Изомерспецифический анализ метаболитов арахидоновой кислоты при неалкогольном стеатогепатите и алкогольном поражении печени у больных ожирением

Резюме

Цель исследования - определить изомерный состав метаболитов арахидоновой кислоты в крови пациентов с ожирением с алкогольным поражением печени и с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ).

В исследование были включены 69 пациентов с ожирением и стеатогепатитом, установленным по данным ультразвукового исследования печени, а также стойкого увеличения (более 6 мес) активности АЛТ в крови.

Из них у 39 употребление алкоголя было исключено на основании вопросников CAGE и AUDIT, и они составили группу больных с НАСГ, у оставшихся 30 пациентов отмечалось употребление алкоголя, в связи с чем они были включены в группу пациентов со стеатогепатитом алкогольного генеза (метаболического и алкогольного) (АСГ). Идентификацию и количественное определение 5(S)-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (5-HETE), 15-НЕТЕ, а также продукта неэнзиматического окисления 11-НЕТЕ в плазме крови проводили с помощью ВЭЖХ-времяпролетной масс-спектрометрии (MS-TOF) с использованием 2-гидроксиоктановой кислоты в качестве внутреннего стандарта. Положение гидроксильной группы в HETE было установлено с помощью ВЭЖХ-тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС). Переходы MС/MС были для 15-НЕТЕ m/z 319 m/z 219; для 11-НЕТЕ m/z 319 m/z 167; для 5-НЕТЕ m/z 319 m/z 115. Для оценки пищевого статуса изучали состав тела с помощью биоимпедансометрии, уровень энерготрат покоя методом непрямой калориметрии и фактического питания с использованием программы Анализ состояния питания человека (версия 1.2 ГУ НИИ питания РАМН, 2003-2005 гг.), которая позволяет автоматически рассчитать среднесуточную калорийность и химический состав рациона питания больного. Cодержание в крови 15-НЕТЕ (21,6Ѓ}20,2 против 11,9Ѓ}13,7 мкг/мл, р=0,02) и 11-НЕТЕ (20,8Ѓ}21,3 против 11,2Ѓ}12,9 мкг/мл, р=0,03) оказалось достоверно выше у пациентов с НАСГ по сравнению с пациентами, страдающими АСГ. При этомсодержание 8+12-НЕТЕ достоверно не различалось. По данным изучения состава тела пациенты исследованных групп не различались по значению индекса массы тела (ИМТ) и массы жировой ткани, однако у пациентов с АСГ отмечались достоверно большие значения тощей (68,1Ѓ}10,6 против 57,9Ѓ}9,8 кг, p<0,001) и мышечной массы (39,3Ѓ}6,1 против 33,2Ѓ}6,8 кг, p<0,04). Исследуемые группы не различались по показателю энерготрат покоя, однако в группе пациентов с АСГ отмечалась более высокая скорость окисления белка (98,5Ѓ}31 против 76,2Ѓ}21,1 г/сут, р=0,02). Не найдено различий в потреблении пациентами обеих групп общего жира, равно как насыщенных и ненасыщенных жиров, однако имелась тенденция к различиям в соотношении их потребления между группами (2,3Ѓ}0,2 при НАСГ против 1,4Ѓ}0,3 при АСГ). Не было также найдено достоверных различий в содержании в крови холестерина и липопротеидов высокой и низкой плотности между группами. Метаболизм арахидоновой кислоты различается у больных ожирением, страдающих НАСГ и АСГ, с преобладанием у первых более токсичных метаболитов (15-HETE и 11-HETE).

Найденные отличия в метаболизме арахидоновой кислоты могут быть обусловлены как разным патогенезом заболеваний, так и различиями в нутритивном статусе пациентов, которые требуют дальнейшего изучения.

Ключевые слова:неалкогольная жировая болезнь печени, неалкогольный стеатогепатит, алкогольный стеатогепатит, ожирение, арахидоновая кислота, 5(S)-гидроксиэйкозатетраеновая кислота

Вопр. питания. - 2014. - Т. 83 , № 5. - С. 12-19.

