Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах

РезюмеОхарактеризована в сравнительном аспекте биодоступность железа (Fe) в составе наночастиц оксида Fe и сульфата Fe в эксперименте на крысах, получавших железодефицитный полусинтетический рацион. Показано, что наноструктурированная форма оксида Fe, как и традиционная форма этого микроэлемента (растворимая соль Fe), позволяет восстанавливать статус этого микроэлемента, нарушенный вследствие его дефицита в рационе.

Ключевые слова:железо, дефицит, наночастицы, крысы, биодоступность

Как известно, железо (Fe) является эссенциальным микроэлементом, ответственным за реализацию множества физиологических функций, например, таких как транспорт кислорода, передача электронов по дыхательной цепи, активность многочисленных ферментов и т.д. Потребность в Fe составляет для взрослых мужчин 10 мг/сут, для женщин - 18 мг/сут [4]. Недостаток в рационе Fe, вызывающий развитие железодефицитной анемии (ЖДА), широко распространен в мире, особенно в экономически развитых странах. Это позволяет отнести недостаток Fe в питании человека к числу "глобальных алиментарных дефицитов" [9]. В качестве дополнительных пищевых источников усвояемого в организме Fe в последнее время рассматриваются такие его "нетрадиционные" формы, как биомасса микроводорослей [3] и наночастицы (НЧ) неорганических веществ - солей и окислов Fe (II) и Fe (III) и элементарного Fe [2]. Целью данной работы была оценка биодоступности Fe в составе НЧ оксида Fe (III) (Fe2O3) в эксперименте на лабораторных животных.

Материал и методы

В работе использовали стандартизованные препараты НЧ Fe2O3 производства фирмы "SigmaAldrich" (США-Германия), а также Fe сернокислое семиводное (FeSO4-7Н2О, х.ч.). Препарат НЧ был предварительно охарактеризован по размеру частиц и распределению по размерам методом фотонно-корреляционной спектроскопии. Измерения данным методом для порошка оксида железа определили средний размер частиц порядка 13,4 нм.

Исследование проведено на 43 крысах-самцах Вистар с исходной массой тела 30±2 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Животные были разделены на 3 опытные (по 12 животных в каждой группе) и 1 контрольную (7 крыс) группы.

Во избежание контакта животных с источниками Fe в эксперименте использовали полиэтиленовые клетки, в днище которых были проделаны отверстия диаметром 5-10 мм для удаления мочи и фекалий [8]. Животных размещали в клетках по 6-7 особей.

На протяжении всего эксперимента, который продолжался 37 сут, крысы опытных групп получали полусинтетический железодефицитный корм производства фирмы "MP Biomedicals" (США), а контрольной группы - общевиварный рацион (ОВР). Содержание железа в корме животных опытных групп составило 4,9 мг/кг, контрольной группы - 212 мг/кг корма. Рацион и воду (деионизированную) крысы получали в режиме свободного неограниченного доступа.

Дополнительно к железодефицитному рациону крысы 2-й и 3-й опытных групп получали указанные выше препараты железа, которые вводили внутрижелудочно через зонд. Крысы 2-й опытной группы получали препараты железа в виде обработанной ультразвуком (44 кГц, 10 мин) дисперсии в деионизованной воде НЧ Fe2O3 из расчета 18 мг Fe на 1 кг массы тела, крысы 3-й опытной группы - в виде раствора FeSO4-7Н2О в деионизированной воде в той же дозе (в пересчете на Fe), что и животные 2-й опытной группы. Крысам 1-й опытной группы внутрижелудочно через зонд вводили только деионизированную воду.

Развитие у животных ЖДА контролировали по содержанию гемоглобина (Hb) в крови, взятой из хвостовой вены. В ходе эксперимента определение Hb у животных каждой группы проводили через 14 и 37 дней от начала опыта.

