Влияние нового кисломолочного продукта с гидролизатом сывороточных белков на переносимость и динамику проявлений атопического дерматита у детей с аллергией на белки коровьего молока

Резюме

Диетические кисломолочные продукты традиционно занимают важное место в профилактике и терапии различных заболеваний пищеварительного тракта. При обогащении таких продуктов пробиотиками и пребиотиками их регулярное потребление способствует поддержанию иммунного статуса человека. Кроме того, известно, что конформация молочных белков при ферментации заквасочными микроорганизмами может снижать аллергенность кисломолочных продуктов по сравнению с исходным молоком, придавая им дополнительные функциональные свойства. В этом аспекте перспективна и управляемая биокаталитическая конверсия молочных белков, также позволяющая получать продукты со сниженной аллергенностью, при этом сохраняющие свойства, необходимые для выработки иммунологической (оральной) толерантности. В работе представлены результаты проведенного клинико-лабораторного исследования переносимости нового разработанного кисломолочного продукта "Биокефир-П 1% жирности" с заменой 20% молочных белков на гидролизаты сывороточных белков (подсырной сыворотки) у 20 детей, страдающих пищевой аллергией на белок коровьего молока в виде атопического дерматита в стадии ремиссии. Анализ показал, что ежедневное в течение 2 нед потребление 250 мл данного продукта детьми в возрасте от 3 до 16 лет с легкими проявлениями пищевой аллергии на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты оказывает положительное влияние на состояние и самочувствие детей, сопровождается улучшением показателей антиоксидантной защиты организма (увеличение антиоксидантной емкости сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу с 5,82±0,35 до 6,84±0,43 мМ тролоксовых эквивалентов) и кишечной микробиоты (увеличение содержания бифидобактерий и лактобактерий в содержимом кишечника с 18,7±0,83 до 24,7±0,62 и с 15,3±0,31 до 19,1±0,65 усл. ед.). В сыворотке крови пациентов не обнаружено изменения маркерных для пищевой аллергии параметров - содержания общего белка и уровней циркулирующих аллергенспецифических IgG и IgE антител к β-лактоглобулину коровьего молока, что подтверждает низкие аллергенные свойства продукта.

Ключевые слова:дети, диетотерапия, пищевая аллергия, атопический дерматит, кисломолочный продукт, гидролизат сывороточных белков, β-лактоглобулин коровьего молока, аллергенспецифические антитела, антиоксидантная емкость к пероксильному радикалу, кишечная микрофлора

Вопр. питания. 2015. № 5. С. 56-63.

Данные отечественной медицины свидетельствуют о том, что каждый 3-й житель России подвержен аллергии, и прямые затраты на лечение 1 больного неуклонно возрастают, достигая 65 000 руб. в год [1-3]. При этом одна из наиболее распространенных форм аллергических заболеваний (до 80%) - пищевая аллергия [4, 5]. Среди пациентов, страдающих пищевой аллергией, наиболее часто (70-80%) встречается непереносимость белков коровьего молока. Это является серьезной медико-социальной проблемой, поскольку продолжительное потребление нативных молочных продуктов в таком случае приводит к сбоям в работе иммунной системы и развитию хронических заболеваний, таких как атопический дерматит и бронхиальная астма, дисбиозам желудочно-кишечного тракта и т.д. Более того, предполагается существование связи между непереносимостью белков коровьего молока и развитием детского аутизма [1, 2, 6]. Неотъемлемой частью комплексной терапии "молочной" аллергии является диетотерапия, которая строится на исключении из рациона продуктов на основе белков коровьего молока или использования специализированных смесей.

В свою очередь это также таит в себе потенциальную опасность формирования остеопении за счет недополучения необходимого организму кальция из молока [7].

Одним из подходов к созданию молочных продуктов со сниженной аллергенностью является процесс ферментативного гидролиза молочных белков [4]. В зависимости от степени расщепления молочного белка выделяют смеси пептидов, созданные на основе высоко- или частично (умеренно) гидролизованного белка. При этом существует четкая корреляция между длиной пептида и его аллергенностью: чем больше молекулярная масса (т.е. чем крупнее пептид), тем выше риск развития аллергической реакции. В связи с вышесказанным актуальным является создание молочных продуктов с помощью управляемого гидролиза для получения такого пептидного профиля, который утрачивает сенсибилизирующую активность, при этом сохраняя свойства, необходимые для выработки иммунологической толерантности [8, 9].