В настоящее время большое значение придается нутриметаболомным исследованиям, в частности нутрилипидомным [1], в контексте которых изучают возможную связь незаменимых для человека жиров и их метаболитов с патогенезом целого ряда широко распространенных заболеваний, которые традиционно относят к заболеваниям, связанным с нарушением в жировом обмене. Среди них особое место занимает стеатогепатит. В последние 30 лет в экономически развитых и развивающихся странах наблюдается тенденция увеличения числа больных стеатогепатитом, при этом заболеваемость стеатогепатитом алкогольной природы остается стабильной на протяжении многих лет, так как она обусловлена уровнем потребления алкоголя в популяции. В связи с этим основной прирост числа новых случаев заболевания приходится на неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) [2]. Полагают, что к 2030 г. цирроз печени в исходе НАСГ будет основным показанием к трансплантации печени в США и других экономически развитых странах, что делает данное заболевание важной социальной проблемой [10].

Эти изменения в эпидемиологических показателях связывают в первую очередь с широким распространением ожирения в развитых, а также в последние годы в развивающихся странах, так как при ожирении триглицериды (ТГ) накапливают- ся в гепатоцитах, вызывая стеатоз печени. Однако у значительного числа больных ожирением, у которых выявляется стеатоз печени, стеатогепатит не развивается. Механизмы развития НАСГ у таких пациентов остаются до конца неясными, что делает диагностику, лечение и прогнозирование исходов этого заболевания проблематичным. Термин "неалкогольный стеатогепатит" был предложен J. Ludwig в 1980 г., когда он впервые описал морфологическую картину поражения печени, не отличимую от таковой при алкогольном стеатогепатите (АСГ) у женщины, не употреблявшей алкоголь [4]. В связи с этим дифференциальная диагностика основывается на исключении употребления алкоголя лицами с характерной гистологической картиной в ткани печени или изменениями в активности аминотрансфераз в сыворотке крови и исключении других причин гепатита. Этиология НАСГ неизвестна, полагают, что в основе лежат нарушения обмена веществ, связанные с ожирением, характерной для него инсулинорезистентностью и нарушением метаболизма жирных кислот (ЖК) в печени, приводящим к стеатозу, а затем и повреждению гепатоцитов эндотоксинами или токсическими метаболитами ЖК [5]. В случае же алкогольного гепатита гепатоциты повреждаются в результате токсического действия метаболитов алкоголя, в частности ацетальдегида, однако, учитывая высокую степень стеатоза печени при алкогольном гепатите, вариант ее повреждения метаболитами ЖК также не исключен.

В связи с этим целью исследования было изучение метаболизма арахидоновой кислоты у пациентов с АСГ и НАСГ на фоне ожирения.

Материал и методы

В исследование были включены 69 пациентов (28 женщин и 41 мужчина) с ожирением (ИМТ 30 кг/м2) и хроническим гепатитом (в анамнезе увеличение активности АЛТ на протяжении как минимум 6 мес), находившихся в отделении гастроэнтерологии и гепатологии ФГБУ "НИИ питания" РАМН. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ФГБУ "НИИ питания" РАМН. Перед включением в исследование все пациенты подписали информированное согласие.

У 39 пациентов (26 женщин и 13 мужчин, средний возраст - 47,8±13,7 года), составлявших 1-ю группу, был установлен диагноз НАСГ на основании следующих критериев: хроническое увеличение активности АЛТ в сыворотке крови, признаки жирового гепатоза при УЗИ печени, отсутствие маркеров вирусных гепатитов в сыворотке крови (анти-HCV, HBsAg и анти-HAV класса IgM), отсутствие маркеров аутоиммунного поражения печени (антигладкомышечные и антимитохондриальные антитела в диагностическом титре не определялись), отсутствие в анамнезе приема потенциально гепатотоксичных лекарственных препаратов или биологически активных добавок (БАД) к пище, отсутствие употребления алкоголя в анамнезе (<8 баллов AUDIT; отрицательные ответы на все вопросы опросника CAGE). Во 2-ю группу вошли 30 пациентов (2 женщины и 28 мужчин, средний возраст - 45,1±10,4 года) со стеатогепатитом смешанного генеза (алкогольный + метаболический), у которых в отличие от пациентов 1-й группы имелись указания на хроническое употребление алкоголя в анамнезе и положительные значения тестов на употребление алкоголя (>8 баллов AUDIT; хотя бы 1 положительный ответ на вопросы опросника CAGE).

