Биологически активные вещества плодов кизила (Cornus mas L.)

Резюме

Десять образцов свежезамороженных плодов кизила обыкновенного (Cornus mas L.), собранных в Тамбовской области и в Кавказском регионе, исследованы на содержание и состав основных биологически активных веществ: антоцианинов, проантоцианидинов, дигидроксикоричных кислот, иридоидов, органических кислот, моно- и дисахаридов, а также антирадикальную активность в DPPH-тесте in vitro. Содержание полифенольных соединений, определенное по методу Фолина-Чокальтеу, составило 150-400 мг/100 г свежих плодов. Содержание олигомерных проантоцианидинов, определенное по методу Бейта-Смита, варьировалось от 20-25 мг/100 г в недозрелых плодах кизила до 80-430 мг/100 г в зрелых. Суммарное содержание антоцианинов оценивали методом рН-дифференциальной cпектрофотометрии. Количество мономерных антоцианинов менялось от 11,2 мг/100 г в недозрелых плодах кизила до 92,2 мг/100 г в зрелых плодах кизила. В качестве основных антоцианинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) cо спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим (МС) детектированием идентифицированы 3-галактозиды цианидина (19,0-80,3%) и пеларгонидина (15,1-75,6%). Разработана оригинальная методика определения иридоидов кизила методом ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием. В качестве основных иридоидов обнаружены логаниновая кислота, логанин, сверозид и корнузид. Суммарное содержание иридоидов составило 130-400 мг/100 г, причем во всех образцах преобладала логаниновая кислота (87,6-94,8%). Обнаружено минорное количество производных гидроксикоричных кислот (<10 мг/100 г). Среди органических кислот, общее содержание которых варьировало в диапазоне от 0,4 до 2,8%, преобладала яблочная кислота. Обнаружено высокое содержание аскорбиновой кислоты (35,0-60,0 мг/100 г). Профиль углеводов кизила представлен фруктозой (2,2-3,8%) и глюкозой (2,5-7,0%). 70% водно-этанольные экстракты плодов кизила обыкновенного показали выраженную антирадикальную активность в DPPH-тесте (470,5-932,0 мг ТЭ/100 г). Полученные данные о специфических минорных биологически активных веществахмогут быть использованы при стандартизации и оценке потенциальной активности экстрактов и биологически активных добавок к пище на основе плодов кизила.

Ключевые слова:кизил обыкновенный (Cornus mas L.), полифенольные соединения, проантоцианидины, антоцианины, иридоиды, органические кислоты, DPPH

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 86-94.

Кизил - род древесных и кустарниковых растений семейства кизиловые (Cornaceae), включающий около 50 видов. В России наиболее распространен кизил обыкновенный (Cornus mas L.).

В диком виде кизил обыкновенный произрастает на Кавказе, широко культивируется в южных областях России.

Плоды кизила обыкновенного имеют давнюю традицию пищевого применения как в свежем виде, так и в виде джемов, соков, мармелада, сиропов, соусов и настоек. В традиционной медицине плоды кизила применяются для лечения лихорадки, диареи, заболеваний почек. Изучение биологической активности экстрактов плодов кизила показало наличие выраженной антиоксидантной, противовоспалительной, антимикробной активности. В доклинических и клинических исследованиях показано антидиабетическое, антиатеросклеротическое, гиполипидемическое действие плодов кизила [6, 14, 19].

Широкий спектр биологической активности плодов кизила обыкновенного обусловлен комплексом биологически активных веществ: полифенольных соединений (антоцианов, проантоцианидинов), иридоидов, органических кислот.

Так, антоцианы, выделенные из плодов кизила обыкновенного, в опытах in vitro и in vivo стимулировали секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы, снижали инсулинорезистентность клеток и концентрацию триглицеридов в печени [11, 15]. Показано антигенотоксическое, нейропротекторное, антидиабетическое действие иридоидов кизила in vitro [8, 12, 13, 19]. Иридоиды, характерные для кизила обыкновенного, выделенные из других растений, обладали противовоспалительной, антибактериальной, анти-грибковой, спазмолитической (логанин, сверозид) активностью [9].

Целью работы явилось определение основных минорных биологически активных веществ плодов отечественного дикорастущего и культивируемого кизила обыкновенного и их содержания (антоцианинов, олигомерных проантоцианидинов, иридоидов, органических кислот, моно- и дисахаридов), а также определение антирадикальной активности в тесте in vitro.

Материал и методы

Исследовано 10 образцов свежезамороженных плодов кизила обыкновенного, из них 8 сортов выведены в Мичуринске и заготовлены в Тамбовской области в 2012 г. (№ 1-8 в таблицах); 2 образца дикорастущего кизила из Кавказского региона (зрелые ягоды - № 9, недозрелые ягоды - № 10).

