Болезни органов пищеварения в структуре общей заболеваемости, особенно у детей, занимают одно из первых мест в мире, и общая тенденция к их росту сохраняется [4]. Медико-социальное значение указанной патологии определяется не только значительным распространением в наиболее ответственные периоды роста и развития ребенка, но и хроническим рецидивирующим течением, снижающим качество жизни, формированием осложненных форм заболеваний, в ряде случаев приводящих к инвалидизации. В структуре хронических заболеваний органов пищеварения у детей школьного возраста гастриты занимают второе место [2, 5].
Ведущая роль в профилактике и лечении данного заболевания принадлежит диетотерапии, основ- ные функции которой - устранение дефектов слизистой оболочки желудка (СОЖ) и восстановление ее нормальных функций. Наряду с диетотерапией в последние 10-15 лет появились новые методы лечения гастрита, основанные на применении полипептидов, обладающих тканеспецифическим действием и способных восстанавливать до оптимального уровня метаболизм в клетках тех тканей, из которых они выделены [5, 6].
Поскольку важным продуцентом биоактивных полипептидов является желудок крупного рогатого скота, так называемый железистый желудоксычуг, целью исследования была оценка влияния полипептидов, полученных в результате обработки сычуга, на восстановительные процессы слизистой оболочки желудка лабораторных животных с моделью острого аспиринового повреждения слизистой оболочки желудка.
Материал и методы
Технология выделения биоактивных полипептидов заключалась в измельчении сычуга в промышленной мясорубке "Mainca" PM-70/PM-12 (Испания) с диаметром отверстий решетки 2-3 мм, экстрагировании в физиологическом растворе (содержание хлорида натрия 0,87%) при температуре 22-24 °С в течение 22 ч в лабораторной диспергирующей установке, с верхнеприводной мешалкой и внешней охлаждающей рубашкой (ЛДУ, "Лаботекс", РФ) с частотой вращения 500 об/мин. Далее экстракт фильтровали через ватно-марлевый фильтр и центрифугировали на настольной центрифуге "СМ-6М" ("ELMI", Латвия) в течение 8 мин при частоте вращения 3500 об/мин с целью отделения осадка. Полученный экстракт представлял собой жидкость кремового цвета c массовой долей белка 1,3 г/100 г продукта.
Исследование аминокислотного состава показало высокое содержание глутаминовой кислоты (15,5 г/100 г белка), которая является строительным материалом и поставщиком энергии для СОЖ, усиливает иммунный барьер слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и препятствует проникновению через нее микроорганизмов. В экстракте содержатся витамины (мг/100 г продукта): В6 (0,83±0,04), В1 (0,03±0,002), РР (2,61±0,13). Срок годности 24 ч при 0-4 °С.
Анализ электрофоретического исследования экстракта выявил несколько высокомолекулярных фракций в диапазоне от 72 до 55 кДа. Наиболее заметными были полосы с молекулярными массами 52, 43, 40, 37, 34, 26, 17 кДа; выявлена интенсивная полоса в области 12 кДа и в диапазоне ниже 10 кДа.
Возможно, это указывает на присутствие в экстрактах различных эндопротеиназ [ренина (37 кДа), пепсина (32,7 кДа), трипсина и химотрипсина (25 кДа)], проферментов или зимогенов [например, пепсиногена, трипсиногена (42,5 кДа)], гормонов [гастрин, холицистин, секретин (от 4,2 до 2 кДа)].
Экспериментальные исследования проведены на 44 половозрелых белых крысах-самцах стока Вистар (масса тела 230±20 г), полученных из филиала "Андреевка" ГУ НЦБМТ РАМН (Московская область, Солнечногорский район, п. Андреевка). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных", Международных рекомендаций (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных.
Животные содержались в клетках TECNIPLAST тип IV S в стандартных условиях вивария при сходных условиях в отношении температуры (23±2 °С), влажности (48±2%), освещения (с 6.00 до 18.00), при свободном доступе к воде и пище [3].
Эксперимент длился 22 дня; в течение этого срока животные получали полноценный стандартный рацион вивария по ГОСТ Р 50258-92. Крысы были рандомизированно по массе распределены на 4 группы (контрольная и 3 опытных). 1-я группа состояла из интактных животных, потреблявших на протяжении всего эксперимента стандартный рацион вивария. Животным 2-4-й опытных групп с 1-х по 7-е сутки эксперимента проводили моделирование аспиринового повреждения СОЖ по классической схеме, путем внутрижелудочного введения ацетилсалициловой кислоты из расчета 300 мг/100 г массы тела 1 раз в сутки [7, 8].
После завершения моделирования, с 8-х по 22-е сутки, животным внутрижелудочно через зонд вводили исследуемые образцы по 2 мл/сут на голову по схеме: 2-й группе животных - дистиллированную воду; 3-й группе - нативный экстракт сычуга; 4-й группе - термообработанный экстракт сычуга.