Оценку количества употребляемого алкоголя проводили несколькими способами:

- подробный сбор анамнеза, беседы с родственниками: потребление чистого этанола более 20 мл/нед у женщин и более 40 мл/нед у мужчин свидетельствовало о факте злоупотребления алкоголем;

- использование опросников на выявление факта злоупотребления алкоголем: AUDIT (The Alcohol Use Disorders Identification Test): >8 баллов - вероятное злоупотребление алкоголем; CAGE (Сut-Аnnoyed-Guilty-Eye): в случае хотя бы одного положительного ответа - вероятное злоупотребление алкоголем.

Для оценки функционального состояния печени у обследованных пациентов определяли следующие показатели с помощью биохимического анализатора "Konelab30i" ("Thermo scientific", Финляндия): активность АЛТ (норма 0-40 МЕ/л), АСТ (норма 0-35 МЕ/л), щелочной фосфатазы (норма 50-128 МЕ/л), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) (норма 0-40 МЕ/л), уровень общего билирубина (норма 0-20,0 мкмоль/л), прямого билирубина (норма 0-5,0 мкмоль/л).

Для оценки состояния углеводного обмена определяли уровень глюкозы крови натощак (норма 3,3-5,8 ммоль/л) с помощью биохимического анализатора "Konelab30i", инсулина (норма 2,0-25,0 мкЕд/мл) и С-пептида (норма 0,5-3,2 нг/мл) с использованием стандартных наборов ("DRGElisa", Германия).

Индекс инсулинорезистентности (ИИР) определяли расчетным методом по формуле (D.R. Matthews и соавт.):

Липидный обмен оценивали по содержанию в сыворотке крови общего холестерина (ОХС) (норма до 5,2 ммоль/л), холестерина (ХС) липо- протеинов высокой плотности (ЛПВП) (норма от 1,15 ммоль/л), ХС липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (норма до 3,80 ммоль/л), ТГ (норма до 1,70 ммоль/л).

Для оценки состояния белкового обмена определяли в сыворотке крови содержание общего белка (норма 64-83 г/л), мочевой кислоты (норма 200-420 мкмоль/л). Определение всех показателей проводили на биохимическом анализаторе "Konelab30i".

Показатели общего анализа крови оценивали с помощью анализатора "Becman Coulter LH 750 Analyzer" ("Becman Coulter", США).

Определение уровня изомеров гидроксиарахидоновой кислоты проводили следующим образом.

Экстракция липидов из плазмы крови.

К каждому образцу плазмы (5 мл) предварительно добавляли 100 мкл раствора бутилгидрокситолуола (БГТ) с концентрацией 500 мкM в качестве антиоксиданта. Для экстракции липидов в пробирку объемом 20 мл добавляли 1 мл плазмы, 100 мкл водного раствора внутреннего стандарта (2-гидроксиоктановая кислота) с концентрацией 8 мкг/мл, 4 мл насыщенного водного раствора сульфата аммония, 5 мл н-гексана, 5 мл ацетона, встряхивали на вортексе в течение 5 мин. Аликвоту (5 мл) верхнего липидного слоя упаривали досуха в токе азота. К остатку добавляли 1 мл 1 н. раствора гидроксида натрия, проводили омыление в течение 1 ч при 20-22 оС. рН реакционной смеси доводили до 2-3 добавлением примерно 100 мкл 97% водного раствора муравьиной кислоты (А). Свободные ЖК экстрагировали 600 мкл н-гексана, гексановый экстракт упаривали в токе азота и перерастворяли в 100 мкл компонента В подвижной фазы (ацетонитрил-метанол 65:35).

ВЭЖХ-МС анализ. Идентификацию и количественный анализ изомерных гидроксиэйкозатетраеновых кислот (HETE) осуществляли с помощью метода ВЭЖХ-МС. В работе использовали систему ВЭЖХ "Agilent 1100" ("Agilent Technologies", США), оснащенную бинарным насосом, дегазатором и термостатируемым автосэмплером. В качестве детектора использовали времяпролетный массдетектор "Agilent 6210-TOF". Условия ВЭЖХ-разделения: колонка ProtecolC 18 4,6×250 мм, 5 мкм, подвижная фаза - 0,1% водный раствор муравьиной кислоты (А) и смесь метанол-ацетонитрил (35:65) (B). Скорость подачи элюента - 0,8 мл/мин, режим градиента: 30-55% B - 10 мин; 55-75% B -

15 мин; 75-100% B - 5 мин; 100% B - 10 мин. Объем вводимой в инжектор пробы 10 мкл. Детектирование проводили в режиме ионизации электрораспылением и регистрации отрицательных ионов, поток газа-осушителя - 9 л/мин, температура газаосушителя - 325 °C, напряжение на фрагменторе - 175 В, на скиммере - 65 В, на капилляре - 3500 В.

