Изучение особенностей микробной контаминации свежих овощей и листовых салатов промышленного изготовления

Резюме

Проведены микробиологические исследования уровней контаминации и видового состава бактерий семейства Enterobacteriaceae в свежих овощах и листовых салатах. Объектами исследования были образцы новых видов сырых овощных продуктов - салаты 8 видов, нарезанные овощи и их смеси, отобранные на основных этапах производства, включая антимикробную обработку гипохлоритом натрия, мойку и упаковку продукции в пленки под вакуумом. Анализ уровня загрязненности овощной и салатной продукции энтеробактериями показал, что их удельный вес в общей сумме микробных контаминантов достаточно высок. Содержание энтеробактерий варьировало в пределах от 2,14 до 3,34 lg КОЕ/г, достигая в отдельных пробах значений 4,38-4,74 lg, сопоставимых с общим количеством посторонней бактериальной микрофлоры (КМАФАнМ) в тех же пробах. Установлено значительное видовое разнообразие микрофлоры, контаминирующей овощную продукцию. В пробах были обнаружены бактерии родов Enterobacter, Pantoea, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas, Kluyvera, Klebsiella, Escherichia, Rahnella, Acinetobacter. Наиболее часто в салатах и овощах резаных обнаруживались Enterobacter spp. - 37% культур и Pantoea spp. - 25%. Полученные данные о характере микробной контаминации овощной и салатной продукции свидетельствуют о необходимости контроля не только санитарно-показательных групп колиформных бактерий, являющихся традиционно индикатором фекального загрязнения сырья, но и о целесообразности нормирования всей группы Enterobacteriaceae.

Ключевые слова:овощи и салаты листовые промышленного изготовления, микробная контаминация, энтеробактерии, бактерии группы кишечных палочек, пищевые патогены, антимикробная обработка

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 33-42.

В последние годы регистрируется значительное число вспышек пищевых токсикоинфекций, связанных с употреблением свежих овощных салатов, пророщенных семян злаковых и бобовых культур, непастеризованных фруктовых соков, загрязненных в процессе сбора урожая, приготовления и хранения готовой продукции [10, 13-15, 18]. Возрастающая значимость этих продуктов как потенциальных факторов передачи возбудителей пищевых токсикоинфекций показала необходимость детального изучения характера микробной контаминации блюд из сырых овощей, предназначенных для непосредственного употребления в пищу [8, 9, 11, 12, 16, 19, 20]. Появление на российском потребительском рынке новой группы пищевой продукции - листовых салатов, свежих резаных овощей - определили целесообразность детального анализа микробиологических рисков, возникающих на этапах обработки, упаковки, транспортировки и хранения этих продуктов. Актуальность исследований обусловлена также необходимостью оценки влияния на микрофлору таких продуктов новых технологий антимикробной обработки сырья, автоматизированной нарезки и мойки продукции, упаковки свежих салатов и овощей в герметизированную тару.

Действующие в настоящее время микробиологические нормативы безопасности овощной продукции были разработаны с учетом традиционных подходов к заготовке, хранению, переработке и реализации сельскохозяйственной продукции.

Они предназначались в первую очередь для свежих цельных овощей (в том числе листовых салатов) или для бланшированных и быстрозамороженных овощей. При обосновании этих нормативов не учитывались микробиологические риски, связанные со значительным увеличением сроков годности свежих резаных салатов и овощей, с применением режимов холодильного хранения и новых видов упаковки, ограничивающих доступ кислорода.

В данной работе проведено изучение фактической микробной контаминации новой группы растительных продуктов - свежих овощей и салатов, готовых к употреблению, - на основных этапах обработки сырья, производства и хранения готовой продукции.

Микробиологические исследования включали количественное определение мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, бактерий семейства Enterobacteriaceae, включая колиформы и Escherichia coli. В задачи исследования также входила оценка видового состава микрофлоры, контаминирующей эти виды продукции, и его изменений под влиянием технологической обработки.

Материал и методы

Объектами исследования стали пробы свежих салатов и овощей резаных, отобранные в условиях действующего производства на этапах получения сырья, обработки, упаковки, транспортирования, хранения и реализации. Исследованные виды продукции включали салат Айсберг резаный, смесь листовых салатов и резаной мор- кови, лук репчатый резаный. Всего исследовано 200 проб продукции.