Ранее в ФГБНУ ВНИМИ были разработаны ферментативный способ получения смеси гидролизованных белков молочной сыворотки [10] и способ изготовления кисломолочного продукта "Биокефир-П 1% жирности" (далее - продукт) с заменой 20% молочных белков на гидролизат белков подсырной сыворотки, предназначенного для диетического и профилактического питания [11].

Цель настоящего исследования - клиническая оценка переносимости продукта и динамики некоторых проявлений аллергии у детей с пищевой аллергией на белки коровьего молока.

Материал и методы

Исследование проведено на базе отделения аллергологии клиники лечебного питания ФГБНУ "НИИ питания". В обследование было включено 20 детей в возрасте от 3 до 16 лет с легкими проявлениями пищевой аллергии в виде атопического дерматита. Критерии включения: диагноз атопический дерматит, установленный по характерным симптомам болезни; связь возникновения симптомов заболевания с приемом молочных продуктов в анамнезе; лабораторное подтверждение пищевой аллергии по результатам исследования аллергенспецифических IgE и IgG антител в сыворотке крови к белку коровьего молока. Степень тяжести кожных проявлений на момент начала испытаний и в динамике оценивали по системе SCORAD.

Продукт изготавливался ОАО "Молочный комбинат “Воронежский”" в соответствии с ТУ 9222-51200419785 (СГР № RU.77.99.19.004.Е.009238.11.13) путем сквашивания смеси пастеризованного молока и гидролизата сывороточных белков закваской молочнокислых микроорганизмов и дрожжей, входящих в состав микрофлоры кефирных грибков, с добавлением пропионовокислых бактерий. Продукт содержит (в 100 г): 3,1 г белка; 1 г жира; 4,2 г углеводов (лактозы); энергетическая ценность 38 ккал/160 кДж. Каждая партия продукта подвергалась контролю по всему перечню нормируемых показателей качества и безопасности в аккредитованной лаборатории предприятия-изготовителя.

Доставка продукта в отделение аллергологии осуществлялась не позднее чем за 8 ч до начала приема детьми. Все дети в течение 14 дней получали по 250 мл продукта в сутки на ночь на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты с исключением высокоаллергенных (облигатных) аллергенов (рыба и морепродукты, орехи, шоколад, какао, творог, сметана, цитрусовые).

Переносимость продукта пациентами оценивали по развитию у них нежелательных и побочных явлений, учету общего состояния и самочувствия ежедневно на протяжении всего времени приема данного продукта. Для оценки эффективности продукта у наблюдаемых детей осуществлялся ежедневный осмотр кожных покровов.

Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ "НИИ питания". Перед исследованием получено информированное согласие родителей или опекунов пациента.

Для определения титров аллергенспецифических IgE и IgG антител к β-лактоглобулину (β-ЛГ) коровьего молока в сыворотке крови в лунки 96-луночных прозрачных полистироловых микропланшетов ("Corning Costar", США) с иммобилизованным β-ЛГ вносили по 0,1 см3 испытуемых сывороток (интервал разведений от 1:10 до 1:20 000). Микропланшет инкубировали 60 мин при 37 °С, отмывали 50 мМ К-фосфатным буфером (рН 7,4, с добавлением 0,1 М NaCl и 0,05% Тритона Х-100). Для определения аллергенспецифических IgE в лунки вносили по 0,1 см3 мышиных антител против IgE человека в концентрации 10 мкг/см3.

После повторной инкубации и отмывки в лунки планшета вносили по 0,1 см3 конъюгата антител против IgG мыши с пероксидазой ("Медгамал", Россия), разведение 1:6000. Для определения аллергенспецифических IgG в лунки микропланшета вносили по 0,1 см3 конъюгата антител против IgG человека с пероксидазой ("Медгамал", Россия), разведение 1:6000, вновь инкубировали и отмывали. Для определения пероксидазной активности связавшейся с носителем ферментной метки в лунки микропланшета вносили по 0,1 см3 0,4 мМ раствора 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина в 40 мМ Na-цитратном буфере (рН 4,0) с 3 мМ Н2О2, затем инкубировали 15 мин при комнатной температуре, останавливали реакцию добавлением 0,05 см3 1 М H2SO4 и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на микропланшетном фотометре-флуориметре "Synergy 2" ("BioTek", США). По калибровочной кривой определяли концентрацию аллергенспецифических антител в сыворотке крови.

Концентрацию общего белка в сыворотке крови определяли с использованием набора реагентов "Pierce BCA protein assay kit" ("Thermo Scientific ", США). Содержание белка в сыворотке крови измеряли на микропланшетном фотометре-флуориметре "Synergy 2" ("BioTek", США).

