Влияние полигиповитаминоза на проявление безусловного рефлекса и обучаемость у растущих крыс

РезюмеЦелью работы было исследовать влияние сочетанной недостаточности всех витаминов у растущих крыс на проявление безусловного рефлекса и способность к обучению в ответ на воздействие электрическим током. В эксперимент были отобраны 20 из 46 протестированных крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 53,4±1,2 г (45,5-62,0 г), латентный период перехода которых из освещенного в темный отсек камеры не превысил 60 с. Крысы были рандомизированно по длительности латентного периода и массе тела разделены на 2 группы: контрольную и опытную. В течение 23 сут крысы контрольной группы получали полноценный полусинтетический рацион. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в 5 раз количества витаминной смеси в корме и полным исключением из нее витамина Е. На 12-е сутки проводили второй этап тестирования, в ходе которого при переходе в темный отсек камеры крыса получала электрокожное раздражение лап (сила тока 0,4 мА, 8 с). Затем через 24 ч и через 9 сут после обучения проводили проверку сохранения выработанного рефлекса. На 23-и сутки предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации. Содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови и в печени, а также в подсолнечном масле определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, витаминов В1 и В2 в печени и казеине - флуориметрически, содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови - спектрофотометрически. Уменьшение количества витаминной смеси в рационе сопровождалось достоверным снижением уровням витаминов А, Е, В1 и В2 в печени и концентрации витаминов А и Е в плазме крови к концу эксперимента, но не отразилось на концентрации МДА в плазме крови. На 12-е сутки развития поливитаминной недостаточности у крыс ухудшилось воспроизведение безусловного рефлекса (фотофобии), о чем свидетельствует достоверное увеличение в 3,2 раза латентного периода перехода в темный отсек по сравнению с животными, получавшими полноценный рацион (47,8±15,8 против 14,8±3,6 с), но не оказало влияния на их способность к обучению. Основываясь на данных о том, что дефицит витаминов, особенно обладающих антиоксидантными свойствами, вызывает окислительный стресс, а повышение уровня кортикостерона в гиппокампе при старении существенно тормозит функции головного мозга, можно предположить, что одним из механизмов выявленного нарушения когнитивных функций является повышение уровня кортикостерона, поскольку при изолированном дефиците витамина А у крыс наблюдается повышение уровня кортикостерона в тканях.

Ключевые слова:витамины, крысы, дефицит витаминов, безусловный рефлекс, фотофобия, обучаемость, МДА

Вопр. питания. - 2015. - № 1. - С. 31-37.

Эпидемиологические данные и клинические наблюдения свидетельствуют о необходимости адекватной микронутриентной обеспеченности для поддержания когнитивных функций и предотвращения старческой деменции. Дефицит витаминов группы В, участвующих в метаболизме оказывающего нейротоксичное действие гомоцистеина, приводящего к снижению метилирования ДНК, а также недостаточное потребление витаминов-антиоксидантов С и Е, флавоноидов, полиненасыщенных жирных кислот семейства ω-3, витамина D негативно отражаются на способности воспринимать внешнюю информацию [11, 12, 15, 20, 23, 24]. Сочетанный дефицит витаминов, достаточно часто встречающийся среди населения нашей страны [7], сопровождается окислительным стрессом [5], что отражается на адаптационном потенциале организма. Так, дефицит витамина D ассоциируется у пожилых людей cо снижением внимания и утратой исполнительной функции [12, 15]. Устранение дефицита витаминов путем дополнительной витаминизации восстанавливало обратимо нарушенные когнитивные функции у детей [9].

Положение о важнейшей роли витаминов в реализации животными когнитивных функций находит свое конкретное подтверждение в ряде экспериментальных исследований. Сочетанный дефицит витаминов В12 , В6 и фолиевой кислоты в течение 10 нед у мышей сопровождался гомоцистеинемией и значительно ухудшал обучаемость и память [30].