В ходе эксперимента крыс всех групп еженедельно взвешивали на электронных весах и определяли динамику прироста массы тела с точностью ±0,5 г. По окончании опыта животных обескровливали под эфирной анестезией и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции брали следующие внутренние органы: печень, почки, селезенку, сердце, семенники, тимус, легкие. Путем взвешивания на электронных весах определяли (с точностью ±0,01 г) абсолютную массу внутренних органов, затем вычисли их относительную массу. С помощью набора "КлиниТест-Fe/ЖСС" (Россия) в сыворотке крови определяли содержание сывороточного Fe (ССЖ) и ненасыщенную железосвязывающую способность сыворотки (НЖСС). Степень насыщения (СН) железом связывающих железо белков сыворотки крови вычисляли расчетным методом. Методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на атомно-абсорбционном спектрофотометре "Solaar 969 AA Sbeam" [6] определяли содержание Fe в печени*. Гематологические показатели (количество эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцита, содержание и концентрацию Hb в эритроците, общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общее количество тромбоцитов) определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (фирма "Beckman Coulter", США) в соответствии с [5]. Hb в крови определяли гемоглобинцианидным методом [1]. Состояние апоптоза клеток печени (гепатоцитов) изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" (фирма "Beckman Coulter International S.A.", Австрия) [7]. Для этого с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" (фирма "Becton Dickenson and Company", США) получали суспензию гепатоцитов, клетки однократно отмывали забуференным фосфатами до рН 7,2-7,4 раствором 0,15 М хлорида натрия и готовили пробу с концентрацией клеток 1Ч106 см-3. Гепатоциты окрашивали конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) (фирма "Beckman Coulter Int.",США). Взятые на вскрытии животных кусочки печени и клеточную суспензию в процессе обработки хранили на льду. Результаты выражали как процентное соотношение живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза, в расчете на 10 тыс. просчитанных объектов в каждом образце.

Статистическую обработку результатов измерений проводили с помощью пакета программ SPSS 18.0, используя односторонний критерий ANOVA, t-тест Стьюдента, непараметрические ранговые критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса, среднюю арифметическую и ее ошибку (М±m).

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента масса тела животных во всех опытных группах была практически одинаковой. Различия в относительной массе органов у животных опытных групп были также незначительными и не зависели от типа рациона и уровня обеспеченности Fe.

Через 14 дней после начала эксперимента у животных всех опытных групп концентрация Hb в крови составляла 61,4±3,3 г/л, в контрольной группе - 130,7±8,2 г/л, (р<0,05). Однако к концу опыта (через 37 сут эксперимента) у животных, получавших препараты железа, особенно у крыс 2-й опытной группы, которым вводили НЧ Fe, дефицит железа полностью купировался. При этом был весьма характерен и внешний вид животных (см. рисунок).

Как известно, развитие ЖДА характеризуется существенным снижением содержания Hb в крови по сравнению с наблюдаемым при истощении запасов Fe в депо, в том числе в печени. Это сопровождается уменьшением содержания Fe в сыворотке крови и степени насыщения трансферрина (табл. 1). Как следует из данных, приведенных в табл. 2, концентрация Hb в крови у животных 1-й группы, находившихся на протяжении всего эксперимента (в течение 37 сут) на железодефицитном рационе, продолжала оставаться на том же уровне, что и через 14 дней после начала эксперимента. Это сопровождалось достоверным уменьшением количества эритроцитов, показателя гематокрита, среднего объема эритроцита и среднего содержания Hb в эритроците (см. табл. 2). Все это свидетельствовало о развитии выраженной ЖДА, характер которой был подтвержден снижением уровня железа в сыворотке крови, степени насыщения трансферрина и содержания Fe в печени (см. табл. 1).

Внешний вид крыс 1-й (внизу) и 2-й опытных групп к концу опыта

Таблица 1. Показатели, характеризующие обеспеченность крыс железом (M±m)

Введение на протяжении 23 дней различных форм железа (НЧ Fe и сульфат Fe) животным с ЖДА (опытные 2-я и 3-я группы) обусловливало однотипные изменения, характеризующиеся полной нормализацией гематологических и биохимических показателей обмена Fe в организме (см. табл. 1, 2). Единственным показателем, который не вписывался в общую картину, являлось содержание Fe в печени у животных 3-й группы, получавших сульфат Fe. Притом что остальные изученные гематологические и биохимические показатели, характеризующие обмен Fe у животных 2-й и 3-й групп, были практически одинаковыми, содержание Fe в печени у животных 3-й группы было существенно выше. По-видимому, всасывание сульфата Fe в желудочно-кишечном тракте было выше, чем НЧ Fe, что и стало отражением накопления элемента в печени. Вместе с тем следует отметить, что повышенное поступление Fe не всегда является адекватным. Оно показано в случае быстрого восполнения уровня Fe в организме при его дефиците и дальнейшего поступления в оптимальных количествах, поддерживающих его пул. В случае, когда поступление Fe оcтается на том же высоком уровне, это может приводить к его избыточному накоплению в органах и тканях и проявлению прооксидантного действия этого микроэлемента. Таким образом, в рассматриваемом случае различия в уровнях накопления Fe в печени можно объяснить более высокой степенью всасывания Fe2+, находящегося в составе сульфата Fe, чем входящего в состав НЧ Fe3+. С другой стороны, сравнение данных по содержанию Fe в печени у животных 2-4-й групп показало, что у животных контрольной группы его уровень сравним с таковым во 2-й опытной группе, что указывает на определенное, более "мягкое" действие НЧ Fe, не приводящее к избыточному накоплению железа.

