Токсичность свинца при его совместном введении с наноструктурным диоксидом кремния

Резюме

Наночастицы (НЧ), присутствующие в составе объектов окружающей среды и в пищевых продуктах вместе с контаминантами традиционной природы, способны в определенных условиях усиливать их токсическое действие. Целью работы стало изучение влияния НЧ диоксида кремния (SiO2), широко используемых в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, в составе биологически активных добавок и др., на накопление и проявление токсического действия свинца (Pb) при совместном введении крысам в подостром эксперименте. Крысы были разделены на 6 групп. Животным 1-й (контрольной) группы вводили внутрижелудочно через зонд дистиллированную воду. Крысы 2-й и 3-й групп получали дисперсию НЧ SiO2 с размером первичных частиц 5-30 нм в дозах 1 и 100 мг на 1 кг массы тела соответственно, 4-й группы - раствор ацетата Pb в дозе 20 мг на 1 кг массы тела (в расчете на Pb), 5-й и 6-й групп - раствор ацетата Pb и дисперсию НЧ SiO2 в дозах 1 и 100 мг на 1 кг массы тела соответственно на протяжении 22 дней внутрижелудочно через зонд. Определяли массу тела и внутренних органов, стандартные гематологические показатели, содержание белка, креатинина, мочевой кислоты, альбумина, глюкозы и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и щелочной фосфатазы в сыворотке крови, экскрецию 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) с мочой. Апоптоз гепатоцитов изучали методом проточной цитофлуориметрии. Содержание Pb, кадмия (Cd), мышьяка (As), селена (Se), железа (Fe), цинка (Zn), меди (Cu), хрома (Cr), марганца (Mn), алюминия (Al) и кобальта (Co) в органах (печень, почки, головной мозг) определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой. В результате показано, что введение Pb, но не НЧ приводило к достоверному увеличению массы почек и семенников. Экскреция 5-АЛК с мочой у животных 4-6-й групп, получавших ацетат Pb, многократно и достоверно (р<0,001) увеличивалась по сравнению с животными 1-3-й групп; при этом какая-либо зависимость этого показателя от дозы НЧ SiO2 отсутствовала (р>0,05). Введение НЧ SiO2 приводило к дозозависимому увеличению содержания гемоглобина в крови, влияние Pb на этот показатель имело противоположную направленность. На фоне сочетанной интоксикации Pb и НЧ отмечены изменения в уровнях глюкозы и альбумина сыворот- ки крови. Какого-либо усиления неблагоприятного влияния Pb на гематологические показатели и апоптоз гепатоцитов при его совместном введении с НЧ выявлено не было. При введении Pb наблюдалось его накопление в печени, почках и головном мозге, которое не усиливалось при сочетанном воздействии НЧ (р>0,05). Среднее содержание Cd, As, Se, Zn, Cu, Al, Cr, Mn, Co в биосубстратах у животных, получавших и не получавших Pb, было аналогично, и не показало зависимости от дозы НЧ. Единственным предположительно неблагоприятным воздействием на микроэлементный профиль явилось почти двукратное достоверное увеличение содержания в ткани печени Al у животных, получавших Pb и НЧ SiO2 в наибольшей дозе (0,859±0,085 против 0,468±0,065 мг/кг в 4-й группе, р<0,05). В отсутствие экспозиции Pb подобный эффект не наблюдался. Таким образом, не получено однозначных свидетельств потенцирования неблагоприятных эффектов Pb в случае его совместного поступления с НЧ SiO2. Более того, для некоторых показателей, таких, как прибавка массы тела, активность АСТ сыворотки крови, уровень гемоглобина, показатели эритроцитов, введение НЧ SiO2 в определенной степени отменяло некоторые неблагоприятные эффекты Pb, что, возможно, было связано с эффектами его энтеросорбции.

Ключевые слова:наночастицы, диоксид кремния, свинец, крысы, токсичность, микроэлементы, масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой

Вопр. питания. - 2015. - № 2. - С. 10-18.

Наночастицы (НЧ) и наноматериалы (НМ) вследствие своей высокой дисперсности обладают комплексом физико-химических свойств, отличающих их от аналогичных химических веществ в виде протяженных фаз или макроскопических дисперсий. Ввиду этого оценка потенциальных рисков, создаваемых НЧ и НМ для здоровья человека, представляет собой важную задачу [3, 4, 12].