Подготовку проб к анализу проводили по ГОСТ ISO 7218-2011 и ГОСТ 26669-85 [1, 2]. Общее количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.15-94 [3]. Бактерии семейства Enterobacteriaceae определяли по ГОСТ Р 54005-2010 [4] с использованием селективной дифференциально-диагностической среды для выделения и учета энтеробактерий в пищевых продуктах - глюкозного агара с кристаллическим фиолетовым, нейтральным красным и желчью (VRBD-агар, "Мерк", Германия), видовую принадлежность выделенных штаммов энтеробактерий устанавливали при использовании биохимических тест-систем "АРI 20Е", "Rapid 20E", "API 10S", "API 50 CHE" ("БиоМерье", Франция).

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) и Escherichia coli определяли по ГОСТ Р 52816-2007, ГОСТ 30726-2001, ГОСТ Р 52830-2007 и с использованием биохимических тест-систем "АРI 20Е", "Rapid 20E" ("БиоМерье", Франция).

Для определения общего количества бактерий семейства Enterobacteriaceae и, отдельно, уровней загрязнения колиформными бактериями проводили параллельно посев десятикратных разведений продуктов на поверхность селективных дифференциально-диагностических сред VRBD-агар и агар Эндо с подсчетом всех типичных колоний (энтеробактерии на VRBD-агаре - красно-фиолетовые колонии с зоной преципитации, лактозоположительные БГКП на агаре Эндо - красные, малиновые и с металлическим блеском колонии).

Антимикробную обработку салатной и овощной продукции проводили в ваннах контактной очистки и охлаждения с применением хлорсодержащих дезинфицирующих средств на основе гипохлорита натрия с концентрацией активного хлора в растворе для мытья 50-150 мг/дм3.

Количественные уровни микроорганизмов в исследуемых образцах выражали в КОЕ/г продукта, полученные значения переводили в логарифмические единицы (lg КОЕ/г). Данные о присутствии колиформных бактерий, в том числе E.coli, в определенной массе продукта, выраженные в альтернативной форме ("обнаружены" или "не обнаружены"), переводили в число КОЕ/г согласно D. Mossel [17].

Изменения количества микрофлоры выражали в величинах прироста уровня lg КОЕ/г как разницу между предыдущим и текущим значением среднего арифметического (М) каждой выборки проб.

Результаты

Оценку уровней микробной контаминации проводили в процессе технологической обработки сырья, полуфабрикатов и в готовой продукции, определяя общее количество микрофлоры - КМАФАнМ (табл. 1).

Количественная оценка микробной загрязненности проб сырья показала, что салаты и овощи до обработки характеризовались высокой гетерогенностью контаминации - показатель КМАФАнМ в исследованных пробах колебался от 2,85 до 7,07 lg КОЕ/г, при этом в отдельных видах полуфабрикатов средние значения также достигали значительного уровня (6,45±0,20 lg КОЕ/г).

После предварительной мойки и антимикробной обработки уровень КМАФАнМ для листовых салатов снижался в среднем на 1 порядок.

В то же время снижение КМАФАнМ после обработки гипохлоритом овощных полуфабрикатов (корнеплодов) было менее выраженным в сравнении с листовыми салатами и составляло для моркови 0,44 Δlg КОЕ/г, а для лука репчатого только 0,13 Δlg КОЕ/г.

Исследования готовой продукции на момент окончания технологического процесса показали 100% соответствие проанализированных проб установленному нормативу по показателю КМАФАнМ (5×105 КОЕ/г или 5,7 lg КОЕ/г, не более). При этом величины КМАФАнМ для двух видов - салата Айсберг и лука репчатого после вакуумирования не превышали 4,0 lg КОЕ/г. Значительная исходная обсемененность сырьевых компонентов салатов, а также недостаточная эффективность дезобработки определили изначально высокий уровень микробной загрязненности многокомпонентной салатной смеси, среднее значение для которой после вакуумирования составило 4,70 lg КОЕ/г.

