Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс

Резюме

Исследовано влияние витаминной обеспеченности растущих крыссамцов линии Вистар (n=21) с исходной массой тела 53,5±0,9 г на их устойчивость к однократному стрессу - воздействию электрическим током. Крысы контрольной группы в течение 21 дня получали полноценный полусинтетический рацион, обеспечивающий поступление витаминов в адекватном количестве. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в 5 раз в корме количества витаминной смеси и полным исключением из нее витамина Е. На 21-й день, за сутки до забоя, крыс обеих групп подвергали стрессорному воздействию (электрокожное раздражение лап, сила тока 0,4 мА в течение 8 с) и помещали в метаболические клетки для сбора мочи на 16 ч. К концу эксперимента животные с сочетанным дефицитом витаминов отставали в росте. Содержание в печени у крыс этой группы витаминов В2, А, В1 и Е уменьшалось в 1,6, 2,3, 4,4 и 15 раз. Концентрация в плазме крови ретинола достоверно снижалась на 18%, α-токоферола - в 5 раз, экскреция с мочой рибофлавина и метаболита витамина В6 - 4-пиридоксиловой кислоты достоверно уменьшалась в 6,5 и 2,46 раза. Концентрации малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и соотношение окисленной и неокисленной формы 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина в моче у крыс обеих групп практически не различались. Экскреция с мочой стрессбиомаркера и стресс-медиатора кортикостерона у крыс с полигиповитаминозом в 2,5 раза превышала его выведение у обеспеченных витаминами крыс. Таким образом, снижение витаминной обеспеченности приводило к увеличению содержания в моче стрессированных крыс кортикостерона, характеризующего интенсивность протекания общего адаптационного синдрома. Этот факт свидетельствует о важной роли оптимальной обеспеченности организма витаминами в неспецифической (общей) резистентности к стрессорным воздействиям.

Ключевые слова:дефицит витаминов, стресс, электрокожное раздражение, кортикостерон, крысы

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 20-25.

Сопротивляемость организма к самым разнообразным повреждающим воздействиям в значительной степени определяется его обеспеченностью макро- и микронутриентами. Не вызывает сомнений участие в процессах регуляции и адаптации витаминов как естественных метаболитов, способных усиливать функции защитных систем организма при стрессе [13, 15]. Так, уровень стресс-биомаркера и стресс-медиатора кортикостерона в плазме крови крыс при дефиците витамина А увеличивался на 38% [16]. Как при изолированном дефиците витаминов С, А, Е, В1, В6, так и при сочетанном недостатке в рационе всех витаминов повреждающее действие на систему антиоксидантной защиты организма носит более выраженный характер по сравнению с ответом на стресс у животных, обеспеченных витаминами [11]. Диетическая коррекция витаминного статуса способствует восстановлению адаптационного потенциала организма - неспецифической (общей) способности сопротивляться неблагоприятным факторам различной природы [17]. Развитие стресса в свою очередь приводит к ухудшению витаминного статуса организма (витамины Е, А, С) [11]. Например, истощающая физическая нагрузка в ходе интенсивных тренировок и спортивных соревнований может усиливать окислительный метаболизм, сопровождающийся в организме окислительным стрессом и повышенным расходом витаминовантиоксидантов [3]. К сожалению, в современных условиях среди населения России достаточно часто встречается одновременная недостаточность сразу нескольких витаминов [8]. Такого рода поливитаминная необеспеченность может быть промоделирована в экспериментах in vivo c использованием лабораторных животных (растущих крыс) [6].

Целью исследования была оценка влияния недостаточной витаминной обеспеченности на некоторые показатели протекания общего адаптационного синдрома в условиях стресса, моделируемого воздействием электрическим током.

Материал и методы

Исследования выполнены на растущих крысахсамцах линии Вистар (n=21) с исходной массой тела 53,5±0,9 г (47,0-60,5 г), полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая". Содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.).