При этом необходимо иметь в виду, что НЧ присутствуют в составе объектов окружающей среды и в пищевых продуктах в комплексном химическом окружении, в том числе вместе с токсикантами традиционной природы. Известная для НЧ и НМ способность усиливать транспорт химических веществ и лекарственных препаратов в клетки и через барьеры организма [13, 14] делает актуальной постановку вопроса о возможном потенцировании токсического действия химических контаминантов пищи при их совместном поступлении в организм. Целью работы явилось изучение влияния НЧ диоксида кремния (НЧ SiO2), широко используемого в качестве пищевой добавки, на накопление и проявление токсического действия Pb при совместном многократном внутрижелудочном введении крысам в подостром эксперименте.

Материал и методы

Эксперимент проведен на 62 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 113-157 г, полученных из питомника "Столбовая". Крыс содержали в пластмассовых клетках по 3-4 особи и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом согласно МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали. Условия содержания и работы с животными соответствовали действующим российским требованиям (приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики").

Крысы были разделены на 6 групп по 10-11 особей в каждой. Животным 1-й (контрольной) группы вводили внутрижелудочно через зонд дистиллированную воду из расчета 1 мл на 100 г массы тела животного. Крысы 2-й и 3-й групп получали водную дисперсию НЧ SiO2 в дозах 1 и 100 мг/кг массы тела соответственно. Крысам 4-й группы вводили внутрижелудочно раствор ацетата Pb в дозе 20 мг/кг массы тела (в расчете на Pb) в целях воспроизведения модели свинцовой интоксикации [6], а крысам 5-й и 6-й групп на фоне введения ацетата Pb в той же дозе дополнительно вводили дисперсию НЧ SiO2 в дозах соответственно 1 и 100 мг/кг массы тела. Внутрижелудочные введения указанных препаратов осуществляли ежедневно в фиксированное время.

В работе использован коммерческий препарат высокодисперсного аморфного SiO2 "Орисил 300" (по ТУ 24.1-31695418-002-2003) с удельной площадью поверхности образца 300 м2/г (ООО "Силика", Московская обл., г. Долгопрудный).

Согласно исследованию методами электронной и атомно-силовой микроскопии [2], образец был представлен первичными НЧ SiO2 диаметром от 5 до 30 нм, агрегированными в рыхлые кластеры субмикронного размера. После ультразвуковой диспергации (44 кГц, 2 Вт/мл, 5 мин при температуре 2-4 оС) средний гидродинамический диаметр частиц в водной дисперсии, по данным динамического лазерного светорассеяния, составлял 56,6±32,1 нм (M±S.D.). В качестве модельного токсиканта использовали Pb уксуснокислый трехводный (далее - ацетат Pb) х.ч. (ООО "Хромресурс", РФ), соответствующий ГОСТ 1027-67.

В ходе эксперимента у крыс всех групп ежедневно определяли массу тела на электронных весах с точностью ±0,5 г. На 20-й день эксперимента проводили сбор суточной мочи, в которой определяли 5-аминолевуленовую кислоту (5-АЛК) спектрофотометрическим методом с использованием наборов фирмы "Biosystems S.A" (Испания).

На 23-й день под эфирной анестезией у животных осуществляли отбор органов и тканей в соответствии с МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных". Определение массы внутренних органов, стандартных биохимических и гематологических показателей проводили, как описано ранее [10]. Апоптоз гепатоцитов изучали методом проточной цитофлуориметрии с окрашиванием FITC-аннексином V (AnV-FITC) и 7-аминоактиномицином (7-AAD). Принцип метода и процедура анализа изложены в работах [7-9]. Содержание Pb, кадмия (Cd), мышьяка (As), селена (Se), железа (Fe), цинка (Zn), меди (Cu), хрома (Cr), марганца (Mn), алюминия (Al) и кобальта (Co) в органах (печень, почки, головной мозг) определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе серии 7700х ("Agilent Technologies", Япония).