В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Thermo Scientific ", США).

Антиоксидантную емкость (АОЕ) сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу определяли по методу [12]. Перед проведением анализа образцы сыворотки крови размораживали на льду и готовили рабочие разведения в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,40, в 120 и 160 раз. Пероксильный радикал генерировался непосредственно в реакционной среде при термическом распаде азосоединения 2,2’-азобис (2-метилпропионамидина) дигидрохлорида (ААРН), инициируемом путем инкубации при 37 °С в течение 10 мин. Для построения калибровочной кривой в качестве стандартного антиоксиданта использовали тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) (Trolox, "Sigma-Aldrich", США). Кинетику убыли свечения флуоресцеина при взаимодействии с пероксильным радикалом в отсутствии антиоксидантов (контроль) и в присутствии тролокса или сыворотки крови в реакционной среде регистрировали в течение 1 ч с интервалом измерений 60 с при температуре 37 °С на фотометре-флуориметре "Synergy 2" ("BioTek", США) в режиме регистрации интенсивности флуоресценции (длина волны возбуждения - 485 нм, длина волны испускания - 528 нм).

АОЕ сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу выражали в мМ эквивалентов тролокса (ТЭ).

Для определения состава кишечной микрофлоры был использован модифицированный метод T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), который основан на ПЦР-амплификации фрагментов генов микробной 16S рДНК, выделении амплифицированных фрагментов из агарозного геля, последующей ферментной обработке рестриктазами и разделении полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК на автоматическом секвенаторе, с последующим анализом полученных T-RFLP-грамм по базам данных с помощью соответствующих программ и комплексным анализом на основе статистических (корреляционный и кластерный), таксономических и экологических подходов.

Выделение тотальной ДНК из кала обследованных детей проводили с использованием набора "Genomic DNA Purification kit" ("Thermo Fisher Scientific", США). Для ПЦР-амплификации использовали флуоресцентно-меченные праймеры: 63F (Cy5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1087R (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT). Ферментативную обработку амплификата проводили с использованием рестриктаз Msp, Hha и Hae (Promega, Madison, Wis.). Разделение полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК проводили в условиях капиллярного электрофореза при помощи секвенатора CEQ8000 ("Beckman Coulter", США) вместе с флуоресцентно-меченным ДНК-маркером. Определение филогенетической принадлежности микроорганизмов проводили с помощью программ и баз данных "Arlequin", "FragSort", "TRAMPR" и "T-REX". Содержание микроорганизмов в образцах кала выражали в условных единицах (усл. ед.).

За условную единицу (усл. ед.) принимали количество рестрикционных фрагментов, принадлежащих к определенной таксономической группе микроорганизмов, соотнесенное с общим количеством полученных фрагментов всех микроорганизмов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ "Microsoft Excel" и "Биостатистика" версия 4.03. Статистически значимыми по двустороннему критерию Стьюдента считали отличия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Использование кисломолочных продуктов позволяет расширить возможности диетотерапии на этапе постепенного расширения рациона питания детям с легкими проявлениями пищевой аллергии.

Кисломолочные продукты назначают, как правило, на этапе диетологической реабилитации, когда происходит снижение чувствительности к белкам коровьего молока, а также при легких проявлениях пищевой аллергии, с учетом того, что при ферментации или сквашивании коровьего молока происходит снижение аллергизирующих свойств его белков. В данной работе оценивали возможность использования в качестве продукта диетического питания разработанный в ФГБНУ ВНИМИ кисломолочный продукт с частичной (20%) заменой молочных белков на гидролизат белков подсырной сыворотки.

Ежедневные осмотр и опрос пациентов не выявили побочных реакций при употреблении продукта. Переносимость и вкусовые качества продукта были хорошими, досрочного прекращения его приема наблюдаемыми детьми не отмечено. Также не отмечено обострения кожного процесса у детей (оценка по индексу SCORAD 23,7±3,08 балла до и 21,3±2,63 балла после приема продукта) и нарастания количества эозинофилов в периферической крови (4,8±1,2% до и 4,9±1,8% после приема продукта).

