Геномные, протеомные и метаболомные предикторы развития неалкогольной жировой болезни печени у больных ожирением. Сообщение I

Резюме

Несмотря на достижения современного здравоохранения, профилактика, диагностика и терапия сопутствующих ожирению заболеваний требуют повышения своей эффективности. До сих пор остаются дискуccионными вопросы о диагностической значимости ряда биологически активных молекул, включая геномные, протеомные и метаболомные биомаркеры. В ходе динамического наблюдения 72 больным ожирением (20 мужчинам и 52 женщинам, средний возраст 41,3±2,5 года) проводили ультразвуковую эластографию и стандартное ультразвуковое исследование печени, на основании которого были выделены 2 группы больных. 1-ю группу составили 50 пациентов (индекс массы тела - 43,2±0,6 кг/м2) с ожирением без осложнений, 2-ю - 22 пациента (индекс массы тела - 45,8±2,3 кг/м2) с ожирением, осложненным неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП). Cодержание адипокинов (адипонектина, грелина, резистина, апелина и висфатина), цитокинов (интерлейкина-6, ФНОα), окисленных липопротеинов (oxLDL), молекул адгезии sICAM (soluble intercellular cell adhesion molecule), транспортера жирных кислот L-FABP в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа. Состояние липидного обмена характеризовали определением концентрации общего холестерина, триглицеридов (ТГ), липопротеинов низкой и высокой плотности методом турбидиметрии и спектрофотометрии на автоматическом анализаторе. Кроме того, был проведен анализ полиморфных аллелей ε 2, ε3, ε4 гена ApoE методом полимеразной цепной реакции. Полученные данные позволяют рассматривать снижение содержания адипонектина (0,46-1,71 мкг/мл), увеличение уровня глюкозы (5,57-6,25 ммоль/л), ТГ (2,06-3,94 ммоль/л), ФНОα (5,07-16,68 пг/мл) и концентрации L-FABP (11,62-23,76 пг/мл) в качестве предикторов развития НАЖБП у пациентов с ожирением, а наличие генотипа ε3/ε4 гена ApoE - в качестве неблагоприятного прогностического маркера тяжести течения НАЖБП.

Ключевые слова:ожирение, полиморфизм, ген, метаболизм, неалкогольная жировая болезнь печени

Вопр. питания. 2015. № 4. С. 18-24.

В настоящее время ожирение представляет собой актуальную медико-социальную проблему. По данным Российского мониторинга экономического положения и здоровья населения, в 1994 г. среднее значение индекса массы тела (ИМТ) среди взрослого населения России составило 23,81 кг/м2. К 2010 г. этот показатель вырос до 24,53 кг/м2 [1]. Экономические исследования, проведенные с 1990 по 2009 г., показали, что затраты на лечение ожирения и сопутствующих ему заболеваний составляют 0,7 и 2,8% от общих расходов на здравоохранение [24]. Ожирение - доказанный фактор риска развития инсулинорезистентности, сахарного диабета 2 типа, заболеваний сердечно-сосудистой системы, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и некоторых видов онкологических заболеваний [2, 5].

Несмотря на достижения современного здравоохранения, профилактика, диагностика и терапия сопутствующих ожирению заболеваний требуют качественного повышения своей эффективности.

До сих пор остаются дискуссионными вопросы о диагностической значимости ряда биологически активных молекул, включая геномные, протеомные и метаболомные биомаркеры, при развитии ожирения, заболеваний сердечно-сосудистой системы, печени, сахарного диабета 2 типа и др. [6, 9, 10].

НАЖБП, распространенная с частотой 20-30% среди больных ожирением, варьирует от стеатоза до неалкогольного стеатогепатита и цирроза печени [12]. НАЖБП является многофакторным заболеванием со сложными патофизиологическими механизмами.

Результаты многочисленных исследований последних лет позволили выявить ряд факторов, инициирующих возникновение НАЖБП, таких как инсулинорезистентность и дислипидемия, и сопровождающихся нарушениями механизмов супрессии липолиза и увеличением концентрации свободных жирных кислот [7, 11, 15, 20]. Наряду с этими процессами при НАЖБП развивается окислительный стресс, сопровождающийся формированием неспецифической воспалительной реакции, который опосредует развитие фиброза печени [3, 7, 8, 14, 16, 18, 23].

Актуальность выявления предикторов НАЖБП при ожирении обусловлена тем, что аккумуляция липидов в гепатоцитах может подвергаться регрессии при исчезновении патогенетических факторов. Большинство современных исследований рассматривают в качестве триггеров НАЖБП генетические, биохимические и иммунологические биомаркеры, участвующие в патогенезе заболевания [4, 10, 17].