Полученные данные показали целесообразность анализа влияния условий и длительности хранения на показатели микробной контаминации готовой овощной продукции. С этой целью были проведены исследования образцов нескольких партий продукции в процессе хранения в двух вариантах:

1) в условиях постоянного контроля температуры и при отсутствии транспортировки (в лаборатории);

2) в процессе продвижения продукции от склада изготовителя до мест реализации.

В табл. 2 приведены сравнительные данные изменения величин КМАФАнМ овощной и салатной продукции в процессе хранения.

При хранении в обоих вариантах происходит повышение уровня общей микробной обсемененности всех видов салатной продукции. Если после 2-суточного хранения все исследованные пробы соответствовали установленным требованиям по данному показателю (величины lg КОЕ/г не превышали 5,7), то после 4 сут уровень КМАФАнМ превышал норматив в 7 из 18 образцов (38,9%). После 7 сут хранения число забракованных проб составляло 50%, а величины загрязненности на 1-1,5 логарифмических порядка превышали норму.

Интенсивность нарастания микробных популяций в процессе хранения салатов и овощей при заданных температурных режимах (в условиях лаборатории) показаны в табл. 3. Наиболее интенсивно изменение величины КМАФАнМ происходит на 3-4-е сутки хранения - в среднем в 10 раз, а при дальнейшем хранении образцов увеличения количества микрофлоры уже не происходит: к 7-м суткам наблюдений величина Δlg КОЕ/г была отрицательной и составляла -0,22. Это свидетельствует о переходе популяций в стационарную фазу роста.

Сопоставление скорости изменения уровней контаминации в двух вариантах хранения (на оптовом складе и в местах реализации в сравнении с контрольными лабораторными пробами) показало, что величины КМАФАнМ в исследованных образцах нарастали практически одинаково (рис. 1).

Результаты определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae и колиформных бактерий в салатах и овощах резаных, отобранных на основных этапах производства, представлены в табл. 4 (средние величины по группам продукции).

Энтеробактерии, и в том числе БГКП, обнаруживали в большинстве образцов сырья в количестве, превышающем норматив (менее 100 КОЕ/г): из 30 исследованных проб салатов и овощей Enterobacteriaceae были обнаружены в 23 образцах (77%), а БГКП - в 22 (73%). Наиболее высокая степень контаминации энтеробактериями была выявлена в смеси листовых салатов (3,69±0,39 lg КОЕ/г); в среднем величина этого показателя для компонентов салата "Ассорти" составила 3,46±0,27 lg КОЕ/г.

Колиформные бактерии выявлялись в сырье с той же частотой во всех исследованных группах продукции.

При оценке эффективности воздействия раствора гипохлорита натрия на энтеробактерии при обработке овощного сырья было показано, что их численность снижалась в среднем на 0,44 lg КОЕ/г, а содержание колиформ - на 0,28 lg. При этом были отмечены те же различия в воздействии на овощи и листовые салаты, что и для показателя КМАФАнМ: обработка лука и моркови фактически не приводила к достоверному снижению количества энтеробактерий, в том числе БГКП, а обработка листовых салатов была более эффективной, так как позволяла снизить уровни энтеробактерий практически в 10 раз (в среднем на 0,96 lg).

Количество бактерий семейства Enterobacteriaceae в исследованных пробах готовой продукции (после вакуумирования) колебалось в пре- делах от 100 КОЕ/г до 1×105 КОЕ/г и достигало высоких значений независимо от вида продукта; значения М для салатов "Айсберг", "Ассорти" и лука составили 2,51, 2,81 и 3,34 lg КОЕ/г соответственно.

По показателю количества колиформных бактерий большинство исследованных проб не отвечали требованиям, установленным для овощной и салатной продукции: при нормативе отсутствия БГКП в 0,01 г (менее 2,0 lg КОЕ/г) этим значениям соответствовали только 8 проб из 18 образцов (44,4%). Наиболее высокая степень загрязненности колиформами была выявлена при исследовании лука репчатого: в 5 пробах из 6 были обнаружены БГКП.