Экстракцию полифенольных соединений и олигомерных проантоцианидинов проводили метанолом в отношении 1:100. Антоцианины, иридоиды извлекали 70% водным этанолом, гидроксикоричные кислоты - 50% водным этанолом в отношении 1:100. Органические кислоты и сахара из растительного сырья экстрагировали дистиллированной водой в отношении 1:100.

Суммарное содержание полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту определяли с помощью модифицированного метода Фолина-Чокальтеу, содержание суммы проантоцианидинов - модифицированным методом Бейта-Смита [5].

Определение суммы антоцианинов в пересчете на цианидин-3-глюкозид проводилось методом рН-дифференциальной спектрофотометрии [2, 5] на спектрофотометре "UV-1800 Shimadzu" ("Shimadzu Corporation", Япония) с диапазоном длин волн 190-1100 нм.

Состав антоцианинов и иридоидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с фотометрическим и массспектрометрическим (МС) детектированием на жидкостном хроматографе "Agilent 1100 series" ("Agilent Technologies", США) с диодно-матричным спектрофотометрическим детектором "Agilent 1100 Series Diode Array", времяпролетным массселективным детектором "Agilent 6200 TOF LC/MS" с ионизацией электрораспылением.

Условия ВЭЖХ для определения антоцианинов: колонка Phenomenex Luna C18 250×4,6 мм 5 мкм; бинарная подвижная фаза: А - 4% водный раствор ортофосфорной кислоты (рН 2,1), В - ацетонитрил (0 мин - 10% В, 10 мин - 15% В, 15 мин - 20% В); температура колонки 40 °С; скорость потока растворителя 1,0 мл/мин; объем вводимой пробы 10 мкл; фотометрическое детектирование при λ=520 нм. Для ВЭЖХ-МС: А - 1% водный раствор муравьиной кислоты, В - ацетонитрил (0 мин - 10% В, 10 мин - 15% В, 20 мин - 20% В); температура колонки 40 °С; скорость потока растворителя 0,5 мл/мин. Сканирование масс - в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне m/z 100-1000; напряжение на капилляре - 3,5 кВ, поток газа-осушителя (азот) - 9 л/мин, температура - 325 °С, давление на распылителе - 0,27 МПа.

Условия ВЭЖХ для определения иридоидов: колонка ProteCol C18 HPH125 250×4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, В - метанол (0 мин - 5% В, 40 мин - 80% В); температура колонки - 30 оС; скорость потока растворителя - 0,5 мл/мин. Объем вводимой пробы - 5 мкл. Фотометрическое детектирование при λ=235 нм. Параметры масс-детектирования описаны нами ранее [3].

Содержание гидроксикоричных кислот определяли методом ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием [4].

Содержание органических кислот и аскорбиновой кислоты определяли методом ВЭЖХ [1, 5].

Содержание свободных моно- и дисахаридов определяли методом капиллярного электрофореза на системе "Agilent 7100" ("Agilent Technologies", США) с диодно-матричным спектрофотометрическим детектором на кварцевом капилляре Agilent L=72 см, ID=50 мкм, буфер - Agilent Basic Anion Buffer.

Температура термостата 25 оС, напряжение - 30 кВ. Косвенное фотометрическое детектирование проводили при длине волны 350 нм, контрольная длина волны - 275 нм.

Антирадикальную активность оценивали в DPPHтесте (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) in vitro и выражали в мг тролоксового эквивалента (ТЭ) на 100 г плодов [7].

Результаты и обсуждение

Содержание основных групп полифенольных соединений кизила обыкновенного (мг/100 г свежих плодов) представлено в табл. 1.

Содержание полифенольных соединений варьировало в диапазоне от 150 до 400 мг/100 г свежих плодов. Содержание олигомерных проантоцианидинов составило 20-25 мг/100 г в недозрелых плодах кизила и 80-430 мг/100 г в зрелых.

Антоцианины. Суммарное содержание мономерных антоцианинов отечественного кизила составило от 10 до 92 мг/100 г (см. табл. 1). Наибольшее количество антоцианинов найдено в образце № 8, наименьшее - в образце № 10. Полученные результаты сопоставимы с данными литературы по содержанию антоцианинов в плодах кизила обыкновенного из других регионов. Так, в плодах кизила, собранных в Словакии, содержание анто-цианинов составило 29-111 мг/100 г, в Польше - 50 мг/100 г, в Турции - 65 мг/100 г [10, 16-18].