Важной задачей современной медицины является оценка риска развития НАЖБП у больных ожирением - носителей различных полиморфных вариаций генов, продукты экспрессии которых играют существенную роль в метаболизме и транспорте липидов в гепатоциты. Особый инте- рес представляют ген аполипопротеина Е (ApoE), продукт которого участвует в обмене липидных фракций между плазмой крови и клетками печени, а также ген липопротеинлипазы (LPL), регулирующий уровень липидов в крови.

Целью исследования стало выявление геномных, протеомных и метаболомных предикторов развития НАЖБП у больных ожирением.

Материал и методы

Обследованы 72 пациента с ожирением в возрасте от 18 до 66 лет (20 мужчин и 52 женщины, средний возраст которых составил 41,3±2,5 лет), находившихся на лечении в отделении профилактической и реабилитационной диетологии ФГБНУ "НИИ питания". Всем больным проводили физикальное и антропометрическое обследование: определяли рост и массу тела с последующим расчетом ИМТ.

В ходе динамического наблюдения на базе отделения гастроэнтерологии и гепатологии ФГБНУ "НИИ питания" больным ожирением проводили ультразвуковую эластографию и стандартное ультразвуковое исследование печени с использованием приборов "Echosenes" и "ProSound 5500 SV" ("Aloka", Япония).

На основании полученных результатов были выделены 2 группы больных: 1-ю составили 50 пациентов с ожирением без осложнений (ИМТ 43,2±0,6 кг/м2), 2-ю - 22 пациента с ожирением, осложненным НАЖБП (ИМТ 45,8±2,3 кг/м2).

Анализ полиморфных локусов Arg158Cys (c.526C>T) и Cys112Arg (c.388T>C) гена ApoE проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании детектирующего амплификатора "ДТ-96", амплификатора "Терцик" и детектора "Джин" ("ДНК-Технология", РФ) с наборами для ДНК-диагностики, разработанными ФГУП "ГосНИИгенетика" (РФ).

Определение содержания адипокинов (адипонектина, грелина, резистина, апелина и висфатина), цитокинов (интерлейкин-6, ФНОα), окисленных липопротеинов (oxLDL), молекул адгезии sICAM (soluble intercellular cell adhesion molecule), транспортера жирных кислот L-FABP в сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческих наборов ("BioVender R&D", Чехия; "Bio Source International Inc.", Бельгия; "Invitrogen", "Peninsula Laboratories LLC", "Phoenix Pharmaceuticals Inc." и "RayBio", США; "Cusabio Biotech LTD", Китай).

Для учета результатов и построения калибровочной кривой использовали вертикальный спектрофотометр "Sunrise" ("Tecan", Австрия) с прилагаемым программным обеспечением.

Состояние липидного обмена оценивали путем определения концентрации общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), липопротеинов низкой и высокой плотности (ЛПНП и ЛПВП) методом турбидиметрии и спектрофотометрии на автоматическом анализаторе "KoneLab60i" ("Thermo Electron", Финляндия).

Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета статистических программ SPSS 14 (США). При анализе определяли средние значения признака (M), стандартные ошибки среднего (m), среднеквадратичные отклонения (σ), а также медиану (Me), 25% и 75% квартили (Q1 и Q3). Для сравнения данных (после проверки на нормальное распределение) использовали tкритерий Стъюдента для 2 независимых выборок.

Для сравнения непараметрических данных применяли критерий Манна-Уитни (для 2 групп) для несвязанных совокупностей. Различия групп расценивали как статистически значимые при р<0,05 или высокозначимые при р<0,01. Достоверность различий в частоте встречаемости генов в группах больных оценивали с помощью критерия Пирсона с достоверностью 95%.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования распределения частот полиморфных маркеров Cys112Arg (c.388T>C) и Arg158Cys (c.526C>T) гена ApoE у пациентов с ожирением и НАЖБП по сравнению с группой больных ожирением без осложнений представлены в табл. 1.

Сравнительный анализ распределения генотипов и аллелей полиморфного маркера Cys112Arg (аллель С) у больных ожирением и НАЖБП не показал статистически достоверных отличий по сравнению с группой больных с неосложненным ожирением (p>0,05).

При изучении полиморфизма Cys112Arg гена ApoE (аллель С) в выборке пациентов с ожирением и НАЖБП, а также в группе с неосложненным ожирением не были выявлены носители гомозиготного генотипа заменить на С/С.

