19, 20].

Метод КЭ дополняет классические методы разделения, такие как ВЭЖХ и газовая хроматография (ГХ), являясь более дешевым (в плане проведения исследований), и способствует сокращению времени исследования. Метод основан на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле. Выделяют следующие варианты КЭ: капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ), мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ), микроэмульсионная капиллярная электрокинетическая хроматография (МЭКЭКХ), капиллярная электрохроматография (КЭХ), капиллярный гель-электрофорез (КГЭ), капиллярная изоэлектрофокусировка (КИЭФ), капиллярный изотахофорез (КИТФ). По сравнению с другими разделяющими методами анализа, КЭ имеет ряд преимуществ [1]: он более экономичен, практически не требует дорогостоящих хроматографических колонок, а также использования дорогостоящих высокочистых растворителей (ацетонитрил, метанол, гексан).

КЭ, несмотря на небольшую историю своего применения для анализа различных групп биологически активных веществ, в том числе и витаминов в пищевых продуктах, БАД, воды и др., уже нашел широкое применение у нас в стране и за рубежом. Существуют различные варианты методик для исследования витаминного состава различных объектов пищевой и фармацевтической промышленности (см. табл. 3) [5, 7-9, 11, 16, 18, 21]. Проведение анализа на коротком конце капиллярановое направление в методе КЭ. С помощью такой техники выполнения анализа удается преодолеть затруднение, обусловленное неизбежным истощением носителей зарядов во флаконах с буферными растворами (часто наблюдаемый эффект при работе на длинном конце капилляра - классическая техника). Из-за такого истощения обнаруживаются нестабильность и невоспроизводимость результатов разделения, приходится часто заменять растворы, используемые в системе. Этот очевидный недостаток может затруднять выполнение серии анализов, повышает расход реактивов и требует непрерывного надзора оператора. Всего этого удается избежать, изменив для ввода пробы входной конец капилляра на выходной. Для этого необходимо внести небольшие изменения в условия разделения определяемых биологически активных веществ: поместить флакон с образцом под выходной конец капилляра (а не под входной), использовать гидродинамическое ведение процесса под воздействием вакуума (а не давления) и изменить полярность высокого напряжения.

Целью нашей работы является разработка методики качественного и количественного определения водорастворимых витаминов (тиамина хлорида гидрохлорид, рибофлавина, никотиновой кислоты и никотинамида, пантотеновой кислоты, пиридоксина гидрохлорида, фолиевой и аскорбиновой кислот, биотина) в витаминных премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктах с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра.

Таблица 3. Методики определения водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

Материал и методы

Для определения водорастворимых витаминов нами был использован метод мицеллярной электрокинетической хроматографии.

Электрофоретическое разделение проводили на системе капиллярного электрофореза Agilent 3D CE (Agilent, США) с диодно-матричным детектором, на кварцевом капилляре HPCE stndrd cap Lэфф/Lобщ=47,5/56 см (короткий конец - 8,5 см), ID=50 мкм; температура термостата - 25 °С; эффективное напряжение - 30 кВ. Общее время анализа - 5 мин. Детектирование проводили на волнах с длиной 210, 254, 270 и 292 нм. Снятие спектра проводили в диапазоне от 190 до 400 нм. Ввод пробы осуществляли гидродинамически (-50 мбар в течение 10 с).

Центрифугирование исследуемых образцов проводили на центрифуге Eppendorf 5418 (Eppendorf, Германия), встряхивание - на шейкере Biosan OS-10 (Biosan, Латвия), озвучивание - на УЗ ванне CTBRAND (Китай), нагревание - на водяной бане AiSet NF (Лабтех).

Для приготовления буфера применяли воду, очищенную на системе Milli-Q, а также натрий тетраборнокислый 10-водный марки "ч.д.а.", натрия додецилсульфат 98,5% (фирмы "Sigma"). Для приготовления исследуемых образцов использовали дистиллированную воду, калия гидроксид марки "х.ч.". Промывку капилляра проводили водой, очищенной на системе Milli-Q, 1,0 М и 0,1 М растворами натрия гидроксида фирмы "Agilent".

Для приготовления стандартных растворов использовали аскорбиновую кислоту (99,0%), никотиновую кислоту (99,5%), никотинамид (99,5%), пиридоксина гидрохлорид (99,0%), рибофлавин (98,0%), тиамина хлорид гидрохлорид (99,0%), фолиевую кислоту (97,0%), кальциеваую соль D-пантотеновой кислоты (99,0%), (+)-биотин (99,0%), производства "Fluka Chemie GmbH".

Рабочие стандартные растворы готовили следующим образом: 5, 10, 20, 40, 80 мг (точная навеска) указанных выше веществ помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли туда около 30 мл воды очищенной (подщелоченной в случае фолиевой кислоты до рН=9,5-10,0 по лакмусу). Затем интенсивно встряхивали, при необходимости озвучивали на УЗ ванне до полного растворения вещества (нагревали в случае приготовления стандартного раствора рибофлавина). После этого объем раствора доводили до метки очищенной водой и перемешивали, затем фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Приготовленные рабочие растворы хранили в течение 30 дней при температуре -18 С.