На протяжении всего эксперимента крысы содержались индивидуально в клетках из прозрачного полимерного материала (высокотемпературного полисульфона) при приглушенном естественном освещении (средняя продолжительность светового дня составила 12,1 ч), относительной влажности воздуха 40-60%, температуре 23±2 °С. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к воде. Животные были рандомизированы по массе тела на 2 группы: контрольную (n=10) и опытную (n=11). Продолжительность эксперимента составила 22 сут.

В течение первых 3 сут все животные получали полноценный полусинтетический рацион [4], содержащий 20% казеина по ГОСТ 53667-2009 (содержание белка 82-84%), 64% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% стандартной солевой смеси, 2% микрокристаллической целлюлозы, 1% сухой витаминной смеси, 0,30% L-цистеина, 0,25% холина битартрата.

В течение последующих 18 сут крысы контрольной группы продолжали получать полноценный полусинтетический рацион, обеспечивающий поступление с рационом витаминов в адекватном количестве. Полигиповитаминоз у крыс опытной группы вызывали уменьшением в корме количества витаминной смеси в 5 раз и полным исключением из нее витамина Е [6]. Поступление витамина Е крысам опытной группы обеспечивалось за счет естественного содержания токоферолов в подсолнечном масле и составило 2,2 МЕ на 100 г рациона, т.е. 32,8% от содержания этого витамина в рационе контрольной группы [9]. Аналитически определенное поступление витаминов В1 и В2 с витаминдефицитным рационом (за счет витаминной смеси и казеина) составило 24% от их потребления крысами контрольной группы. Контроль массы тела животных проводили 2 раза в неделю.

На 21-й день, за сутки до завершения эксперимента, крыс подвергали стрессорному воздействию, используя установку ("PanLab", Испания), представляющую собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенные опускными моторизированными воротами. Решетчатый пол малого темного отделения электрифицирован. Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение лап (сила тока 0,4 мА в течение 8 с).

Животных, подвергнутых стрессу, помещали на 16 ч в метаболические клетки для сбора мочи.

По окончании сбора мочу хранили при -20 °С.

Предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации.

Собранную с гепарином после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500 g, отбирали плазму и хранили при -20 °С.

Содержание витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови и в печени, а также в подсолнечном масле определяли методом ВЭЖХ, витаминов В1 и В2 в печени, моче и казеине - флуориметрически, 4-пиридоксиловой кислоты в моче - флуориметрически, как описано ранее [2, 5, 10, 14].

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию в сыворотке крови малонового диальдегида (МДА) - вторичного продукта ПОЛ [1].

Содержание в моче кортикостерона определяли методом ВЭЖХ согласно [22] c некоторыми модификациями. К 0,75 мл мочи добавляли 0,1 мл раствора внутреннего стандарта (дексаметазон) с концентрацией 10 мкг/мл, затем 5,0 мл этилового спирта. Пробу встряхивали в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтровали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, затем упаривали на роторном испарителе. Анализируемый образец растворяли в 0,5 мл 50% этилового спирта и вводили на колонку с помощью петли объемом 0,1 мл. Хроматографический анализ проводили на колонке "Нуклеосил С18" (250×5 мм, 5 мкм) в условиях линейного градиента концентрации ацетонитрила (в воде) 20-60% в течение 45 мин при скорости элюирования 0,75 мл/мин.

В качестве детектора использовали спектрофотометрический проточный детектор "UV/VIS-151" ("GILSON", США) при длине волны 254 нм.

Концентрацию окисленной и неокисленной формы 8-гидрокси-2’-дезоксигуанозина в моче определяли с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ [7, 18] на колонке "Supersphere 100 RP18" (125×2 мм, 4 мкм) с предколонкой "Supersphere 100 RP18" (10×2 мм) ("Merck", Германия), уравновешенной 10 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 4,3, в градиенте концентрации метанола 1-80%.

В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный масс-спектрометр "API 3000" ("PE Biosystems", Германия), на котором определяли содержание иона с M/Z=168. Подготовку пробы проводили, как указано в работе [12].