В эксперименте на крысах было показано, что дефицит витамина D у взрослых животных приводил к увеличению в 1,6 раза числа неудачных попыток прохождения водного лабиринта Морриса [28]. У мышей, нокаутированных по гену гулоно-γ-лактоноксидазы и не способных синтезировать аскорбиновую кислоту, вследствие чего содержание этого витамина в мозге и печени было снижено на 75% по сравнению с мышами дикого типа, были нарушены нейросенсорные функции, уменьшались ловкость и подвижность при сохранности когнитивных функций [16, 21].

Недостаточное потребление тиамина самками крыс в период лактации вызывало когнитивные нарушения и нейрохимические изменения в мозге потомства [18]. Витамин А посредством своего основного метаболита - ретиноевой кислоты - оказывал важное физиологическое действие на мозг и поведение не только в эмбриональном, но и в постэмбриональном периоде и взрослой жизни крыс и мышей [14, 27]. Недостаточность витамина А препятствовала обучению и сохранению памяти у молодых крыс [26]. Полное лишение витамина А взрослых крыс в течение 12 нед сопровождалось нарушением пространственного обучения и памяти в тесте прохождения лабиринта [14, 17], мышей в течение 39 нед - ухудшением памяти [19]. Введение ретиноевой кислоты в рацион витамин А-дефицитных крыс восстанавливало нарушенный нейрогенез в гиппокампе [14].

В исследованиях на мышах при использовании модели синдрома Дауна было показано, что витамин Е в дозе 50±5 мг на 1 кг массы тела (соответствует дозе 3000 МЕ на взрослого человека массой 60 кг) замедляет наступление когнитивных и морфологических аномалий головного мозга [25].

Продолжительные исследования на крысах показали, что витамин Е в дозе 500 МЕ на 1 кг корма снижает уровень окислительного стресса в мозге и предотвращает когнитивные расстройства у старых крыс [22]. Дополнительное потребление витамина Е улучшало когнитивные функции взрослых мышей [29].

Целью работы было изучить влияние поливитаминной сочетанной недостаточности у растущих крыс на проявление безусловного рефлекса, способность к обучению в ответ на воздействие электрическим током.

Материал и методы

Исследования выполнены на крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 53,4±1,2 г (45,5-62,0 г). Животные получены из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Общая продолжительность эксперимента составила 23 дня. Содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.). На протяжении всего эксперимента животные содержались индивидуально в клетках из прозрачного полимерного материала (высокотемпературного полисульфона) при приглушенном естественном освещении (средняя продолжительность светового дня составила 12,1 ч), относительной влажности воздуха 40-60%, температуре 23±2 °С. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде.

Эксперимент начинали с отборочного теста с 2 камерами на проявление безусловного рефлекса фотофобии (светло-темного выбора) с использованием установки "PanLab" (Испания), которая представляет собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенное опускными моторизированными воротами. Крысу однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку, в который животное стремилось зайти в силу врожденного предпочтения темных участков пространства и исследовательского поведения. Регистрировали латентный период перехода из светлого отсека камеры в темный (тест 1, см. табл. 3), а затем крыс переводили в индивидуальные клетки. По результатам предварительного тестирования в эксперимент были отобраны 20 из 46 животных, латентный период перехода которых из освещенного в темный отсек камеры не превысил 60 с. По длительности латентного периода и массе тела крысы были рандомизированно разделены на 2 группы: контрольную и опытную (полигиповитаминоз).

В течение первых 3 сут все животные получали полноценный полусинтетический рацион [2], содержащий 20% казеина по ГОСТ 53667-2009 (содержание белка 82-84%), 64% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% стандартной солевой смеси, 2% микрокристаллической целлюлозы, 1% сухой витаминной смеси, 0,30% L-цистеина, 0,25% холина битартрата.