В настоящее время установлена положительная корреляционная взаимосвязь между наличием у пациентов пищевой аллергии, клиническими проявлениями атопического дерматита и высоким уровнем в сыворотке крови таких пациентов аллергенспецифических антител IgG и IgE [13]. Комплексное исследование аллергенспецифических IgE и IgG антител в сыворотке крови к пищевым аллергенам у детей позволяет оптимизировать диетотерапию и снизить частоту тяжелых проявлений аллергопатологии. Результаты рандомизированного исследования содержания аллергенспецифи- ческих антител IgG и IgE к β-ЛГ коровьего молока в сыворотке крови 10 детей разных возрастных категорий, потреблявших продукт, представлены в табл. 1. По результатам исследования концентрация в сыворотке крови аллергенспецифических IgE антител к белку коровьего молока β-ЛГ колебалась от <0,35 до 2,2 МЕ/мл, что соответствовало классу аллергии от 1+ до 2+.

Из полученных данных видно, что в процессе обследования у всех пациентов в выборке не отмечалось повышения титров аллергенспецифических IgE и IgG антител к β-ЛГ коровьего молока в сыворотке крови после приема продукта. Содержание IgE и IgG оставалось на уровне, детектируемом до приема исследуемого продукта у 7 и 5 детей соответственно (табл. 1). У остальных пациентов отмечено снижение уровня специфических антител после употребления продукта на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты, при этом у пациентов № 2 и 6 было отмечено снижение уровня как IgE, так и IgG специфических антител (см. табл. 1).

Аллергические заболевания нередко связаны с патологией печени, поджелудочной железы, нарушениями белкового, углеводного, жирового обмена и желудочно-кишечными заболеваниями. Так, у пациентов с атопическим дерматитом снижается устойчивость к перекисному окислению липидов и увеличивается продукция активных форм кислорода, что указывает на формирование локального оксидативного стресса у таких пациентов [14].

В связи с этим для восстановления антиоксидантного статуса организма в лечении больных с атопическим дерматитом в комплексе со стандартной терапией указывают также на целесообразность использования антиоксидантных препаратов [15], в результате чего получают дополнительный антигистаминный эффект - стабилизацию мембран базофилов и тучных клеток, что, в свою очередь, приводит к уменьшению выброса из них гистамина.

В ходе данного исследования был проведен анализ влияния продукта при его употреблении на антиоксидантную емкость сыворотки крови пациентов и изменение общего содержания белка. Из представленных на рисунке (а) данных видно, что при введении в рацион пациентов продукта не происходило статистически значимого изменения содержания общего белка в сыворотке, которое, как правило, возрастает при наличии аллергической реакции.

При употреблении продукта наблюдалось статистически значимое (p<0,05) увеличение средней величины АОЕ сыворотки крови пациентов по отношению к пероксильному радикалу на 17,5% (6,84±0,43 мМ ТЭ) по сравнению с ее уровнем до начала испытаний - 5,82±0,35 мМ ТЭ (рисунок б), что говорит о возможной активизации антиоксидантных систем организма. Очевидно, употребление продукта может оказывать позитивное влияние на клиническое благополучие пациентов с атопическим дерматитом.

Поскольку у больных с проявлениями атопического дерматита часто отмечаются дисбактериозы, у пациентов до и после употребления продукта был проведен метагеномный анализ ДНК, экстрагированной из кала. В результате зафиксировано более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей, грибов), в том числе значительное количество некультивируемых. Как видно из представленных в табл. 2 данных, прием продукта сопровождался изменениями в таксономической структуре микробного сообщества в кишечнике пациентов, при этом установлена достоверная положительная связь между увеличением содержания представителей таксономических порядков, к которым принадлежат бифидо- и лактобактерии, в образцах каловых масс пациентов и приемом продукта (r=0,78 и r=0,69 соответственно), а также достоверная отрицательная связь - с содержанием бактерий рода Fusobacterium sp. (r=-0,69), присутствие больших количеств которых отмечается при различных патологических процессах в толстой кишке.

Заключение

В результате проведенного исследования можно прийти к выводу, что разработанный кисломолочный продукт с заменой 20% молочных белков на гидролизат белков подсырной сыворотки хорошо переносится детьми в возрасте от 3 до 16 лет с легкими проявлениями пищевой аллергии - побочных действий продукта и нежелательных явлений за период приема кисломолочного продукта в течение 14 дней ни в одном случае не отмечено.

Клиническое наблюдение за пациентами с легкими проявлениями пищевой аллергии, получавшими продукт на фоне неспецифической гипоаллергенной диеты, показало положительное влияние продукта на состояние и самочувствие детей. Ежедневное потребление продукта способствовало снижению выраженности некоторых проявлений заболевания, связанных с его патогенетическими механизмами. Так, не отмечено изменения уровней общего белка и циркулирующих в сыворотке крови IgE и IgG антител к β-ЛГ, что указывает на отсутствие у данного продукта аллергенных свойств. У пациентов происходило увеличение АОЕ сыворотки крови по отношению к пероксильному радикалу, а также увеличение содержания бифидо- и лактобактерий в содержимом кишечника, что свидетельствует о повышении антиоксидантной защиты организма и нормализации микробиоценоза толстой кишки.