Впервые установлен профиль индивидуальных антоцианов отечественного кизила. В качестве основных антоцианинов в отечественных плодах кизила найдены 3-галактозиды цианидина и пеларгонидина. Минорные антоцианины идентифицированы как 3-глюкозиды дельфинидина, цианидина и пеларгонидина соответственно (рис. 1).

Параметры удерживания, максимумы поглощения в видимой области и результаты масс-спектрометрического анализа антоцианинов представлены в табл. 2.

Состав антоцианинов во всех образцах идентичен, при этом варьирует только относительное содержание антоцианинов. В плодах кизила № 1, 3-5 преобладает пеларгонидин-3-галактозид (56,6-75,6% от суммы антоцианинов), в плодах кизила №2, 9 и 10 - цианидин-3-галактозид (61,0-80,3% от суммы антоцианинов), а в образцах №6-8 цианидин-3-галактозид и пеларгонидин-3галактозид содержатся в отношении приблизительно 1:1 (табл. 3).

Иридоиды. Разработана оригинальная методика определения иридоидов кизила методом ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием. В качестве основных иридоидов плодов кизила обыкновенного обнаружены 2 иридоидных гликозида (логаниновая кислота и логанин) и 2 секоиридоидных гликозида (сверозид и корнузид), что соответствует данным литературы [8].

Параметры удерживания, максимумы поглощения в УФ-области и результаты МС-анализа иридоидов представлены в табл. 4.

ВЭЖХ-МС хроматограмма выделенных ионов [M+Na] иридоидов кизила обыкновенного представлена на рис. 2. Спектрофотометрическое детектирование при ВЭЖХ иридоидов проводили при длине волны 235 (±2) нм, соответствующей основному максимуму поглощения иридоидов в УФ-области (рис. 3).

Результаты количественного определения иридоидов в образцах плодов кизила обыкновенного представлены в табл. 5.

Суммарное содержание иридоидов в кизиле обыкновенном составило 130-400 мг/100 г.

Во всех исследованных образцах среди иридоидов преобладает логаниновая кислота, составляя от 87,6% (образец № 4) до 94,8% (образец № 3) от суммарного содержания иридоидов.

Гидроксикоричные кислоты. Содержание производных гидроксикоричных кислот в плодах кизила составило 7,3-11,4 мг/100 г в пересчете на хлорогеновую кислоту.

Органические кислоты. Содержание органических кислот в плодах кизила колебалось от 417 до 2793 мг/100 г (0,4-2,8%). В качестве основных были найдены яблочная (400-2730 мг/100 г) и лимонная (16-80 мг/100 г) кислота. Во всех образцах превалирует яблочная кислота, составляя от 95,9 до 97,8% от суммарного содержания органических кислот.

Аскорбиновая кислота. В исследованных образцах плодов кизила обыкновенного обнаружено довольно высокое содержание аскорбиновой кислоты - 35,0-60,0 мг/100 г, сопоставимое с ее содержанием в апельсинах (53 мг/100 г), красной смородине (58-81 мг/100 г), клубнике (29-57 мг/100 г), малине (23-32 мг/100 г) [20].

Моно- и дисахариды. Электрофореграмма сахаров плодов кизила обыкновенного представлена на рис. 4.

Во всех исследованных образцах найдены фруктоза в количестве 2210-3880 мг/100 г (2,2-3,8%) и глюкоза - 2530-6970 мг/100 г (2,5-7,0%). Соотношение глюкоза/фруктоза в образцах составило 1,1-1,5, за исключением образцов № 7 и 5 (соотношение - 2,2-2,3).

DPPH-тест. В результате проведенных нами исследований показано, что антирадикальная активность плодов кизила обыкновенного, в DPPH-тесте in vitro варьировавшая в диапазонеот 470 до 932 мг ТЭ/100 г (см. табл. 1), примерно эквивалентна антирадикальной активности клюквы (409 мг ТЭ/100 г), брусники (709 мг/100 г), черной смородины (474-987 мг ТЭ/100 г) и черники (680-1200 мг/100 г). Прослеживается прямая зависимость антирадикальной активности плодов кизила от общего содержания и содержания отдельных групп полифенольных соединений и аскорбиновой кислоты (см. табл. 1).

Заключение

На основе разработанных оригинальных аналитических методик впервые систематически исследованы основные показатели, характеризующие пищевую ценность и содержание биологически активных веществ плодов кизила обыкновенного (Cornus mas L.): общее содержание и профиль органических кислот, углеводов, полифенольных соединений (антоцианинов, проантоцианидинов, гидроксикоричных кислот), иридоидов, а также антирадикальная активность экстрактов в DPPH-тесте in vitro.