В течение последующих 20 сут крысы контрольной группы продолжали получать полноценный полусинтетический рацион, обеспечивающий поступление с рационом витаминов в адекватном количестве. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в корме количества витаминной смеси в 5 раз и полным исключением из нее витамина Е [4]. Среднесуточное количество поедаемого корма в расчете на 1 крысу составило 14,5±0,4 г в контрольной группе и 13,0±0,5 г в опытной. Поступление витамина Е крысам этой группы обеспечивалось за счет естественного содержания токоферолов в подсолнечном масле и составило 2,2 МЕ на 100 г рациона, т.е. 32,8% от содержания этого витамина в рационе контрольной группы. Поступление витаминов В1 и В2 с витаминдефицитным рационом (за счет витаминной смеси и казеина) составило 24% от потребления крысами контрольнойгруппы.

На 12-е сутки кормления проводили тестирование условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ).

Регистрировали латентный период перехода из светлого отсека установки в темный (тест 2, см. табл. 3).

Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение лап (сила тока 0,4 мА, 8 с). Затем крысу сразу же помещали в жилую клетку. Животное должно было обучиться не заходить в темную камеру, где оно получило болевое раздражение, и пассивно избегать неприятной ситуации, находясь в светлом отсеке. Проверка сохранения УРПИ (воспроизведения рефлекса) заключалась в повторном помещении каждого животного в освещенный отсек на 13-е и 21-е сутки кормления (через 24 ч и через 9 сут после обучения). Тестирование завершали, когда животное входило в темный отсек или (альтернативно) если не делало этого в течение 3 мин (тесты 3 и 4, см. табл. 3).

Латентный период пребывания в светлом отсеке камеры при тестировании является показателем, характеризующим степень запоминания крысой отрицательного опыта - удара током, который она приобрела в темном отсеке камеры при обучении.

На 23-и сутки эксперимента предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации. Собранную с гепарином после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500g, отбирали плазму и хранили при -20 °С.

Содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови и в печени, а также в подсолнечном масле определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, витаминов В1 и В2 в печени и казеине - флуориметрически, как описано ранее [3, 4, 10]. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по содержанию вторичных [(малоновый диальдегид (МДА)] продуктов такого окисления в плазме крови [1].

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистических пакетов Статистика (версия 6.0) и SPSS Statistics для Windows (версия 20.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и непараметрический критерий Краскелла-Уоллиса для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Среднесуточное потребление корма крысами, получавшими витаминдефицитный рацион, было достоверно ниже (р=0,010) и составило 89,7% от показателя животных контрольной группы.

Нахождение на витаминдефицитном рационе достоверно (р=0,004) замедлило рост крыс на 14-е сутки и через 23 дня привело к снижению (р<0,05) массы тела и скорости ее прироста соответственно на 15,2 и 19,4% по сравнению с показателями животных контрольной группы (табл. 1).

Витаминдефицитный рацион крыс практически не отразился на абсолютной массе печени, но привел к достоверному увеличению ее относительной массы. Внешние признаки развития недостаточности витаминов (выпадение шерсти, алопеция, дерматит) не проявлялись.

Снижение содержания витаминов в рационе приводило к развитию выраженного полигиповитаминоза [4], о чем свидетельствует достоверное уменьшение концентрации витаминов в печени и плазме крови (табл. 2). Развитие полигиповитаминоза не отразилось на концентрации МДА в плазме крови крыс, что согласуется с ранее полученными данными [2].

Данные тестирования рефлексов по длительности латентного периода перехода животными в темный отсек представлены в табл. 3.