Минерализацию биологических образцов осуществляли концентрированной азотной кислотой и концентрированной перекисью водорода в соотношении 5:1 в автоматизированной микроволновой системе пробоподготовки "TOPWAVE" ("Analytic Jena", Германия).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета SPSS 20.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни и однофакторному дисперсионному анализу ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Состояние животных, масса тела, масса внутренних органов

На протяжении 22 дней внутрижелудочного введения исследуемых препаратов наблюдали гибель 2 крыс в 3-й группе, 1 - в 4-й группе, 1 в 5-й группе и 4 - в 6-й группе. Вскрытие всех павших животных показало, что гибель наступила от двусторонней пневмонии, которая развивалась, как можно предположить, вследствие случайной аспирации вводимой через зонд суспензии, содержащей НЧ и ацетат свинца. Остальные животные всех опытных групп по своему внешнему виду, состоянию шерстяного покрова и слизистых оболочек, двигательной активности, поведению не отличались от животных контрольной группы. У животных 3-6-й групп наблюдалось некоторое снижение прироста массы тела по сравнению с животными контрольной группы, однако только у животных 6-й группы, которым вводили ацетат Pb и наноструктурный SiO2, эти различия были достоверными (табл. 1). Однофакторный дисперсионный анализ показал, что причиной снижения прибавки массы тела у животных 4-6-й групп является введение Pb (p<0,05, ANOVA), но не НЧ SiO2. В то же время у животных 3-й группы, получавших только НЧ SiO2 в дозе 100 мг/кг массы тела, также наблюдалось снижение прироста массы тела, которое было более выраженным у животных 6-й группы, получавших НЧ SiO2 в той же дозе в сочетании со Pb. Относительная масса почек и семенников, составлявшая у животных контрольной группы соответственно 0,62±0,02 и 0,94±0,03%, достоверно увеличивалась у животных 4-й группы, получавших Pb, до 0,77±0,02 и 1,07±0,04% и у животных, получавших Pb с НЧ SiO2 в обеих дозах (0,75±0,02 и 1,07±0,04% в группе 5; 0,76±0,02 и 1,15±0,05% в группе 6; р1-4;1-5;1-6<0,01). Однофакторный дисперсионный анализ указал на достоверное (р<0,01) влияние на эти показатели Pb, но не НЧ SiO2. Достоверных дозозависимых изменений в относительной массе остальных внутренних органов животных всех групп не отмечено.

Показатели порфиринового обмена

Экскреция 5-АЛК с мочой у животных 4-6-й групп, получавших ацетат Pb, многократно и достоверно (р1-4;1-5;1-6<0,001) увеличивалась по сравнению с животными 1-й группы (рис. 1а). При этом какаялибо зависимость этого показателя от дозы НЧ SiO2 в группах 4-6 отсутствовала (р4-5;4-6>0,05).

Однофакторный дисперсионный анализ указал на отсутствие влияния на экскрецию 5-АЛК перорально вводимых НЧ SiO2. Введение только НЧ SiO2 приводило к достоверному (р1-3<0,05) увеличению на 15% содержания Hb в крови у животных 3-й группы (рис. 1б). У крыс 4-й группы, получавших Pb, отмечалось достоверное (р1-4<0,05) снижение этого показателя по сравнению с 1-й контрольной группой; при этом дополнительное введение крысам, получавшим Pb, диоксида кремния в обеих дозах (5-я и 6-я группы) возвращало уровень гемоглобина практически к значениям у животных 1-й контрольной группы (р1-5;1-6>0,05).

Биохимические показатели крови

Концентрации белка, креатинина, мочевой кислоты и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови у крыс опытных групп достоверно не отличались от таковых у животных контрольной группы (табл. 2).

Активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови была достоверно выше у животных 4-й и 5-й групп по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о проявлении токсического действия Pb. Однако у животных 6-й группы, получавших Pb и максимальную дозу НЧ SiO2, этот показатель не отличался от такового у животных контрольной группы. Концент- рация альбумина в сыворотке крови у животных 5-й группы не отличалась от таковой у животных 1-й группы, но была достоверно выше, чем у животных 4-й группы. Концентрация глюкозы в крови у животных 6-й группы также была достоверно выше, чем у животных 4-й группы, получавших только Pb.