Объектами исследования служили 6 витаминных премиксов и 28 обогащенных витаминами пищевых продуктов (табл. 4).

Подготовку проб таблетированных, порошкообразных и твердых форм витаминных премиксов, а также порошкообразных и жидких форм обогащенных витаминами пищевых продуктов проводили следующим образом: 0,5-2,0 г (точная навеска для премиксов) и 5,0 г/5,0 мл (точная навеска/точный объем для обогащенных витаминами пищевых продуктов) образца помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, затем экстрагировали 30 мл очищенной воды, подщелоченной в случае фолиевой кислоты до рН=9,5-10,0 по лакмусу. После чего интенсивно встряхивали на шейкере в течение 10 мин. Для наилучшей экстракции рибофлавина приготовленные пробы нагревали на водяной бане в течение 10-15 мин.

Таблица 4. Процент открытия водорастворимых витаминов от заявленного количества в группах обогащенных пищевых продуктов и премиксах

Рис. 2. Электрофореграмма разделения витаминов в смеси стандартных рабочих растворов при длине волны 210 нм

Рис. 3. Электрофореграмма разделения витаминов в витаминном премиксе NUTR RU11620 при длине волны 210 нм

Далее доводили объем раствора образца до метки очищенной водой и перемешивали. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр, размер пор которых был 0,45 мкм, или центрифугировали при 20 000 g в течение 10 мин. В тех случаях, когда образец содержал фолиевую кислоту, рибофлавин и другие водорастворимые витамины, пробы готовили в 3 вариантах: отдельно с подщелачиванием для экстракции фолиевой кислоты, отдельно с нагреванием на водяной бане для экстракции рибофлавина и отдельно для экстракции остальных водорастворимых витаминов.

Приготовленные пробы анализировали в течение суток.

Электрофоретическое разделение проводили следующим образом.

Для разделения водорастворимых витаминов использовали 50 мМ боратный буферный раствор рН 9,3, содержащий 100 мМ натрия додецилсульфата. Для его приготовления брали 1,91 г (точная навеска) натрия тетрабората десятиводного и 2,884 г натрия додецилсульфата, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 60 мл воды, очищенной на системе Milli-Q, встряхивали на шейкере в течение 5 мин, озвучивали на УЗ ванне до полного растворения. Далее доводили объем до метки водой, очищенной на системе Milli-Q. Полученный буферный раствор перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Перед работой новый капилляр последовательно промывали в течение 5 мин 1 М раствором натрия гидроксида, затем в течение 5 мин деионизированной водой и в течение 5 мин рабочим буфером. Между анализами для промывки капилляра использовали следующую схему: 3 мин 0,1 М раствором натрия гидроксида, 3 мин деионизованной водой и 3 мин рабочим буфером.

Детектирование водорастворимых витаминов проводили на фотодиодно-матричном детекторе при длинах волн 210, 254 и 292 нм (диапазон - 190-400 нм). Выбор длины волны объясняется специфичными максимумами их спектров поглощения. Витамины на электрофореграмме идентифицировали путем сравнения со стандартом по времени миграции и спектру в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях спектра. В качестве примера разделения водорастворимых витаминов в указанных условиях на рис. 2 и 3 приведена электрофореграмма смеси стандартных рабочих растворов и витаминного премикса.

Результаты и обсуждение

В процессе исследования нами были изучены различные варианты разделения и определения водорастворимых витаминов. Для этого сравнивали разделяющую способность 50 мМ фосфатного и 50 мМ боратного буферов, из которых более эффективным оказался боратный буфер. Также в ходе работы изучали влияние различных концентраций мицеллообразующего агента (натрия додецилсульфата) на разделяющую способность боратного буфера. Лучший результат был достигнут при добавлении 100 мМ натрия додецилсульфата. В итоге были подобраны наилучшие условия разделения и количественного определения водорастворимых витаминов методом МЭКХ (табл. 5). В подобранных условиях удалось быстро (в течение 5 мин) провести определение содержания водорастворимых витаминов в исследуемых образцах.

Разрешение разработанной методики составило не менее 1,5 (для аскорбиновой и пантотеновой кислот - 0,75). Предел обнаружения витаминов был в промежутке от 1,0 мг/кг (для рибофлавина) до 10,0 мг/кг (для фолиевой кислоты). Предел количественного определения находился в зоне от 4,0 мг/кг (для рибофлавина) до 30,0 мг/кг (для фолиевой кислоты). Это позволило уверенно проводить определение количества витаминов в большинстве витаминных премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктах. Оценку количественного содержания витаминов осуществляли методом абсолютной градуировки с построением калибровочной кривой по 5 точкам. Процент открытия витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах, обогащенных витаминами, представлен в табл. 5 (процент открытия составил от 92,3 до 99,9%). Колебания процента открытия наблюдались для аскорбиновой и фолиевой кислот вследствие их неустойчивости к факторам окружающей среды.