В целом анализ уровня загрязненности овощной и салатной продукции бактериями семейства Enterobacteriaceae показал, что их удельный вес в общей сумме микробных контаминантов достаточно высок. На рис. 2, иллюстрирующем сопоставление уровней контаминации готовых салатных смесей и лука репчатого по показателям КМАФАнМ, Enterobacteriaceae и БГКП, показано, что среднее содержание энтеробактерий находилось в пределах от 2,14 до 3,34 lg КОЕ/г, достигая в отдельных пробах значений 4,38-4,74 lg, сопоставимых с уровнем КМАФАнМ в тех же пробах.

Учитывая повсеместное возрастание рисков для здоровья, обусловленных потреблением сырой и минимально обработанной овощной продукции, загрязненной патогенными энтеробактериями [5-7], данные результаты свидетельствуют о необходимости ревизии применяемых технологических режимов обработки и мойки овощного сырья, в первую очередь о целесообразности подбора средств деконтаминации овощной продукции более эффективных в отношении микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.

Результаты исследований по показателям содержания бактерий семейства Enterobacteriaceae и БГКП упакованной под вакуумом салатной и овощной продукции в процессе хранения в двух вариантах (в контролируемых условиях и в процессе реализации) представлены в табл. 5.

В процессе хранения в течение 7 сут во всех видах овощной и салатной продукции наряду с повышением уровня общей микробной обсемененности (табл. 3) происходило и нарастание количества энтеробактерий. Усредненные по группам продукции результаты анализа контрольных проб на наличие Enterobacteriacaeae (1 вариант хранения) представлены на рис. 3.

Полученные для колиформных бактерий результаты при их количественной оценке (выраженной в lg КОЕ/г) также достаточно четко совпадали с тенденцией нарастания общего микробного числа (рис. 4).

Микробиологический анализ образцов растительных продуктов, отобранных в процессе хранения на оптовом складе и в местах реализации, не выявил существенных различий с аналогичными пробами салатов и овощей, хранившихся в контролируемых лабораторных условиях как по абсолютным величинам контаминации кишечной микрофлорой на 2, 4 и 7-е сутки наблюдения, так и по значениям прироста этих показателей Δlg КОЕ/г (рис. 5).

Таким образом, использованные технологии производства, упаковки и хранения свежих овощей, листовых салатов и их смесей не обеспечивают полную деконтаминацию и не предотвращают размножение микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, в том числе БГКП. Численность этих микроорганизмов после 2-суточного хранения увеличивалась в среднем на порядок как в лабора- торных, так и в промышленных условиях оптовых складов. По-видимому, этому способствует изначально высокий уровень загрязнения колиформами (55,6% проб непосредственно после выработки содержали более 100 КОЕ/г).

Выделенные в ходе исследований растительных продуктов энтеробактерии по комплексу морфологических и культурально-биохимических признаков были идентифицированы как аэробные грамотрицательные микроорганизмы семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadoceae и соответствовали таксономическим характеристикам родов Enterobacter, Pantoea, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas, Kluyvera, Klebsiella, Escherichia, Rahnella, Acinetobacter, то есть наряду с колиформами из данной продукции выделяли представителей других групп энтеробактерий, в том числе не ферментирующих лактозу. Наиболее часто в салатах и овощах обнаруживались бактерии рода Pantoea - 25% культур и колиформные Enterobacter cloacae - 21,6%. Достаточно широко были представлены и другие виды условно-патогенных колиформных бактерий, такие как C. freundii (10,2%), E. aerogenes (6,8%) и E. vulneris (5,7%). Бактерии рода Pseudomonas выявлялись в 9,1% образцов. Бактерии Escherichia coli были обнаружены в 1 пробе смеси листовых салатов после обработки гипохлоритом (в 0,1 г продукта, частота их обнаружения в данном исследовании составила 0,75%). Однако обращает на себя внимание факт выделения E. coli из салатов после обработки гипохлоритом, поскольку, как правило, высокой устойчивостью в окружающей среде отличаются эшерихии, обладающие факторами патогенности.

В целом полученные данные о характере микробной контаминации овощной и салатной продукции свидетельствуют не только о необходимости контроля группы колиформных бактерий, являющихся традиционно индикатором фекального загрязнения сырья, но и о целесообразности нормирования всей группы Enterobacteriaceae, многие представители которой, относящиеся к условно- патогенным и патогенным видам бактерий, обладают способностью длительного вегетирования в растительных экосистемах.