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью статистических пакетов Statistica 6.0 и SPSS Statistics для Windows (версия 20.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и непараметрический критерий Краскела-Уоллиса для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Среднесуточное потребление корма крысами, получавшими витаминдефицитный рацион, было достоверно ниже (р=0,002) и составило 85,8% от соответствующего показателя для животных контрольной группы (табл. 1). Нахождение на витаминдефицитном рационе достоверно замедлило рост крыс на 10-е сутки (р=0,036) и через 21 день привело к снижению массы тела (р=0,006) и абсолютной массы печени (р=0,010) примерно на 19%, прироста массы тела - на 26,8% (р=0,005) по сравнению с показателями животных контрольной группы (см. табл. 1) и не отражалось на относительной массе печени. Вследствие худшей поедаемости витаминдефицитного рациона по сравнению с рационом с нормальным содержанием витаминов различия их эффективности, выражаемой в граммах прироста массы тела на 1 г корма, были недостоверны. Внешние признаки развития недостаточности витаминов (выпадение шерсти, алопеция и дерматит) не проявлялись.

Снижение содержания витаминов в рационе приводило к развитию выраженного полигиповитаминоза [6], о чем свидетельствует достоверное уменьшение концентрации витаминов в печени и плазме крови (табл. 2), а также экскреции с мочой рибофлавина и метаболита витамина В6 - 4-пиридоксиловой кислоты (табл. 3).

8-гидрокси-2’-дезоксигуанозин - это модифицированное нуклеозидное основание, представляющее побочный продукт повреждения ДНК, экскретируемый с мочой при репарации ДНК. Соотношение его окисленной и неокисленной форм является маркером окислительного повреждения ДНК и оксидативного стресса. Обнаруженное в нашем исследовании отсутствие сколько-нибудь значимых различий этого показателя у животных сравниваемых групп (см. табл. 3) может свидетельствовать в пользу предположения о том, что снижение обеспеченности животных опытной группы витаминами-антиоксидантами существенно не усиливало окислительное повреждение ДНК.

Выяснение вопроса о том, влияет ли само по себе электрокожное раздражение на окислительное повреждение ДНК должно стать предметом дальнейшего исследования. В данном эксперименте показатели ПОЛ сыворотки крови также не имели достоверных различий для сравниваемых групп.

Однако о положительном влиянии адекватной витаминной обеспеченности на адаптационную устойчивость животных к стрессу, моделируемому электрокожным раздражением, свидетельствует достоверное повышение в 2,5 раза экскреции кортикостерона с мочой животных опытной группы с полигиповитаминозом (см. табл. 3). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что при глубоком дефиците витамина А уровень свободного кортикостерона в плазме крови крыс увеличивался на 38% [16], 20-кратное обогащение диеты витамином Е само по себе вызывало достоверное снижение уровня кортикостерона в сыворотке крови у мышей [21], а у подвергнутых воздействию стресса крыс дополнительный прием витамина Е снижал концентрацию этого гормона в сыворотке крови [19], а также предотвращал вызванное гипероксией увеличение его секреции [20].

Таким образом, резюмируя результаты исследования, отметим, что адекватная витаминная обеспеченность ограничивала характерное для общего адаптационного синдрома увеличение в крови крыс важнейшего для этих животных кортикостероидного гормона - стресс-биомаркера и стрессмедиатора - кортикостерона. Это свидетельствует о снижении интенсивности протекания общего адаптационного синдрома, вызванного стрессом, моделируемым воздействием электрического тока.

Полученный результат подтверждает важную роль оптимальной обеспеченности организма витаминами в неспецифической (общей) резистентности к стрессорным воздействиям и обосновывает необходимость коррекции витаминного статуса, в том числе путем включения витаминов в состав специализированных продуктов адаптогенного действия.

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.

2. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Сравнение методов определения 4-пиридоксиловой кислоты в моче //Вопр. питания. - 1992. - № 4. - С. 67-69.

