Комплекс цинка с ферментолизатом белка селезенки свиньи - исследование in vivo

Резюме

В лабораторных условиях с применением ультра- и нанофильтрационной технологии получен комплекс цинка с ферментативным гидролизатом белка селезенки свиньи (Zn-ФГСС), исследован его состав, проведены исследования in vivo в эксперименте с использованием половозрелых крыс-самцов Вистар (масса тела 132Ѓ}2,4 г), которые в течение 18 сут получали ad libitum питье и цинкдефицитный рацион (ЦДР) Zinc Deficient Diet, Egg White Base, содержащий не более 1,3 мг цинка/кг корма. Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой: 1-я группа получала ЦДР и дистиллированную воду; 2-я группа получала ЦДР и водный раствор сернокислого цинка (ZnSO4) с концентрацией цинка 16,3 мкг/мл, 3-я группа - ЦДР и водный раствор комплекса Zn-ФГСС с концентрацией цинка 16,3 мкг/мл. Животных ежедневно осматривали и фиксировали объем выпитой воды. Перед началом эксперимента крыс тестировали на проявление безусловного рефлекса (фотофобии), определяя время перехода из освещенного отделения в темное на специальной установке. Оценивали прирост массы тела крыс (ΔW), устойчивость безусловного рефлекса у этих животных и их обучаемость воспроизведению условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) после болевого раздражения электрическим током на лапы. На 18-е сутки через 16 ч после болевого воздействия электрическим током в сыворотке крови определяли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) и содержание кортикостерона. Показано, что использованная технология получения Zn-ФГСС приводит к относительно незначительному изменению распределения пептидных фракций по молекулярным массам и практически полному удалению свободных ионов металла из конечного продукта. В исследовании in vivo показано, что за экспериментальный период ΔW по группам составил соответственно 23, 87 и 82% (р<0,05); активность ЩФ - 1,70Ѓ}0,06; 3,10Ѓ}0,25; 4,19Ѓ}0,26 мкмоль/л/с (p<0,05); содержание кортикостерона - 20,7Ѓ}7,2; 21,5Ѓ}6,3 и 22,1Ѓ}6,5 нг/мл (p<0,05). На 14-е сутки выявлено достоверное (р<0,05) ухудшение в проявлении безусловного рефлекса (фотофобии) в 1-й группе по сравнению с остальными группами [латентный период (ЛП) - 50,9Ѓ}12,0 против 18,1Ѓ}16,0 и 16,0Ѓ}4,2 с], а также по сравнению с исходным тестированием (16,8Ѓ}8,0 с). Результаты по ЛП после болевого воздействия элект- рическим током показали у всех групп сохранение УРПИ через 24 и 96 ч после болевого воздействия. Полученные данные позволяют говорить о высокой биодоступности новой органической формы цинка Zn-ФГСС и возможности ее использования в составе специальных пищевых продуктов.

Ключевые слова:ферментативный гидролиз, ультра- и нанофильтрационные технологии, эссенциальные микроэлементы, цинк, селезенка свиньи, условный рефлекс пассивного избегания

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 58-63.

Глобальная проблема недостаточной микронутриентной обеспеченности населения различных регионов определяет необходимость научного обоснования, разработки инновационных технологических подходов, а также комплексной медико-биологической оценки безопасности и эффективности использования в питании новых пищевых источников микронутриентов, включая эссенциальные микроэлементы (ЭМ). Возможность эффективного использования в питании человека новых источников ЭМ в значительной степени определяется их способностью всасываться в пищеварительном тракте и ассимилироваться в организме. С общебиологических позиций, учитывающих эволюционный фактор, очевидна целесообразность использования в питании человека преимущественно органических форм микроэлементов [7, 8], в том числе связанных с пептидами. В серии работ нами были определены оптимальные условия ферментативного гидролиза пищевых белков различного происхождения: концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков и некоторых других белковых источников и показана эффективность использования реакции их комплексирования с различными ЭМ-антиоксидантами (цинк, медь, марганец) для получения их органически связанных форм [2, 3]. Проведенные доклинические исследования in vitro и in vivo с использованием физико-химических, иммунохимических, физиолого-биохимических подходов и методов экспериментальной аллергологии, а также исследования биодоступности и влияния комплексов цинка с некоторыми ферментативными гидролизатами пищевых белков на состояние кишечного барьера у лабораторных животных показали перспективность безопасного и эффективного использования полученных комплексов микроэлементов в профилактическом и лечебном питании для восполнения микроэлементной недостаточности.