Гематологические показатели, апоптоз клеток печени

Исследование гематологических показателей выявило ряд неблагоприятных изменений у животных 4-й группы, получавших Pb, по сравнению с контрольной группой животных. Так, у них обнаружено снижение показателя гематокрита до 37,680,51% (40,820,80% у крыс контрольной группы), среднего объема эритроцита до 53,001,00 мм3 (56,780,86 мм3 у крыс контрольной группы), среднего содержания гемоглобина в эритроците до 17,990,37 пг (19,840,31 пг у крыс контрольной группы), средней концентрации гемоглобина в эритроците до 338,631,77 г/дл (349,331,57 г/дл у крыс контрольной группы) (р1-4<0,05 во всех случаях), что свидетельствовало о проявлении токсического действия Pb. Введение только НЧ SiO2 (крысы 2-й и 3-й групп) не оказывало никакого влияния на эти показатели по сравнению с животными контрольной группы. Также не выявлены изменения в отношении изученных показателей у животных, получавших Pb и НЧ SiO2 (крысы 5-й и 6-й групп), по сравнению с животными 4-й группы (р4-5;4-6>0,05 по всем перечисленным параметрам), за исключением показателя гематокрита у крыс 6-й группы, у которых показатель гематокрита (41,100,55%) не отличался от такового у животных контрольной группы. Во всяком случае какого-либо усиления неблагоприятного влияния Pb на гематологические показатели при его сочетанном действии с НЧ не выявлено. Определение лейкоцитарной формулы крови (количество лейкоцитов, содержание нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов) не выявило каких-либо эффектов как со стороны Pb, так и совместного введения Pb и НЧ SiO2 при данных дозах и длительности воздействия.

В то же время введение животным Pb приводило к достоверному увеличению (на 16-22%) количества тромбоцитов (p1-4;1-5;1-6<0,05), при этом влияние НЧ SiO2 на этот показатель отсутствовало.

Таким образом, в ходе гематологических исследований не обнаружено ни одного признака того, что наноструктурный SiO2 каким-то образом усиливал действие Pb. Исследование апоптоза клеток печени показало отсутствие влияния на количество живых гепатоцитов, клеток на ранней и поздней стадии апоптоза и некротических клеток введения как Pb, так и НЧ SiO2 в использованных дозах и при данных сроках воздействия.

Распределение элементов по органам

При введении Pb наблюдается его существенное накопление в печени, почках и головном мозге (табл. 3). Одновременное введение Pb и НЧ SiO2 не приводит к дальнейшему его накоплению во всех изученных органах (р4-5;4-6>0,05). Таким образом, введение исследуемого НМ не оказывает влияния на бионакопление Pb в условиях данного эксперимента.

Профили распределения других изученных микроэлементов в печени крыс представлены на рис. 2. Как следует из полученных данных, содержание Cd, As, Se, Zn, Cu, Al, Cr, Mn, Co в целом аналогично у животных, получавших и не получавших Pb, и не показывает зависимости от дозы введенного наноразмерного SiO2.

Во всяком случае введение НЧ SiO2 не приводит к усилению накопления таких токсичных элементов, как Cd и As, и к снижению тканевых запасов эссенциальных микроэлементов Se, Cu, Cr и Co как при наличии, так и в отсутствие свинцовой интоксикации. Что же касается уровней Zn и Mn, то их содержание в ткани печени оказывается даже достоверно выше (хотя и незначительно по абсолютной величине) у животных 3-й группы, получавших наибольшую дозу НЧ SiO2 по сравнению с контрольной группой (р1-3<0,05). Единственным предположительно неблагоприятным воздействием на микроэлементный профиль является почти двукратное достоверное увеличение содержания в ткани печени Al у животных, получавших Pb и НЧ SiO2 в наибольшей дозе (4-я группа - 0,468±0,065 мг/кг; 6-я группа - 0,859±0,085 мг/кг; р4-6<0,05).

В отсутствие экспозиции Pb подобный эффект не наблюдался.

При изучении распределения эссенциальных и токсичных элементов в ткани почек и головного мозга крыс 1-6-й групп была выявлена в целом аналогичная картина (данные не показаны), состоящая в отсутствии дозозависимых изменений в уровнях микроэлементов при разных дозах использования НЧ SiO2 как в условиях сочетанного действия Pb, так и без него. При этом НЧ SiO2 не оказывали достоверного влияния (р>0,05) на накопление Al в ткани головного мозга.