Как свидетельствуют результаты второго этапа тестирования, пребывание на витаминдефицитном рационе привело к достоверному увеличению латентного периода перехода в темный отсек животных опытной группы в 3,2 раза. Очевидно, что потребление крысами в течение 12 сут корма со сниженным содержанием витаминов и развитие у них сочетанной недостаточности всех витаминов привело к ухудшению воспроизведения безусловного рефлекса (фотофобии). У животных контрольной группы, получавших полноценный рацион, безусловный рефлекс сохранялся в полном объеме. По данным литературы, изолированный дефицит каждого из витаминов D, А или В1 , а также нарушение эндогенного синтеза аскорбиновой кислоты приводит к нарушению обучаемости животных в модельных экспериментах [14, 16-18, 21, 26, 28]. Ранее нами было показано, что сочетанный дефицит витаминов у крыс, способных синтезировать аскорбиновую кислоту, сопровождается снижением содержания этого витамина в печени [6]. Таким образом, полученные результаты о негативном влиянии сочетанного дефицита сразу всех витаминов на воспроизведение безусловного рефлекса растущих крыс вполне согласуются с данными о влиянии недостаточности отдельных (особенно обладающих антиоксидантными свойствами) витаминов на когнитивные и сенсомоторные функции. При изолированном дефиците витамина А у крыс возрастает концентрация кортикостерона в тканях [8, 13].

В то же время известно, что повышение уровня кортикостерона в гиппокампе при старении существенно тормозит функции головного мозга [13].

Можно предположить, что в условиях моделируемой в данной работе сочетанной поливитаминной недостаточности также имеет место повышение уровня кортикостерона в различных органах и тканях. Вопрос о возрастании уровня этого медиатора стресса в гиппокампе как одном из механизмов выявленного нарушения нейросенсорных функций требует, однако, дополнительных исследований.

Согласно данным 3-го тестирования УРПИ, можно судить о том, что приобретенный крысами навык пассивного избегания оставался сохранным через 24 ч после обучения для животных обеих групп (ни одно животное не вошло в клетку) независимо от их обеспеченности витаминами. Полигиповитаминоз не отразился на процессе угасания УРПИ через 9 сут после обучения: длительное сохранение воспроизведения условного рефлекса на сформированном уровне наблюдалось у животных обеих групп.

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.

2. Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Коденцова В.М. и др. Влияние обогащения витаминдефицитного рациона крыс полиненасыщенными жирными кислотами семейства ω-3 на биомаркеры витаминного и антиоксидантного статуса // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 45-52.

3. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. - 1994. - Т. 63, № 6. - С. 9-12.

4. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. Экспериментальная модель алиментарного полигиповитаминоза разной степени глубины у крыс // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 2. - С. 51-56.

5. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Мазо В.К. Витамины и окислительный стресс // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 11-18.

6. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. - 2012. - № 10. - С. 439-442.

7. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Изменение обеспеченности витаминами взрослого населения Российской Федерации за период 1987-2009 гг. (к 40-летию лаборатории витаминов и минеральных веществ НИИ питания РАМН) // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 68-72.

8. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 5. - С. 20-25.

9. Студеникин В.М., Спиричев В.Б., Самсонова Т.В. и др. Влияние дополнительной витаминизации на заболеваемость и когнитивные функции у детей // Вопр. дет. диетологии. - 2009. - Т. 7, № 3. - С. 32-37.

10. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д., Харитончик Л.А. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. - 1993. - № 1. - С. 43-48.

11. An Evidence-Based Analysis Health Quality Ontario. Vitamin B12 and Cognitive Function // Ont. Health Technol. Assess. Ser. - 2013. - Vol. 13, N 23. - P. 1-45.

12. Annweiler C., Schott A.M., Rolland Y. et al. Dietary intake of vitamin D and cognition in older women: a large population-based study // Neurology. - 2010. - Vol. 75, N 20. - Р. 1810-1816.

13. Bonhomme D., Pallet V., Dominguez G. et al. Retinoic acid modulates intrahippocampal levels of corticosterone in middle-aged mice: consequences on hippocampal plasticity and contextual memory // Front. Aging Neurosci. - 2014. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3917121/

14. Bonnet E., Touyarot K., Alfos S. et al. Retinoic acid restores adult hippocampal neurogenesis and reverses spatial memory deficit in vitamin A deprived rats // PLoS One. - 2008. - Vol. 3, N 10. - Р. e3487.