В то же время использованные нами ранее для получения ферментолизатов пищевые белки достаточно дорогостоящи, уже давно востребованы сами по себе и успешно применяются в пищевой промышленности. Встает вопрос о поиске новых пищевых белков и их ферментолизатов для получения органических форм ЭМ, так как необходимо иметь максимально широкий выбор ферментативных гидролизатов [5] с учетом возможной непереносимости некоторых из них отдельными лицами. Это может быть достигнуто, в частности, разработкой технологии с использованием ферментолизатов различного белоксодержащего сырья животного происхождения за счет дешевых отходов мясоперерабатывающей промышленности, например, селезенки свиньи.

Цели исследования - получить в лабораторных условиях комплекс цинка с ферментативным гидролизатом белка селезенки свиньи (Zn-ФГСС), оценить in vivo усвояемость полученной органической формы цинка и его влияние на ростовые показатели и устойчивость рефлексов.

Материал и методы

Для получения Zn-ФГСС использовали ферментативный гидролизат белка селезенки свиньи (ФГСС), представленный ООО "Петрохим" (РФ). Содержание белка (Nх6,25) в ФГСС составляло 79%, золы - 10%, влаги - 5%. Zn-ФГСС получали в результате реакции комплесообразования ФГСС с хлористым цинком (ZnCl2 семиводный) при их определенных весовых соотношениях и рН 7,0 с последующей микрофильтрацией (мембрана 0,65 мкм) и нанофильтрацией на лабораторной установке ("Владисарт", РФ). После концентрирования и двукратной отмывки дистиллированной водой собранную высокомолекулярную фракцию высушивали на сублимационной сушке ЛС-500 ("Проинтех", РФ).

Анализ молекулярно-массового распределения белково-пептидных фракций в составе ФГСС и ZnФГСС проводили методом эксклюзионной жидкостной хроматографии среднего давления [4].

Исследования in vivo усвояемости полученной органической формы цинка и его влияния на ростовые показатели, активность щелочной фосфатазы и устойчивость условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проведены в эксперименте с использованием половозрелых крыс-самцов линии Вистар. Животные после их поступления из питомника "Столбовая" в течение 7 дней проходили адаптацию, получая в этот период времени стандартный рацион вивария.

Перед началом эксперимента крыс взвешивали и тестировали на проявление безусловного рефлекса пассивного избегания на установке ("PanLab", Испания) в виде камеры из двух отсеков: большое освещенное белое и маленькое черное отделения, разделенные опускными автоматическими воротами. Крысу однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку, в который животное стремилось зайти в силу врожденного предпочтения темных участков пространства и исследовательского поведения. Латентный период (ЛП) перехода из светлого отсека камеры в темный регистрировали (тест 1, табл. 4), а затем крыс переводили в индивидуальные клетки. Исходя из данных тестирования в эксперимент были отобраны животные, ЛП перехода которых не превышал 120 с (2 мин); животные были равномерно распределены по группам с учетом значения ЛП и массы тела.

Исследования проведены на 30 животных со средней массой 132-133 г, которые в течение 18 сут получали ad libitum питье и коммерческий цинкдефицитный рацион (ЦДР) "Zinc Deficient Diet, Egg White Base" ("MP Biomedicals, LLC", Франция), содержащий следовые количества цинка (не более 1,3 мг цинка/кг корма).

На 14-е сутки эксперимента у всех животных вырабатывали УРПИ: регистрировали ЛП перехода из светлого отсека установки в темный (тест 2, табл. 4), и как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала болевое электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА). Затем крысу сразу же переводили в жилую клетку. В результате проведенного обучения животное должно избегать перехода в темную камеру при повторном тестировании, т.е. должно находиться в светлом отсеке [1].

