Влияние пробиотических кисломолочных продуктов на микробиоценоз толстой кишки, гематологические показатели и клеточный иммунитет крыс (сообщение 1)

РезюмеИзучено воздействие пробиотических кисломолочных продуктов на микрофлору кишечника, гематологические показатели и иммунный статус в эксперименте у крыс. Поступление в пищеварительный тракт в составе кисломолочных продуктов пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus NK-1 и Bifidobacterium bifidum 791 на уровне сотен миллионов КОЕ в день (от 1,7Ч108 до 9Ч108 КОЕ) оказывает в целом положительное, но статистически незначимое влияние на микрофлору толстой кишки и показатели иммунного статуса крыс. Для достижения достоверного эффекта оно должно быть увеличено.

Ключевые слова:пробиотические кисломолочные продукты, микрофлора толстой кишки, клеточный иммунитет

Доклинические исследования пищевых продуктов, обогащенных пробиотиками, позволяют оценить их переносимость, определить эффективную дозировку пробиотических микроорганизмов, а также установить оптимальную продолжительность приема продуктов [1, 2, 5].

Целью настоящей работы была оценка воздействия кисломолочных продуктов, содержащих пробиотические лактобациллы и бифидобактерии, на общее состояние животных, динамику их массы тела, микробиоценоз толстой кишки, гематологические показатели и иммунный статус. Оценка гематологических показателей и иммунологического статуса проводилась для подтверждения пробиотического действия изучаемых штаммов, так как известно, что одним из его аспектов является активация неспецифического иммунитета [4]ю.

Таблица 1. Состав микроорганизмов в используемых кисломолочных продуктах

Материал и методы

Экспериментальные исследования проведены на 35 белых крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 61-75 г. Эксперимент длился 21 день; в течение этого срока животные получали полноценный стандартный виварный рацион и воду ad libitum. Крысы были распределены на 5 групп (по 7 животных в каждой). Дополнительно к рациону животные опытных групп (1-4-я) получали кисломолочные продукты, обогащенные пробиотическими штаммами лактобацилл и бифидобактерий (Lactobacillus acidophilus NK-1, Bifidobacterium bifidum 791) как в монокультуре, так и в сочетаниях. Животные 5-й группы (группа сравнения) получали кисломолочный продукт, содержащий жизнеспособные молочнокислые стрептококки (Streptococcus thermophilus) без пробиотических микроорганизмов. Состав микроорганизмов в используемых кисломолочных продуктах представлен в табл. 1. Образцы пробиотических продуктов выработаны на опытно-экспериментальном заводе ГНУ ВНИМИ РАСХН (Москва).

Объем вводимой порции составлял 1,5-2% от массы тела, что соответствовало суточному потреблению кисломолочных продуктов человеком. Животные группы сравнения получали продукт с молочнокислыми стрептококками в том же объеме.

Учитывая, что для обеспечения человека оптимальным рекомендуемым уровнем потребления живых пробиотических бактерий (в сутки не менее 5108 КОЕ для бифидобактерий и 5107 КОЕ для бактерий рода Lactobacillus)*, исследуемые продукты вводили животным индивидуально ежедневно per os. В процессе исследования вели наблюдение за состоянием животных (поедаемостью корма, поведением крыс, состоянием шерстного покрова, наличием или отсутствием диареи) и массой их тела, которую определяли с помощью электронных технических весов ежедневно и перед умерщвлением (под легким эфирным наркозом) по окончании эксперимента, после чего крыс подвергали патолого-анатомическому вскрытию. Макроскопически определяли состояние внутренних органов, отбирали кровь для иммунологических и гематологических исследований, выделяли толстую кишку (слепую кишку) и асептически отбирали ее содержимое для исследования микрофлоры.

Видовой состав и уровни основных популяций микрофлоры толстой кишки крыс определяли путем количественных посевов ее содержимого на дифференциально-диагностические и селективные среды для 9 групп микроорганизмов (бифидобактерии, лактобациллы, энтеробактерии, стафилококки, стрептококки, энтерококки видов faecium и faecalis, сульфитредуцирующие клостридии, дрожжеподобные и плесневые грибы).