3. Богдан А.С., Еншина А.Н., Ивко Н.А. Подходы к разработке дифференцированных норм потребления витаминов спортсменами // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 4. - С. 49-53.

4. Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Коденцова В.М. и др. Влияние обогащения витаминдефицитного рациона крыс полиненасыщенными жирными кислотами семейства ω-3 на биомаркеры витаминного и антиоксидантного статуса // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 1. - С. 45-52.

5. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Спиричев В.Б и др. Оценка рибофлавинового статуса организма с помощью различных биохимических методов // Вопр. питания. - 1994. - Т. 63, № 6. - С. 9-12.

6. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. Экспериментальная модель алиментарного полигиповитаминоза разной степени глубины у крыс // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 2. - С. 51-56.

7. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Перспективы определения 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса в эксперименте и клинике // Вестн. РАМН. - 2002. - № 2. - С. 45-49.

8. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Изменение обеспеченности витаминами взрослого населения Российской Федерации за период 1987-2009 гг. (к 40-летию лаборатории витаминов и минеральных веществ НИИ питания РАМН) // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 68-72.

9. Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А. Витаминный состав экспериментальных рационов крыс // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 4. - С. 65-70.

10. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. Об использовании величин экскреции витаминов и их метаболитов в качестве показателей обеспеченности витаминами В2, В6 и РР // Вопр. мед. химии. - 1992. - № 1. - С. 22-24.

11. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Мазо В.К. Витамины и окислительный стресс // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 11-18.

12. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. Токсикологогигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в виде дисперсии в желудочно-кишечный тракт крыс. Сообщение 1. Интегральные, биохимические и гематологические показатели, степень всасывания макромолекул в тонкой кишке, повреждение ДНК// Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

13. Тутельян В.А., Гаппаров М.Г. Стресс и питание человека // Руководство по реабилитации лиц, подвергшихся стрессовым нагрузкам / Под ред. В.И. Покровского. - М.: Медицина, 2004. - С. 81-85.

14. Якушина Л.М., Бекетова Н.А., Бендер Е.Д. и др. Использование методов ВЭЖХ для определения витаминов в биологических жидкостях и пищевых продуктах // Вопр. питания. - 1993. - № 1. - С. 43-48.

15. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптация. - СПб.: Элби-СПб, 2007. - 130 с.

16. Bonhomme D., Minni A. M., Alfos S. et al. Vitamin A status regulates glucocorticoid availability in Wistar rats: consequences on cognitive functions and hippocampal neurogenesis? // Front. Behav. Neurosci. - 2014. - Vol. 8. - Р. 20.

17. Da Costa L.A., Badawi A., El-Sohemy A. Nutrigenetics and modulation of oxidative stress // Ann. Nutr. Metab. - 2012. - Vol. 60, suppl. 3. - P. 27-36.

18. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2’deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. - 2002. - Vol. 46, N 2. - P. 129-131.

19. Ibrahim A.A.I, Kamisah Y., Nafeeza M.I., Nur Azlina M.F. The effects of palm vitamin E on stress hormone levels and gastric lesions in stressinduced rats // Arch. Med. Sci. - 2012. - Vol. 8, N 1. - Р. 22-29.

20. Kobayashi N., Machida T., Takahashi T. et al. Elevation by oxidative stress and aging of hypothalamic-pituitary-adrenal activity in rats and its prevention by vitamin E // J. Clin. Biochem. Nutr. - 2009. - Vol. 45, N 2. - Р. 207-213.

21. Lim T.S, Putt N., Safranski D. et al. Effect of vitamin E on cellmediated immune responses and serum corticosterone in young and maturing mice // Immunology. - 1981. - Vol. 44, N 2. - Р. 289-295.

22. Quillfeld Р., Poisbleau M. Measuring corticosterone in seabird egg yolk and the presence of high yolk gestagen concentrations // Gen. Comp. Endocrinol. - 2011. - Vol. 173. - P. 11-14.