Проверки сохранения УРПИ (воспроизведения рефлекса) состояли в повторном помещении животного в освещенный отсек на 15-е и 18-е сутки эксперимента (через 24 и 96 ч после обучения УРПИ).

В данном исследовании тестирование завершали, когда животное входило в темный отсек или если не делало этого в течение 3 мин (тесты 3 и 4, табл. 4).

В предпоследний день эксперимента за 16 ч до выведения из эксперимента животных подвергали стрессорному воздействию электрическим током, для этого крысу принудительно помещали в темный отсек камеры для УРПИ, где она получала болевое электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 с). На 19-е сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики".

Кровь животных собирали и центрифугировали при t=4 °С в течение 25 мин при 1500 об./мин на центрифуге J-6B ("Beckman", Австрия) для получения сыворотки. Образцы отобранной сыворотки крови хранили в замороженном состоянии.

Об усвояемости цинка косвенно судили по активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови, определяемой с использованием коммерческого набора реактивов ("BioLaTest", Чешская Республика). В сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора "Corticosterone EIA kit" определяли содержание кортикостерона ("Immunodiagnostic System", Великобритания).

Величины определяемых показателей приведены в виде М±m, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка среднего. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Полученный комплекс Zn-ФГСС представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета со слабым мясным запахом и вкусом; практически полностью растворимый в воде и содержащий в среднем 8,8% цинка (88 мг/г). Результаты исследования молекулярно-массового распределения пептидных фракций представлены в табл. 1.

Из приведенных результатов следует, что стадия нанофильтрации приводит к относительно незначительному изменению распределения фракций по молекулярным массам и практически полному удалению свободных ионов металла из конечного продукта.

Ежедневный осмотр животных в течение эксперимента (19 сут) показал, что их общее состояние в опытных группах (2-й и 3-й) было удовлетворительным по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению и скорости роста (табл. 2).

На 4-е сутки у животных 1-й группы (цинк-дефицит), не получавших дополнительно цинка с водой, отмечались покраснения кожного покрова, расчесы, язвочки, изменение цвета и качества шерстного покрова. Масса тела и прирост массы тела у животных 1-й группы на 4-е сутки были достоверно ниже, чем у крыс 2-й и 3-й групп, получавших неорганическую соль цинка или Zn-ФГСС, а после 8 сут и до окончания эксперимента масса тела животных 1-й группы практически не увеличивалась (прирост составил всего 3%).

Во 2-й и 3-й группах прирост массы тела за период эксперимента составил соответственно 87 и 82% и достоверно не отличался друг от друга. Полученные результаты позволяют с достаточным основанием предположить, что на протяжении первых 7-8 дней эксперимента дефицит цинка в корме крыс 1-й группы компенсировался за счет физиологической способности организма снижать эндогенные потери цинка при его недостаточном поступлении с пищей.

О выраженной недостаточной обеспеченности цинком животных 1-й группы, т.е. о снижении их цинкового статуса, свидетельствуют результаты определения активности ЩФ (табл. 3), которая, являясь цинкзависимым ферментом, наиболее адекватно, по мнению ряда исследователей, реагирует на обеспеченность организма животного цинком [9, 10].

Активность ЩФ в сыворотке крови крыс 1-й группы оказалась почти в 2,5 и в 1,8 раза ниже (р<0,05) аналогичного показателя для крыс 3-й и 2-й групп, которые соответственно получали органическую или неорганическую формы цинка.

Одновременно активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс 2-й группы была достоверно ниже по сравнению с таковой у животных 3-й группы (p<0,05), получавших Zn-ФГСС. Этот результат при практически одинаковом потреблении цинка с водой животными 2-й и 3-й групп (разница недостоверна, p>0,05) (табл. 4) свидетельствует о лучшем, на наш взгляд, усвоении органической формы цинка, что может служить дополнительным аргументом в пользу преимуществ потребления органических соединений этого микроэлемента.

Данные тестирования рефлексов по длительности ЛП перехода животными в темный отсек представлены в табл. 4.