Это дает основания для признания перспективности использования продукта в качестве продукта диетического (профилактического) питания для людей, страдающих пищевой аллергией в стадии ремиссии, в комплексе с неспецифической гипоаллергенной диетой.

Литература

1. Конь И.Я., Сафронова А.И., Коновалова Л.С. Специализированные продукты питания в профилактике и лечении пищевой аллергии у детей первого года жизни // Леч. врач. 2009. № 7. Раздел "Педиатрия". С. 56-59.

2. Сергеев Ю.В. Атопический дерматит. Современные подходы к диагностике, терапии и профилактике // Медицина для всех. 2001. № 2(19). С. 2-8.

3. Федорович Ж.В., Петрова Д.Т. Пищевая аллергия у детей первого года жизни : учеб.-метод. пособие. Минск : Эдит ВВ, 2007. 49 с.

4. Королева О.В., Агаркова Е.Ю., Ботина С.Г., Николаев И.В. и др. Перспективы использования гидролизатов сывороточных белков в технологии кисломолочных продуктов // Мол. пром-сть. 2013. № 7. С. 66-68.

5. Шевелева С.А., Батищева С.Ю., Кузнецова Г.Г., Семенова Н.Н. и др. Изучение состава лактофлоры толстой кишки у больных с пищевой аллергией и синдромом раздраженной кишки // Вопр. питания. 2011. № 2. С. 26-30.

6. Сенцова Т.Б., Гаппарова К.М., Григорьян О.Н., Ворожко И.В. и др. Клинико-иммунологические проявления пищевой непереносимости у больных с ожирением // Вопр. питания. 2012. Т. 81, № 5. С. 83-87.

7. Сафина И.С. Остеопения недоношенных // Вестн. соврем. клин. мед. 2013. Т. 6, № 5. С. 114-119.

8. Пат. 2531164 Рос. Федерация, МПК А23J. Способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки / Королева О.В., Николаев И.В., Федорова Т.В., Агаркова Е.Ю. и др.; заявитель и патентообладатель (и) Государственное научное учреждение Всероссийский научноисследовательский институт молочной промышленности (RU), Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук. № 2013126576 ; заявл. 11.06.2013 ; опубл. 20.10.2014, Бюл. № 29. 15 с.

9. Kahl J., Zalecka A., Ploeger A., Bugel S. et al. Functional food and organic food are competing rather than supporting concepts in Europe // Agriculture. 2012. Vol. 2. P. 316-324.

10. Пат. 2531577 Российская Федерация, МПК А23С. Способ получения кисломолочного продукта с пониженной аллергенностью / Рожкова И.В., Раскошная Т.А., Семенихина В.Ф., Юрова Е.А., Агаркова Е.Ю., Коржов Р.П., Ширшова Т.И., Харитонов В.Д.; заявитель и патентообладатель Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (RU). № 2013148643 ; заявл. 01.11.2013 ; опубл. 20.10.2014, Бюл. № 29. 7 с.

11. Харитонов В.Д. Проблемы и перспективы молочной промышленности XXI века // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. № 11. С. 16-18.

12. Ou B., Hampsch-Woodill M., Prior R.L. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe // J. Agric. Food Chem. 2001. Vol. 49. P. 4619-4626.

13. Переделкина О.В., Ровда Ю.И., Миняйлова Н.Н., Крекова Н.П. и др. Состояние прооксидантной и антиоксидантной систем у детей с атопическим дерматитом на фоне стандартного и комбинированного лечения с применением системной озонотерапии // Сибир. мед. журн. 2013. Т. 28, № 1. С. 74-78.

14. Ревякина В.А., Сенцова Т.Б., Моносова О.Ю., Кувшинова Е.Д. и др. Пищевая аллергия и атопический дерматит у детей. Есть ли взаимосвязь? // Иммунопатология, аллергология, инфектология: Международный научно-практический рецензируемый журнал. 2013. № 4. С. 22-27.

15. Сапунцова С.Г., Лебедько О.А., Ковальский Ю.Г., Флейшман М.Ю. и др. Содержание гистамина и антиоксидантный статус при гиперрегенераторных дерматозах // Дальневосточ. мед. журн. 2014. № 2. С. 55-59.