Экспрессию CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли с помощью метода прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC ("IO Test", "Beckman Coulter", США) и лизирующего/фиксирующего набора реагентов ImmunoPrep ("Beckman Coulter", США). В работе использованы следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33), CD3 (клон 1F4), CD4 (клон ОХ-38), CD8 (клон ОХ-38), CD161а (клон 10/78), которые экспрессируется соответственно на В-лимфоцитах, Т-лимфоцитах, Т-лимфоцитаххелперах, цитотоксических Т-лимфоцитах, NKклетках. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлуориметре FC-500 ("Beckman Coulter", США). Популяцию лимфоцитов выделяли с помощью гетерогенного гейтирования (по параметрам бокового светорассеивания и экспрессии CD45-FITC). Определение субпопуляции лимфоцитов проводили у крыс всех групп, кроме 4-й.

Таблица 2. Содержание микроорганизмов в используемых в рационе животных кисломолочных продуктах, КОЕ/см3 (М)

Таблица 3. Динамика массы тела крыс при кормлении изучаемыми продуктами (г; M±m)

Гематологические показатели крови (содержание эритроцитов, концентрация гемоглобина - Hb, гематокрит, средний объем эритроцита, средняя концентрация Hb в эритроците, содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула) определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" ("Beckman Coulter", США).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ SPSS 11,5 для Windows. Математическая обработка данных включала расчет средних значений со стандартными ошибками (М±m). Достоверность различий показателей между группами определяли в соответствии с t-критерием Стьюдента; различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание пробиотических и молочнокислых микроорганизмов определяли во всех вводимых животным кисломолочных продуктах (еженедельно при поступлении каждой новой партии). Как видно из табл. 2, в продуктах, которые получали животные 3-й и 4-й опытных групп, пробиотические микроорганизмы были представлены преимущественно лактобациллами, причем средний их уровень составлял сотни миллионов клеток в 1 см3. В то же время в продуктах со смесью бифидобактерий и лактобацилл (1-я и 2-я опытные группы) их суммарное содержание находилось в диапазоне (3,1-4,8)107 КОЕ/см3, т.е. десятков миллионов клеток. Соответственно, животные 1-й и 2-й опытных групп получали с используемыми продуктами меньшие (на порядок) количества пробиотических микроорганизмов, чем животные 3-й и 4-й опытных групп. В продуктах, которые получали животные в группе сравнения, содержалась только культура молочнокислых термофильных стрептококков (1,0108 КОЕ/г).

Наблюдения за животными в течение 21 дня введения изучаемых продуктов свидетельствуют об отсутствии отклонений в состоянии здоровья и поведении крыс. В то же время проводимый нами мониторинг за массой тела животных показал, что добавление в рацион крыс пробиотических продуктов положительно сказывается на усвоении корма: к концу эксперимента прирост массы тела всех крыс был в пределах 176,5-268,2%. Как видно из табл. 3, наибольший абсолютный прирост отмечен в 1-й опытной группе, в которой крысы получали пробиотический продукт, содержащий Lactobacillus acidophilus NK-1, Bifidobacterium bifidum 791, Streptococcus thermophilus. Однако по сравнению с животными группы сравнения, получавшими с продуктом только Streptococcus thermophilus, различия были недостоверными.

Результаты изучения основных популяций микрофлоры толстой кишки крыс представлены в табл. 4-5. Как видно из табл. 4, все вводимые продукты не оказали существенного влияния на средние уровни защитных представителей микробиоценоза толстой кишки крыс. При сравнительной оценке общего числа анаэробных микроорганизмов, количества лактофлоры и стрептококков наиболее высокие значения зафиксированы у животных, получавших продукт с Lactobacillus acidophilus NK-1 (соответственно 10,0; 9,0 и 8,6lg КОЕ/г). Уровни бифидобактерий существенно не различались и соответствовали значениям, характерным для животных данного вида [4]. Кроме того, при сопоставлении с животными группы сравнения выявлена выраженная тенденция к увеличению содержания ферментативно полноценных энтеробактерий, типичных для нормофлоры крыс.

Благоприятное воздействие вводимых продуктов наиболее ярко выражается в улучшении состава транзиторных популяций (присутствие и содержание которых непостоянно - см. табл. 5) и в первую очередь характерно для продукта, содержащего Lactobacillus acidophilus NK-1 (4-я опытная группа). Так, у животных этой группы условнопатогенные микроорганизмы (коагулазоположительные стафилококки, клостридии и дрожжеподобные грибы) не обнаружены. Частота выявления гемолитических стрептококков и цитратассимилирующих энтеробактерий была в 2 раза ниже, чем у животных группы сравнения (соответственно 42,9 и 14,3% в отличие от 85,7 и 28,6%). Уровень гемолитических стрептококков в 4-й группе был самым низким среди животных.