Как свидетельствуют представленные результаты при 2-м тестировании, нахождение на цинкдефицитном рационе привело к достоверному увеличе- нию латентного периода перехода в темный отсек для животных контрольной, 1-й, группы. Очевидно, потребление крысой в течение 14 сут цинкдефицитного корма, приводящее к резкому снижению обеспеченности животного цинком, ухудшает воспроизведение безусловного рефлекса (фотофобии). У животных опытных 2-й и 3-й групп, потреблявших цинк в количествах, обеспечивающих физиологическую потребность в этом ЭМ, безусловный рефлекс сохранялся в полном объеме.

Согласно полученным на третьем этапе данным тестирования УРПИ можно судить о том, что приобретенный крысами навык пассивного избегания остается сохранным через 24 ч после обучения для животных всех групп (ни одно животное не вошло в клетку) независимо от количества и формы потребляемого микроэлемента. В процедуре угасания через 96 ч после обучения (18-е сутки эксперимента) также наблюдалось длительное сохранение воспроизведения условного рефлекса на сформированном уровне у животных всех групп.

Содержание кортикостерона в сыворотке крови стрессированных на 18-е сутки крыс достоверно не отличалось во всех группах и составило соответственно 20,7±7,2; 21,5±6,3 и 22,1±6,5 нг/мл.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния обеспеченности цинком и вида потребленного цинка на изученные показатели УРПИ и содержание кортикстерона в крови стрессированных животных в условиях проведенного эксперимента.

Проведенные исследования подтверждают опубликованные нами ранее данные по биодоступности некоторых новых пищевых источников органически связанных форм цинка, обобщенные в монографии [6]. В этих публикациях было показано достоверное снижение цинкового статуса, в том числе задержка в росте массы тела крыс, получавших корм с выраженным дефицитом цинка. Также было показано, что при последующем добавлении в корм цинка в виде комплекса с ферментативным гидролизатом белков коро- вьего молока в течение 14 дней (восстановительное 2-недельное кормление) обеспеченность животных этим ЭМ возрастала, что приводило к увеличению массы тела. При этом у животных другой группы, получавших параллельно в тех же условиях сульфат цинка, масса тела была достоверно ниже, а содержание цинка в костях определялось на том же уровне, что и у крыс, получавших дефицитный по цинку рацион в течение 28 дней [7].

Таким образом, установленная в опытах in vivo высокая биодоступность полученного комплекса Zn-ФГСС свидетельствует о его перспективности для использования в биологически активных добавках к пище и специализированных пищевых продуктах, предназначенных для восполнения микроэлементной недостаточности.

Литература

1. Буреш Ян. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высшая школа, 1991. - Гл. 3. - С. 182-186.

2. Зорин С.Н. Ферментативные гидролизаты пищевых белков и органические комплексы эссенциальных микроэлементов на их основе // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 6. - С. 60-66.

3. Зорин С.Н., Баяржаргал М. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков с использованием некоторых коммерческих ферментных препаратов и различных схем проведения гидролиза // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55, вып. 1. - С. 73-80.

4. Зорин С.Н., Баяржаргал М., Бурдза Е.А., Мазо В.К. Получение и характеристика ферментативного гидролизата изолята соевых белков // Вопр. питания. - 2006. - Т. 76, № 1. - С. 10-12.

5. Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Смирнова А.А. и др. Оптимизация аминокислотного состава белково-пептидных продуктов, используемых при изготовлении функциональных напитков // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 3. - С. 30-34.

6. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Ширина Л.И. Новые пищевые источники эсссенциальных микроэлементов-антиоксидантов. - М., 2009. - 207 с.

7. Баяржаргал М., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Изучение биодоступности нового пищевого источника цинка // Вопр. детской диетологии. - 2007. - Т. 5, № 2. - С. 11-14.

8. Mazo V.K., Gmoshinski I.V., Zorin S.N. New food sources of essential trace elements produced by biotechnology facilities//Biotechnol. J. - 2007. - Vol. 2, Issue 10. - Р. 1297-1305.

9. Prasad A.S. Laboratory diagnosis of zinc deficiency // J. Am. Coll.Nutr. - 1985. - Vol. 4, N 6. - P. 591-598.

10. Windisch W. Development of zinc deficiency in 65Zn labeled, fully grown rats as a model for adult individuals // J. Trace Elem. Med. Biol. - 2003. - Vol. 17, N 2. - P. 91-96.