Полученные результаты могут быть использованы для оценки пищевой и биологической ценности, потенциальной фармакологической активности, установления хемотаксономических индикаторов и стандартизации продуктов на основе плодов кизила.

Литература

1. ГОСТ 31643-2012 Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. ГОСТ Р 53773-2010 Продукция соковая. Методы определения антоцианинов.

3. Жогова А.А., Эллер К.И., Самылина И.А. ВЭЖХ-масс-спектрометрия в анализе индикаторных иридоидов растительного сырья // Фармация. - 2012. - № 7. - С. 14-17.

4. Медведев Ю.В., Передеряев О.И., Арзамасцев А.П. и др. Определение гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье и объектах растительного происхождения // Вопр. биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 3. - С. 25-31.

5. Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи / Под ред. В.А. Тутельяна, К.И. Эллера. - М.: Династия, 2010. - С. 28-40.

6. Asgary S., Kelishadi R., Rafieian-Kopaei M. et al. Investigation of the Lipid-Modifying and Antiinflammatory Effects of Cornus mas L. Supplementation on dyslipidemic children and adolescents // Pediatr. Cardiol. - 2013. - 34 (7). - 1729-1735.

7. Bondet V., Brand-Williams W., Berset C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH- Free Radical Method // Lebensm.-Wiss. Technol. - 1997. - Vol. 30. - P. 609-615.

8. Deng S., West B.J., Jensen C.J. UPLC-TOF-MS Characterization and Identification of Bioactive Iridoids in Cornus mas Fruit // J. Anal. Methods Chem. - 2013. - Vol. 2013. - P. 1-7. 9. Dinda B., Debnath S., Harigaya Y. Naturally occurring secoiridoids and bioactivity of naturally occurring iridoids and secoiridoids. A review, part 2 // Chem. Pharm. Bull. - 2007. - Vol. 55, N 5. - P. 689-728.

10. Gunduz K., Saracoglu O., Цsgen M. et al. Antioxidant, physical and chemical characteristics of cornelian cherry fruits (Cornus mas L.) at different stages of ripeness // Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus. - 2013. - Vol. 12, N 4. - P. 59-66.

11. Jayaprakasam B. Olson L.K., Schutzki R.E. et al. Amelioration of obesity and glucose intolerance in high-fat-fed C57BL/6 mice by anthocyanins and ursolic acid in Cornelian cherry (Cornus mas) // J. Agric. Food Chem. - 2006. - Vol. 54, N 1. - P. 243-248.

12. Jeong E. J. Kim T.B., Yang H. et al. Neuroprotective iridoid glycosides from Cornus officinalis fruits against glutamate-induced toxicity in HT22 hippocampal cells // Phytomedicine. - 2012. - Vol. 19, N 3. - P. 317-321.

13. Lee K.Y., Sung S.H., Kim S.H. et al. Cognitive-enhancing activity of loganin isolated from Cornus officinalis in scopolamineinduced amnesic mice // Arch. Pharm. Res. - 2009. - Vol. 32. - P. 677-683.

14. Mirbadalzadeh R., Shirdel Z. Antihyperglycemic and antihyperlipidemic effects of Cornus mas extract in diabetic rats compared with glibenclamide // Elixir (Hormo. & Signal). - 2012. - Vol. 47. - P. 8969-8972.

15. Nair M. G., Jayaprakassam B., Olsom L.K. et al. Insulin secretion by anthocyanins and anthocyanidins: пат. 7737121 США. 2010.

16. Paulovicsova B., Turianica I., Jurikova T. et al. Antioxidant properties of selected less common fruit species // Lucrari stiintifice Zootehnie si Biotehnologii. Timisoara. - 2009. - Vol. 42, N 1.

17. Pyrkosz-Biardzka K., Kucharska A.Z., Sokol-Letowska A. et al. A comprehensive study on antioxidant properties of crude extracts from fruits of Berberis vulgaris L., Cornus mas L. and Mahonia aquifolium Nutt // Pol. J. Food Nutr. Sci. - 2014. - Vol. 64, N 2. - P. 6-17.

18. Vareed S.K., Reddy M.K., Schutzki R.E. et al. Anthocyanins in Cornus alternifolia, Cornus controversa, Cornus kousa and Cornus florida fruits with health benefits // Life Sci. - 2006. - Vol. 78. - P. 777-784.

19. Yamabe N., Noh J.S., Park S.H. et al. Evaluation of loganin, iridoid glycoside from Corni Fructus, on hepatic and renal glucolipotoxicity and inflammation in type 2 diabetic db/db mice // Eur. J. Pharmacol. - 2010. - Vol. 648, N 1. - P. 179-187.

20. URL: http://ndb.nal.usda.gov/ndb/ USDA National Nutrient Database for Standard reference.