Обсуждение

В литературе обсуждаются возможные риски потенцирования токсического действия химических контаминантов окружающей среды, связанные со способностью искусственных минеральных НЧ выступать в роли своеобразных "транспортеров" этих контаминантов во внутреннюю среду организма. Так, в работах [16, 18] показано усиление бионакопления и токсичности ионов Cd и арсенита для рыб при воздействии НЧ диоксида титана (TiO2). В исследовании [11] НЧ TiO2 усиливали поглощение мононуклеарными фагоцитами человека бактериального липополисахарида, присоединенного к поверхности частиц через кальциевые мостики, результатом чего было развитие мощного провоспалительного ответа. Авторы работ связывают выявленные эффекты со способностью НЧ ввиду их малого размера проникать через биологические мембраны в клетки, выступая тем самым в роли "транспортеров" адсорбированных на них токсикантов химической и биологической природы. Однако для высших животных и человека, при естественных путях поступления НЧ в организм (в первую очередь через желудочно-кишечный тракт) данная возможность пока постулируется только теоретически [3, 4, 12].

В предыдущей работе [10] нами было изучено влияние стандартизованных препаратов НЧ TiO2 и НЧ SiO2 на накопление и токсичность Pb при его внутрижелудочном введении крысам. При этом не получено доказательств увеличения всасывания Pb в желудочно-кишечном тракте за счет его абсорбции на НЧ, а наблюдаемые эффекты были, скорее всего, связаны как с токсичностью самого Pb, так и с токсичностью (в изученных дозах) НЧ TiO2, но не НЧ SiO2. Использованный в работе [10] образец НЧ SiO2 имел меньшую удельную площадь поверхности (220 м2/г) и, следовательно, меньшую степень дисперсности, чем примененный в данном исследовании наноструктурный SiO2 с удельной площадью поверхности 300 м2/г. Полученные данные показывают, что и в данном случае не получено однозначных свидетельств потенцирования неблагоприятных эффектов Pb в случае его совместного поступления с НЧ SiO2. Более того, для ряда показателей, таких, как активность АСТ сыворотки крови, содержание гемоглобина, некоторые гематологические показатели эритроцитов, введение НЧ SiO2 в определенной степени отменяло неблагоприятные эффекты Pb. Увеличение уровня глюкозы под воздействием НЧ в условиях свинцовой интоксикации было небольшим по абсолютной величине и, по-видимому, не являлось биологически значимым. Однако обнаруженный эффект требует подтверждения в дальнейших исследованиях. Увеличение накопления Al в печени крыс при сочетанном действии НЧ SiO2 и Pb в настоящее время не вполне понятно и требует дополнительного исследования. При этом важно подчеркнуть, что в мозге животных, т.е. в органе, по современным представлениям являющемся основной мишенью токсического действия Al [15], этот эффект не наблюдался.

Прямые свидетельства транспорта НЧ SiO2 через стенку кишки млекопитающих в доступной литературе отсутствуют, однако можно предположить, что по аналогии со сходным по физикохимическим свойствам и размеру частиц наноструктурным TiO2 [1, 5] всасываемость НЧ SiO2 является, по-видимому, весьма низкой. С учетом высокой сорбционной способности данного НМ это может привести к эффекту энтеросорбции и, следовательно, к замедлению скорости всасывания Pb в кишечнике и соответствующему уменьшению его токсического действия. Аналогичный c точки зрения физикохимии процесса эффект наблюдали авторы работы [17], в которой показано снижение накопления ионов Cd в клетках зеленых водорослей вследствие его адсорбции на НЧ TiO2. Однако непосредственный перенос этих данных на организм высших животных и человека невозможен, и исследование влияния НЧ различных типов на кишечную абсорбцию и токсичность других химических контаминантов должно быть продолжено.

Литература

1. Гмошинский И.В., Хотимченко С.А., Попов В.О. и др. Наноматериалы и нанотехнологии: методы анализа и контроля // Успехи химии. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 48-76.

2. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. Параметры острой токсичности // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 2. - С. 42-49.

3. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

4. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. О концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 4-8.

5. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.

6. Патент Российской Федерации № 2286607 "Способ моделирования хронической токсической нефропатии".

7. Распопов Р.В., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. Характеристика биодоступности наночастиц нульвалентного селена у крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 36-41.

8. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

9. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Бекетова Н.А. и др. Влияние пищевых волокон на апоптоз гепатоцитов крыс с алиментарной поливитаминной недостаточностью // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 33-40.

10. Шумакова А.А., Трушина Э.Н., Мустафина О.К. и др. Влияние наночастиц диоксида титана и диоксида кремния на накопление и токсичность свинца в эксперименте при их внутрижелудочном введении // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 2. - С. 57-63.