Результаты проведенных исследований послужили обоснованием разработки проекта Дополнений в Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции". В проекте устанавливаются требования безопасности по микробиологическим показателям для новой группы пищевой продукции - овощей и салатов свежих охлажденных промышленного производства, упакованных в полимерные пленки и готовых к употреблению.

Данным документом для овощной и салатной продукции свежей промышленного производства в герметичной упаковке предусмотрено введение новых показателей безопасности - нормативов отсутствия E. coli в 1 г продукта и количества бактерий семейства Enterobacteriaceae взамен БГКП.

Литература

1. ГОСТ ISO 7218-2011 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

2. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготов ка проб для микробиологических анализов".

3. ГОСТ 10444.15 "Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов".

4. ГОСТ Р 54005-2010 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae ".

5. Ефимочкина Н.Р. Микробиология пищевых продуктов и современные методы детекции патогенов. - М.: Издательство РАМН, 2013. - 517 с.

6. Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А., Куваева И.Б. и др. Индикация и серологический скрининг условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из продуктов питания и объектов внешней среды // Вопр. питания. - 2002. - № 6. - С. 29-34.

7. Шевелева С.А. Микробиологическая безопасность пищевых продуктов и факторы окружающей среды // Вестн. РАМН. - 2006. - № 5. - С. 56-62.

8. Breidt F., Caldwell J.M. Survival of Escherichia coli O157:H7 in cucumber fermentation brines // J. Food Sci. - 2011. - Vol. 76, N 3. - P. 198-203.

9. Cruz A.T., Cazacu A.C., Allen C.H. Pantoea agglomerans, a plant pathogen causing human disease // J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol. 45, N 6. - P. 1989-1992.

10. Сurran B. et al. Commercial mushrooms and bean sprouts are a source of Pseudomonas aeruginosa // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43. - P. 5830.

11. EFSA Panel on Biological Hazards. Scientific Opinion on the risk posed by Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and other pathogenic bacteria in seeds and sprouted seeds // EFSA J. - 2011. - Vol. 9, N 11. - P. 2424-2524.

12. Frank C. et al. Epidemic profile of Shiga-toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany - preliminary report // N. Engl. J. Med. - 2011 [e-pub, цит. по http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1106483).

13. Gorny J.R. Microbial contamination of fresh fruits and vegetables // Microbiology of Fruits and Vegetables / Eds J.M. Sapers, J.R. Gorny, A.E. Yousef. - Boca Raton, FL: CRC Press, 2006. - P. 3.

14. Januszkiewicz A., Szych J., Rastawicki W. et al. Molecular epidemiology of shiga-toxin producing Escherichia coli household outbreak in Poland due to secondary transmission of STEC O104:H4 from Germany // J. Med. Microbiol. - 2011. - Vol. 60, Pt 12. - P. 1717-1881.

15. Monecke S., Mariani-Kurkdjian P., Bingen E. et al. Presence of Enterohemorrhagic Escherichia coli ST678/O104:H4 in France Prior to 2011 // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - Vol. 77, N 24. - P. 8784-8786.

16. Moosekian S.R., Jeongb S., Ryser E.T. Inactivation of sanitizer-injured Escherichia coli O157:H7 on baby spinach using X-ray irradiation // Food Control. - 2014. - Vol. 36, Issue 1. - P. 243-247.

17. Mossel D.A.A., van Nhtten P. Microbiological reference values for foods: a European perspective // J. Assoc. Off. Anal. Chem. - 1991. - Vol. 74, N 2.

18. Rangel J.M., Sparling P.H., Crowe C. et al. Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 Outbreaks, United States, 1982-2002. CDC // Emerg. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 11, N 4. - P. 603-609.

19. Shah D.H., Shringri S., Besser T.E., Call D.R. Escherichia // Molecular Detection of Foodborne Pathogens / Ed. L. Dongyou. - USA etc.: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2010. - 879 p.

20. Tauxe R.V. Emerging foodborne diseases: An evolving public health challenge // Emerg. Infect. Dis. - 1997. - Vol. 3, N 4.