Для оценки точности результатов разработанной методики была вычислена систематическая ошибка, которая составила не более 10%, а также установлена полуширина доверительного интервала (от 0,49% для никотинамида до 2,95% для пантотеновой кислоты). Воспроизводимость результатов оценивали по величине относительного стандартного отклонения (S), которая составила от 0,56% (для никотинамида) до 3,36% (для пантотеновой кислоты).

При помощи разработанной методики был исследован витаминный состав 6 премиксов и 28 обогащенных пищевых продуктов. Полученные результаты были подтверждены исследованиями, в которых использовали официальные методы определения витаминов (ВЭЖХ, спектрофотометрия). Для сравнения полученных данных были рассчитаны коэффициенты корреляции, величина которых составила от 0,9955 для рибофлавина до 0,9985 для пиридоксина гидрохлорида (сравнение с методом ВЭЖХ согласно Р.1.4.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище"). На рис. 4 приведен пример сравнения результатов количественного определения водорастворимых витаминов разработанной методикой с помощью метода МЭКХ и методом ВЭЖХ согласно Р.1.4.1672-03.

Таблица 5. Условия разделения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии

Рис. 4. Сравнение результатов количественного определения водорастворимых витаминов в витаминном премиксе методами МЭКХ и ВЭЖХ

Было выявлено, что КЭ обладает преимуществом при определении витаминов (особенно никотинамида и никотиновой кислоты) в премиксах и пищевых продуктах, в частности в молочных и кисломолочных. В то же время при применении ВЭЖХ, спектрофотометрии и флюориметрии это часто сделать не удается. К тому же подготовка образцов для исследования этими методами многоэтапна и занимает длительное время.

Таким образом, было показано, что разработанная нами методика с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра может быть использована наряду с другими методиками для количественного определения содержания водорастворимых витаминов в различных витаминных премиксах и обогащенных витаминами пищевых продуктах.

Литература

1. Беккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза. - М.: Техносфера, 2009. - 458 с.

2. Витаминные препараты. Новая популярная медицинская энциклопедия / Гл. ред. В.И. Покровский. - М.: Энциклопедия, 2004. - 768 с.

3. Спиричев В.Б., Шатнюк Л.Н., Поздняковский В.М. Обогащение пищевых продуктов витаминами и минеральными веществами. Наука и технология. - Новосибирск: Сибир. унив. изд-во, 2004. - 548 с.

4. Burini G. // J. Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1154. - P. 9 7-10 2 .

5. Candioti L.V., Robles J.C., Mantovani V.E. et al. // J. Talanta. - 2006. - Vol. 69. - Р. 140-147.

6. Chavez-Servin J.L., Castellote A.I., Carmen M. // J. Chromatogr. A. - 2006. - Vol. 1122. - P. 138-143.

7. Delgado-Zamarreno M.M., Gonzalez-Maza I., SanchezPerez A. et al. // J. Chromatogr. A. - 2002. - Vol. 953. - P. 2 5 7- 2 6 2 .

8. Fung Cheung R.H., Hughes J.G., Marriott P.J. et al. // Food Chem. - 2009. - Vol. 112. - Р. 507-514.

9. Fung Cheung R.H., Morrison P.D., Small D.M. et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1213. - P. 93-99.

10. Heudi O., Kilinc T., Fontannaz P. // J. Chromatogr. A. - 2005. - Vol. 1070. - P. 49-56.

11. Hustad S., Ueland P.M., Schneede J. // Clin. Chem. - 1999. - № 45/46. - Р. 862-868.

12. Lebiedzinska A., Marszatt M.L., Kuta J. et al. // J. Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1173. - P. 71-80.

13. Li Jia, Yaling Liu, Yanyan Du et al. // J. Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1154. - P. 416-422.

14. Mittermayr R., Kalman A., Trisconi M.-J. et al. // J. Chromatogr. A. - 2004. - Vol. 1032. - P. 1-6.

15. Morten A. Kall // J. Food Chem. - 2003. - Vol. 82. - Р. 3 15 - 3 2 7.

16. Okamoto H., Nakajima T., Ito Y. // J. Chromatogr. A. - 2003. - Vol. 986. - P. 153-161.

17. Perveen S., Yasmin A., Khan K.M. // Chem. J. - 2009. - N 3. - Р. 1 - 5 .

18. Shabangi M., Sutton J.A. // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2005. - Vol. 38. - P. 66-71.

19. Vidovica S., Stojanovica B., Veljkovica J. et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1202. - P. 155-162.

20. Vinas P., Lopez-Erroz C., Balsalobre N. et al. // J. Chromatogr. A. - 2003. - Vol. 1007. - P. 77-84.

21. Yin C., Cao Y., Ding S. et al. // J. Chromatogr. A. - 2008. - Vol. 1193. - P. 172-177.

22. www.fp.crc.ru