Частота встречаемости полиморфного маркера Arg158Cys гена ApoE (аллель Т) была в 1,3 раза выше у больных с ожирением и НАЖБП, чем в группе с неосложненным ожирением. Однако выявленные различия между группами не достигли уровня статистической значимости. Таким образом, можно заключить, что носительство полиморфных маркеров Cys112Arg и Arg158Cys гена ApoE не оказывает влияния на риск развития НАЖБП при ожирении.

Как известно, аполипопротеин Е может быть представлен в виде трех изоформ (АпoE2, АпoE3 и АпoE4), транскрипция которых определяется комбинацией различных полиморфных аллелей гена ApoE [18].

Так, полиморфизм ε3 кодирует белок, характеризующийся наличием цистеина в положении 112 и аргинина в положении 158 (cys112, arg158), полиморфизм ε2 кодирует белок, имеющий цистеин как в положении 112, так и 158 (cys112, cys158), а полиморфизм ε4 кодирует полипептид, содержащий аргинин в положении и 112, и 158 (arg112, arg158).

Анализ распределения частот полиморфизмов ε2, ε3 и ε4 гена ApoE у пациентов с ожирением и НАЖБП не показал статистически достоверных отличий по сравнению с группой больных с неосложненным течением заболевания (табл. 2).

При исследовании уровней адипокинов, цитокинов, показателей липидного и углеводного обмена у больных ожирением, осложненным НАЖБП установлено, что у пациентов с ожирением и НАЖБП было достоверно выше содержание глюкозы (в 1,1 раза), ТГ (в 1,7 раза), L-FABP (более чем в 1,5 раза), ФНОα (более чем в 2,5 раза), а уровень адипонектина был ниже, чем в группе сравнения (более чем в 3 раза) (табл. 3). Полученные данные позволяют рассматривать изменения указанных биомаркеров в качестве предикторов развития НАЖБП у больных ожирением.

Результаты исследования протеомных и метаболомных маркеров у пациентов с ожирением и НАЖБП при различных полиморфных вариантах гена ApoE представлены в табл. 4.

Проведенное исследование показало, что у пациентов с ожирением и НАЖБП, носителей полиморфного генотипа ε2/ε3 и ε2/ε2 гена ApoE, отмечалось сниженное содержание ТГ по сравнению с больными - носителями генотипа "дикого типа" ε3/ε3.

Особый интерес представляют результаты изучения протеомных и метаболомных маркеров у пациентов с ожирением и НАЖБП с генотипом ε3/ε4 гена ApoE. Было обнаружено снижение уровней ТГ (в 2,4 раза), увеличение содержания ФНОα (в 1,5 раза) и L-FABP (почти в 2 раза). Возрастание концентрации L-FABP указывает, что в гепатоциты транспортируется высокая концентрация жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза ТГ, что может объяснять снижение их уровня в крови.

Поскольку наиболее выраженные изменения протеомных и метаболомных маркеров у паци- ентов с ожирением, осложненным НАЖБП, были выявлены у носителей генотипа ε3/ε4 гена ApoE, данный полиморфизм можно рассматривать в качестве маркера неблагоприятного течения НАЖБП при ожирении (см. рисунок).

Как известно, перенос жирных кислот в гепатоциты осуществляется путем пассивной диффузии, а также специфическими мембранными транспортерами жирных кислот FATР (fatty acid transport protein). Внутри гепатоцита транспорт свободных жирных кислот осуществляется белками-транспортерами L-FABP (liver-specific fatty acid-binding protein), активность которых при НАЖБП повышается. Избыточное поступление и накопление в гепатоцитах жирных кислот является доказанным фактором риска повреждения и стеатоза печени. В крови здоровых доноров содержание L-FABP составляет около 12 нг/мл [19, 21, 22]. Таким образом, достоверное увеличение концентрации L-FABP опосредованно указывает на интенсификацию транспорта свободных жирных кислот в гепатоциты.

Полученные данные позволяют рассматривать увеличение концентрации белка - транспортера жирных кислот L-FABP и ФНОα при нормальном содержании глюкозы и ТГ в качестве предикторов развития НАЖБП у больных ожирением, а наличие генотипа ε3/ε4 гена ApoE - в качестве неблагоприятного прогностического маркера тяжести течения НАЖБП.

В связи с этим представляется актуальным использование исследований полиморфизма генов ApoE с целью применения результатов для проведения эффективной диетотерапии и своевременной профилактики сопутствующих ожирению заболеваний печени.

Литература

1. Астафьева Н.Г., Гамова И.В., Удовиченко Е.Н. и др. Ожирение и бронхиальная астма // Леч. врач. 2014. № 5. С. 100-106.

2. Богданов А.Р., Дербенева С.А., Погожева А.В. и др. Оценка эффективности диетотерапии у пациентов с различной степенью ожирения // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 6. С. 32-40.