15. Buell J.S., Scott T.M., Dawson-Hughes B. et al. Vitamin D is associated with cognitive function in elders receiving home health services // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. - 2009. - Vol. 64A, N 8. - Р. 888-895.

16. Chen Y., Curran C.P., Nebert D.W. et al. Effect of vitamin C deficiency during postnatal development on adult behavior: functional phenotype of Gulo(−/−) knockout mice // Genes Brain Behav. - 2012. - Vol. 11, N 3. - P. 10.1111/j.1601-183X.2011.00762.x.

17. Cocco S., Diaz G., Stancampiano R. et al. Vitamin A deficiency produces spatial learning and memory impairment in rats // Neuroscience. - 2002. - Vol. 115, N 2. - Р. 75-82.

18. de Freitas-Silva D.M., Resende de S., Pereira S.R. et al. Maternal thiamine restriction during lactation induces cognitive impairments and changes in glutamate and GABA concentrations in brain of rat offspring // Behav. Brain Res. - 2010. - Vol. 211, N 1. - Р. 33-40.

19. Etchamendy N., Enderlin V., Marighetto A. et al. Vitamin A deficiency and relational memory deficit in adult mice: relationships with changes in brain retinoid signalling // Behav. Brain Res. - 2003. - Vol. 145, N 1-2. - Р. 37-49.

20. Gillette-Guyonnet S., Secher M., Vellas B. Nutrition and neurodegeneration: epidemiological evidence and challenges for future research // Br. J. Clin. Pharmacol. - 2013. - Vol. 75, N 3. - Р. 738-755.

21. Harrison F.E., Yu S.S., Van Den Bossche K.L. et al. Elevated oxidative stress and sensorimotor deficits but normal cognition in mice that cannot synthesize ascorbic acid // J. Neurochem. - 2008. - Vol. 106. - Р. 1198-1208.

22. Joseph J.A., Shukitt-Hale B., Denisova N.A. et al. Long-term dietary strawberry, spinach, or vitamin E supplementation retards the onset of age-related neuronal signal-transduction and cognitive behavioral deficits // J. Neurosci. - 1998. - Vol. 18, N 19. - Р. 8047-8055.

23. Kang J.H., Cook N., Manson J.A. et al. A trial of В vitamins and cognitive function among women at high risk of cardiovascular disease // Am. J. Clin. Nutr. - 2008. - Vol. 88, N 6. - P. 1602-1610.

24. Liu L., van Groen T., Kadish I., Tollefsbol T.O. DNA methylation impacts on learning and memory in aging // Neurobiol. Aging. - 2009. - Vol. 30, N 4. - Р. 549-560.

25. Lockrow, J. Prakasam A., Huang P. et al. Cholinergic degeneration and memory loss delayed by vitamin E in a Down syndrome mouse model // Exp. Neurol. - 2009. - Vol. 216, N 2. - Р. 278-289.

26. Mao C.T., Li T.Y., Liu Y.X., Qu P. Effects of marginal vitamin A deficiency and intervention on learning and memory in young rats // Zhonghua Er Ke Za Zhi. - 2005. - Vol. 43, N 7. - Р. 526-530.

27. Olson C.R., Mello C.V. Significance of vitamin A to brain function, behavior and learning // Mol. Nutr. Food Res. - 2010. - Vol. 54, N 4. - Р. 489-495.

28. Taghizadeh M., Talaei S.A., Salami M. Vitamin D deficiency impairs spatial learning in adult rats // Iran Biomed. J. - 2013. - Vol. 17, N 1. - Р. 42-48.

29. Takatsu H., Owada K., Abe K. et al. Effect of vitamin E on learning and memory deficit in aged rats // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). - 2009. - Vol. 55, N 5. - Р. 389-393.

30. Troen A.M., Shea-Budgell M., Shukitt-Hale B. et al. Vitamin deficiency causes hyperhomocysteinemia and vascular cognitive impairment in mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105, N 34. - Р. 12474-12479.