Таким образом, в результате микроэкологических исследований установлено положительное влияние продукта, содержащего пробиотические Lactobacillus acidophilus NK-1. Это проявлялось в более высоком количестве анаэробных и аэробных бактерий, уровне защитных популяций энтеробактерий, а также в снижении численности условнопатогенной микрофлоры. Полученные данные свидетельствуют о выраженном проявлении антагонистической активности пробиотического штамма лактобацилл в составе продукта в отношении потенциально патогенных микроорганизмов, что согласуется с данными литературы [5].

Результаты иммунологических исследований представлены в табл. 6. Как следует из этих данных, статистически достоверной разницы показателей клеточного иммунитета крыс опытных групп и группы сравнения не обнаружено. Использованные в эксперименте кисломолочные продукты, содержащие штаммы пробиотических микроорганизмов, не оказали существенного влияния на относительное количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов (хелперов и цитотоксических), а также естественных киллеров (NK-клеток) в периферической крови крыс.

Таблица 4. Содержание основных популяций микрофлоры толстой кишки крыс после включения в рацион пробиотических продуктов

Исследование гематологических показателей, характеризующих состояние эритроцитов у экспериментальных животных, не выявило статистически достоверной разницы у крыс опытных групп и группы сравнения. Исследованные показатели (содержание эритроцитов, концентрация Hb, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание Hb в эритроците) находятся в пределах физиологической нормы для крыс [3, 6, 7].

Таблица 5. Содержание условно-патогенных популяций микрофлоры толстой кишки крыс после включения в их рацион пробиотических продуктов

Таблица 6. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови крыс 1-3-й опытных групп и группы сравнения (M±m)

Результаты свидетельствуют о статистически достоверном повышении относительного числа нейтрофильных лейкоцитов у животных, получавших кисломолочные продукты с пробиотическими микроорганизмами, по сравнению с крысами группы сравнения, которые получали кисломолочный продукт на основе молочнокислых микроорганизмов Streptococcus thermophilus. Поскольку нейтрофильные лейкоциты выполняют фагоцитарную функцию, повышение их числа свидетельствует об активации неспецифической резистентности организма в ответ на введение крысам указанных выше продуктов, обогащенных микроорганизмами (табл. 7).

Таким образом, нами обнаружены тенденция к повышению общего числа анаэробных и аэробных бактерий, а также увеличение уровня защитных популяций энтеробактерий. Отмечено снижение численности условно-патогенной транзиторной микрофлоры с факторами патогенности как следствие потребления экспериментальными животными пробиотического кисломолочного продукта, содержащего Lactobacillus acidophilus NK-1 на уровне сотен миллионов КОЕ в суточной порции (1,7108 КОЕ/см3 в среднем) на протяжении 21-дневного эксперимента. При применении других кисломолочных продуктов влияния на состав микрофлоры не выявлено.

Установлено, что все используемые нами пробиотические продукты, содержащие в 1 см3 от 3107 до 9108 КОЕ лактобацилл и бифидобактерий, не оказывают существенного влияния на параметры клеточного иммунитета (относительное содержание В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, естественных киллеров - NK-клеток) и состояние эритроцитов в крови крыс.

Следует подчеркнуть, что поступление в пищеварительный тракт пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus NK-1 и Bifidobacterium bifidum 791 на уровне сотен миллионов КОЕ в день (от 1,7108 до 9108 КОЕ) в составе кисломолочных продуктов оказывает в целом положительное, но статистически незначимое влияние на показатели микрофлоры толстой кишки и иммунный статус крыс и для достижения достоверногго эффекта должно быть увеличено.

Таблица 7. Средние гематологические показатели, характеризующие состояние лейкоцитов крыс опытных групп и группы сравнения (M±m)

Работа выполнена в рамках Контракта № 02.522.12.2009 "Разработка технологий универсального быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности" Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2007-2012 годы".

Литература

1. Байгарин Е.К, Жминченко В.М., Зилова И.С. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78 № 3. - С. 33-37.

2. Батищева С.Ю., Поздняков А.Л., Кузнецова Г.Г. и др. // Вопр. питания. - 2002. - Т. 72, № 4. - С. 44-46.

3. Сидорчук А.А., Глушков А.А. Инфекционные болезни лабораторных животных. - М.: Лань, 2009. - 128 с.

4. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Медицина, 1998. - 288 с.

5. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. - London, Ontario, Canada. 30.04-01. 05. 2002. - 11 р.

6. Lewi P. J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. - Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biochemical Press, 1981. - 381 p.

7. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington, USA: Elsevier Academic Press, 2006.