3. Бутрова С.А., Дзгоева Ф.Х. Современная терапия ожирения // Рос. мед. журн. 2005. Т. 13, № 2. С. 96-99.

4. Вовк Е.И. Лечение неалкогольной жировой болезни печени в практике терапевта: что? где? когда? // Рос. мед. журн. 2011. № 17. С. 1038-1046.

5. Дедов И.И., Мельниченко Г.А. Ожирение: этиология, патогенез, клинические аспекты // Руководство для врачей. М. : Медицинское информационное агентство, 2004. 456 с.

6. Дмитриев А.Н., Перминова Л.Р. Критерий диагностики досимптоматической (преморбидной) стадии метаболического синдрома // Ожирение и метаболизм. 2014. № 4. С. 24-28.

7. Зиновьева Е.Н., Мехтиев С.Н., Соколовский С.В. Эндотелиальная дисфункция как фактор прогрессирования неалкогольного стеатогепатита. Терапевтические подходы // Гастроэнтерология. 2011. № 1. С. 3-9.

8. Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О. Неалкогольный стеатогепатит // Рос. мед. журн. Болезни органов пищеварения. 2000. Т. 2. С. 41-45.

9. Погожева А.В., Батурин А.К., Тутельян В.А. и др. Изучение полиморфизма rs9939609 гена FT0 у лиц с избыточной массой тела и ожирением // Вопр. питания. 2011. № 3. С. 13-17.

10. Сорокина Е.Ю., Солнцева Т.Н., Раджабкадиев Р.М. и др. Идентификация генетических полиморфизмов, ассоциированных с избыточной массой тела, у спортсменов зимних видов спорта // Вопр. питания. 2013. № 6. С. 58-61.

11. Шульпекова Ю.О. Патогенетическое значение липидов при неалкогольной жировой болезни печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2012. Т. 22, № 1. С. 45-56.

12. Bellentani S., ScaglioniF., MarinoM. et al. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease // Dig. Dis. Sci. 2010. Vol. 28. P. 155-161.

13. Choromanska B., Mysliwiec P., Dadan J. et al. The clinical significance of fatty acid binding proteins // Postepy Hig. Med. Dosw. 2011. Vol. 65. P. 759-763.

14. Conlon A., Beasley J.M., Aebersold K. et al. Nutritional Management of Insulin Resistance in Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) // Nutrients. 2013. Vol. 5, N 10. P. 4093-4114.

15. Farrell G.C., van Rooyen D., Gan L. et al. Nash is an inflammatory disorder: Pathogenic, prognostic and therapeutic implications // Gut Liver J. 2012. N 6. P. 149-171.

16. Gaggini M., Morelli M., Buzzigoli E. et al. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its connection with insulin resistance, dyslipidemia, atherosclerosis and coronary heart disease // Nutrients. 2013. Vol. 5. P. 1544-1560.

17. Johnson A.M., Olefsky J.M. The origins and drivers of insulin resistance // Cell. 2013. Vol. 152. P. 673-684.

18. Lopez. M.F., Krastins B., Ning M. The role of apolipoprotein E in neurodegeneration and cardiovascular disease // Expert Rev. Proteomics. 2014. Vol. 11, N 3. P. 371-381.

19. Morariu A.M., Loef B.G., Aarts L.P. et al. Dexamethasone: benefit and prejudice for patients undergoing on-pump coronary artery bypass grafting: a study on myocardial, pulmonary, renal, intestinal, and hepatic injury // Chest. 2005. Vol. 128. P. 2677-2687.

20. Ozenirler S., Degertekin C.K., Erkan G. et al. Serum liver fatty acid binding protein shows good correlation with liver histology in NASH // Hepatogastroenterology. 2013. Vol. 60, N 125. P. 1095-1100.

21. Pelsers M.M. Fatty acid-binding proteins as plasma markers of tissue injury // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 2008. Vol. 241. P. 73-77.

22. Pelsers M.M., Morovat A., Alexander G.J. et al. Liver fatty acid-binding protein as a sensitive serum marker of acute hepatocellular damage in liver transplant recipients // Clin. Chem. 2002. Vol. 48. P. 2055-2057.

23. Smith B.W., Adams L.A. Nonalcoholic fatty liver disease and diabetes mellitus: Pathogenesis and treatment// Nat. Rev. Endocrinol. 2011. Vol. 7. P. 456-465.

24. Withrow D., Alter D.A. The economic burden of obesity worldwide: a systematic review of the direct costs of obesity // Obes. Rev. 2011. Vol. 12. P. 131-134.