На протяжении всего эксперимента вели наблюдение за состоянием животных (поедаемостью корма, поведением, состоянием шерстного покрова, наличием или отсутствием диареи) и массой их тела, которую определяли с помощью электронных технических весов "Ohaus" ("Adventurer Pro", США) с точностью ±0,1 г. По окончании эксперимента производили забор крови и патологоанатомическое вскрытие. Макроскопически оценивали состояние внутренних органов, определяли абсолютную массу печени, почек, селезенки, сердца путем взвешивания на электронных весах ("AcculabVicon", США) с точностью ±0,001 г, после чего рассчитывали относительную массу внутренних органов (в % от общей массы тела животного [8, 9]). Общее клиническое исследование проб крови проводили на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе "Abacusjuniorvet 2.7" ("Diatron Messtechnik GmbH", Австрия), используя наборы реактивов ("Diatron", Австрия). В крови животных определяли 18 показателей, представленных в табл. 1.
Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе ("Bio Chem SA", США), используя наборы реактивов ("High Technology", США). В крови животных определяли: содержание общего белка, альбумина, билирубина общего, билирубина прямого, креатинина, мочевины, холестерина, триглицеридов, активность АСТ, АЛТ, ЛДГ, щелочной фосфатазы.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.0, с применением t-критерия Стьюдента, статистически достоверными считали различия при p<0,05.
Математическая обработка данных включала расчет средних значений со стандартными ошибками (M±m).
Результаты и обсуждение
Наблюдения за интактными животными (1-я группа) не выявили никаких отклонений - состояние животных на протяжении всего эксперимента находилось в пределах физиологической нормы.
При моделировании аспиринового повреждения СОЖ у животных 2-4-й групп начиная с 3-х суток отмечалось угнетенное состояние, снижение двигательной активности, размягчение кала и частая дефекация, в остальном состояние животных находилось в пределах физиологической нормы.
На 7-е сутки моделирования был произведен забой 5 крыс из 2-4-й групп выборочно, при проведении аутопсии наблюдалось вздутие желудочно-кишечного тракта, в особенности желудка и тонкого кишечника, макроскопическое исследование органов желудочно-кишечного тракта выявило наличие точечных геморрагий в пилорической части и дна желудка размером 0,3-0,6 мм.
Наблюдение за динамикой изменения массы тела лабораторных животных в ходе эксперимента (рис.) показало, что животные 1-й группы (интактные) набирали массу тела в среднем по 3-5 г/сут. Животные 2-й группы, не получавшие лечения после моделирования аспиринового повреждения СОЖ, с 1-х по 7-е сутки теряли в массе тела (до 10 г/сут), начиная с 9-х суток и до окончания эксперимента наблюдалось некоторое увеличение массы тела.
У животных 3-й и 4-й групп начиная с первых суток отмечено аналогичное снижение массы тела, при этом, начиная с 9-х суток, животные этих групп достаточно стабильно набирали массу тела, на 21-е сутки масса тела животных незначительно превышала первоначальный показатель.
Максимальный прирост массы тела отмечен у интактных животных (1-я группа) - 15,2%.
У животных 3-й группы он составил 3,3%, у крыс 4-й группы - 2,05%. У животных с моделью аспиринового повреждения СОЖ по окончании эксперимента был отмечен отрицательный прирост массы тела (-18,2%).
Анализ результатов гематологического исследования крови животных 2-й группы, которым после воспроизведения заболевания вводили дистиллированную воду, показал увеличение количества лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов. Содержание эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов достоверно не отличалось от показателей интактных животных. При анализе гематологических показателей крови животных 3-й и 4-й группы, которым после моделирования вводили исследуемые образцы полипептидов, была выявлена нормализация содержания лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и моноцитов, что косвенно свидетельствует о восстановлении состояния животных после перенесенного заболевания (табл. 1).
Результаты биохимического исследования сыворотки крови крыс представлены в табл. 2.
У животных 2-й группы после моделирования аспиринового повреждения СОЖ в сыворотке крови (табл. 2) отмечены достоверно сниженные уровени общего белка на 7% и альбумина на 25%, а содержание глюкозы, общего билирубина, холестерина, триглицеридов и активность щелочной фосфатазы, гамма-глутаминтрансферазы очень высокое. Снижение содержания белка, в том числе альбуминовой фракции, косвенно указывает на обезвоживание организма, являющееся следствием диареи. Увеличение активности АСТ, щелочной фосфатазы и гамма-глутаминтрансферазы в 1,3-1,4 раза и концентрации глюкозы, общего билирубина, холестерина и триглицеридов можно связать с повреждающим фактором аспириновой кислоты на печень экспериментальных животных [10].