Исследование лейкоцитарной формулы (общее содержание лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, базофилов, процент незрелых клеток) не выявило достоверных различий между группами животных. В то же время количество эозинофилов у крыс 2-й (0,21±0,06%) и 3-й (0,24±0,04%) групп было несколько выше, чем в 1-й опытной и контрольной группах (соответственно 0,10±0,06 и 0,03±0,02%).

Таблица 2. Показатели эритропоэза у крыс разных групп (M±m)

Таблица 3. Показатели, характеризующие состояние апоптоза гепатоцитов у крыс (%; M±m)

Примененный в настоящей работе принцип метода цитофлюориметрического учета апоптоза клеток печени основан на свойстве аннексина V (AnV) связываться с фосфатидилсерином клеточной мембраны и способности 7-AAD встраиваться между цитозином и гуанином 2-цепочечной ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны. На ранних стадиях апоптоза целостность мембраны клеток сохраняется, но происходит конверсия мембранных фосфолипидов с появлением фосфатидилсерина на поверхности клетки. AnV с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином и идентифицирует "ранний" апоптоз в AnV-FITC+ (позитивных)/7-AAD- (негативных) клетках. Поздняя фаза апоптоза сопровождается не только утратой асимметрии фосфолипидов мембраны, но и нарушением целостности мембраны, фрагментацией ДНК и резким возрастанием мембранной проницаемости для катионных красителей. Такая стадия апоптоза детектируется в AnV-FITC+ (позитивных)/7-AAD+ (позитивных) клетках. Мертвые клетки могут быть также AnV-FITC- (негативными)/7-AAD+ (позитивными). Живые клетки, не входящие в апоптоз, не связывают AnV-FITC и непроницаемы для 7-AAD, т.е. являются AnV-FITC- (негативными)/7-AAD- (негативными).

Данные о состоянии апоптоза клеток печени, представленные в табл. 3, свидетельствуют о существенном статистически достоверном повышении относительного числа гепатоцитов, подвергшихся апоптозу, и мертвых клеток у животных 1-й опытной группы по сравнению с остальными опытными группами. Показатели апоптоза гепатоцитов у крыс 2-й и 3-й опытных групп, получавших соответственно НЧ Fe и сульфат Fe, не различались между собой. Однако следует отметить, что относительное число гепатоцитов, находящихся в состоянии апоптоза, у крыс, получавших препараты Fe, несколько выше, чем у крыс контрольной группы.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что использование НЧ Fe в течение ограниченного времени (37 сут) приводит к практически полной нормализации показателей, характеризующих обмен Fe в организме, и в то же время не способствует избыточному накоплению данного микроэлемента в печени, что наблюдается при применении сульфата Fe.

Литература

1. Биохимические методы исследования в клинике: справочник / Под ред. А.А. Покровского. - М.: Медицина, 1969. - 420 с.

2. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

3. Гмошинский И.В., Зарецкая Е.С., Мазо В.К. // Успехи современного естествознания. - 2004. - Т. 1, № 6, прил. 1. - С. 121-123.

4. МР 2.3.1.2432-08. "Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации". - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 41 с.

5. МУ 1.2.2520-09. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-медицина, 1998. - 340 с.

7. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии, клиническое примечание. - Челябинск: Бумажный двор, 2008. - 112 с.

8. Хотимченко С.А., Алексеева И.А. // Вопр. питания. - 1999. - № 5-6. - С. 13-15.

9. Stephenson L.S. et al. // Parasitology. - 2000. - Vol. 121, suppl. 1. - P. S5-S22.