При сравнительном анализе основных биохимических показателей сыворотки крови животных, в рацион которым вводили исследуемые образцы (3-я и 4-я группы), относительно показателей животных 2-й группы можно отметить положительную тенденцию. Так, отмечено снижение концентрации общего билирубина, холестерина, триглицеридов, активности гамма-глутаминтрансферазы, АСТ, щелочной фосфатазы у животных 2-й и 3-й групп по сравнению с показателями животных с моделью повреждения СОЖ; нормализация содержания общего белка, в том числе альбуминовой фракции, а также глюкозы (табл. 2).
Эти данные, по-видимому, свидетельствует о нивелировании патологических процессов, а также о нормализации метаболизма в организме животных, которым вводили как нативный, так и термообработанный экстракт сычуга.
Патологоанатомическое исследование животных 1-й группы не продемонстрировало никаких внешних проявлений воспалительных или иных патологических процессов во внутренних органах (пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени, дыхательной системе, органах кровообращения и кроветворения, мочевыделительной системе). Печень и селезенка имели однородный насыщенный бордовый цвет и упругую консистенцию. У животных с аспириновым повреждением СОЖ, получавших дистиллированную воду (2-я группа), выявлены следующие макроскопические изменения: слизистая оболочка желудка отечная, сглаженная, гиперемированная, в 100% случаях обнаруживаются точечные кровоизлияния в области дна желудка, в 70-60% - эрозии, сохраняются язвенные дефекты.
Исследование внутренних органов животных 3-й и 4-й групп показало, что слизистая и подслизистая оболочка желудка складчатая, явления отечности, гиперемии отсутствовали, каких-либо изменений слизистой, покровного и железистого эпителия не отмечалось.
В результате проведенных исследований показано, что экстракты сычуга как в нативном, так и в термообработанном виде оказывают терапевтическое действие на организм животных при моделировании аспиринового повреждения СОЖ. Экстракты способствуют нормализации биохимических показателей крови, сохранению складчатости слизистой, предотвращают дальнейшее развитие деструктивных изменений покровного и железистого эпителия: оказывают стимулирующее влияние на регенераторные процессы структурно-функциональной организации СОЖ.
Выявленный нами терапевтический эффект экстрактов сычуга при воздействии химических повреждающих агентов на СОЖ, возможно, обусловлен содержанием в экстрактах целого комплекса биологически активных веществ, в том числе проферментов. Дополнительным фактором является усиление местного синтеза простагландинов, способных улучшать микроциркуляцию в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта.
Литература
1. Александрова Ю.Н. О системе цитокинов // Педиатрия - 2007. - Т. 86, № 3. - С. 124-128.
2. Баранов А.А., Щербаков П.Л. Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии // Вопр. соврем. педиатрии. - 2002. - Т. 1, № 1. - С. 12.
3. Бекетова Н.А., Кравченко Л.В., Кошелева О.В. и др. Влияние биологически активных соединений индол-3 карбинола и рутина на обеспеченность крыс витаминами А и Е при различном содержании жира в рационе // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 2. - С. 23-30.
4. Волков А.И., Усанова Е.П. Динамика эпидемиологических показателей за болеваемости органов пищеварения у детей // Тезисы докладов Всероссийского совещания "Детская гастроэнтерология: настоящее и будущее". - М., 2002. - С. 54-55.
5. Волынец Г.В., Гаранжа Т.А., Сперанский А.И. и др. Этиологическая характеристика основных типов хронического гастрита у детей // Рус. мед. журн. - 2005. - Т. 13, № 18. - С. 1208-1214.
6. Ерпулева Ю.В. Смеси на основе пептидов у больных с патологией желудочно-кишечного тракта: современные позиции // Лечащий врач. - 2008. - № 2 . - С. 80-82.
7. Максарова Д.Д. Оценка эффективности действия цеолита на течение аспиринового повреждения слизистой оболочки желудка у крыс // Вестник Бурятского государственного университета -2009. Вып. 4. Биология, география. - С. 83-85.
8. Максарова Д.Д. Модифицированное фитобактериальное средство при аспириновом повреждении слизистой оболочки желудка белых крыс // Вестник Бурятского государственного университета - 2012. Вып. 4. - С. 220-225.
9. Полтырев С.С., Курцин И.Т. Физиология пищеварения. - М.: Высшая школа, 1980. - С. 256.
10. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Герман C.B. и др. Эндогенные пептиды и гомеостаз слизистой оболочки желудка // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты). Материалы I Российского конгресса по патофизиологии. - М., 9-12 окт. 2000. - С. 133.
11. Сурменёв Д.В., Баженов С.М., Дубенская Л.И., Ермачкова Е.Н. Показатели периферической крови как маркёры хронических воспалительных заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта // Математическая морфология. Электронный математический и медико-биологический журнал. - 2010. - Т. 9, вып. 3. - С. 12.