Количественное определение содержания HETE осуществляли в режиме селективного ионного детектирования по соответствующим депротонированным молекулярным ионам изомеров НЕТЕ [(M-H) m/z 319] и внутреннего стандарта (m/z 159).

Корреляцию порядка выхода изомеров НЕТЕ при ВЭЖХ с положением гидроксильных групп в молекулах изомеров НЕТЕ устанавливали с помощью ВЭЖХ-МС/МС по характерным переходам: 5-HETE (m/z 319 m/z 115), 8-HETE (m/z 319 m/z 163), 11-HETE (m/z 319 m/z 167), 12-HETE (m/z 319 m/z 179) и 15-HETE (m/z 319 → m/z 219). Порядок выхода изомеров НЕТЕ при ВЭЖХ представлен на рисунке.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica for Windows 8.0 ("StatSoft, Inc.", США).

Результаты

По данным исследования антропометрических показателей пациентов с НАСГ и АСГ оказалось, что масса тела пациентов, ИМТ и количество жировой массы достоверно не различались между группами. Количество общей жидкости оказалось достоверно больше у пациентов с НАСГ.

В то же время количество мышечной и тощей массы было достоверно больше у пациентов с АСГ соответственно на 71 и 64% (табл. 1). Причина таких различий лежит, очевидно, не в разнице физической активности, а, скорее, в различии в питании между указанными группами пациентов. При исследовании уровня основного обмена, а также скорости окисления жиров (СОЖ) и углеводов (СОУ) достоверных различий между обследуемыми группами пациентов выявлено не было.

Однако скорость окисления белка (СОБ) была достоверно выше у пациентов с АСГ в среднем на 20 г/сут (табл. 2), что, по-видимому, связано с увеличенным потреблением белка по сравнению с пациентами с НАСГ. При анализе фактического потребления пищи пациентами обеих групп различий по потреблению общего жира, насыщенных ЖК (НЖК) и полиненасыщенных ЖК (ПНЖК) не выявлено (табл. 3). Однако соотношение потребления НЖК и ПНЖК между группами было близко к достоверным различиям (2,3±0,2 при НАСГ против 1,4±0,3 при АСГ, р=0,058).

При изучении содержания в крови пациентов метаболитов арахидоновой кислоты оказалось, что содержание 15-НЕТЕ и 11-НЕТЕ достоверно в 2 раза выше у пациентов с НАСГ (табл. 4). При этом содержание 8+12-НЕТЕ и эпоксиэйкозатриеновой кислоты (ЕЕТ) достоверно между собой не различались. Также не достоверными были различия в содержании 5-НЕТЕ между группами (см. табл. 4).

Обсуждение

В нашем исследовании впервые были показаны различия в метаболизме арахидоновой кислоты у больных с НАСГ и АСГ. Это чрезвычайно интересно, поскольку гистологически, как было показано ранее, изменения печени при этих заболеваниях идентичны [4, 6]. Следовательно, можно сказать, что нами впервые установлены важные и, скорее всего, патогенетические различия между НАСГ и АСГ. В пользу этого говорит тот факт, что, хотя накопление жира в гепатоцитах наблюдается при обоих заболеваниях, имеет место разный механизм патологического процесса. В случае с НАСГ накопление жира связано с тем, что основной путь окисления арахидоновой кислоты (β-окисление в митохондриях) нарушается в результате изменений метаболизма углеводов и жиров, обусловленных инсулинорезистентностью. В связи с этим скорость β-окисления арахидоновой кислоты уменьшается и усиливается метаболизм арахидоновой кислоты, осуществляющийся посредством альтернативных путей с участием липооксигеназы и неэнзиматическим путем [3]. В пользу этого говорит обнаруженное нами у пациентов с НАСГ почти двукратное увеличение гидроксиарахидоновой кислоты с расположением гидроксильной группы в 15-м и 11-м положениях. Преимущественно такие метаболиты образуются при окислении арахидоновой кислоты с помощью липооксигеназы. Эти метаболиты являются более токсичными по сравнению с гидроокисями арахидоновой кислоты с расположением гидроксильных групп в 5-, 8+12-м положениях. Более того, именно 15- и 11-НЕТЕ являются предшественниками лейкотриенов и других биологически активных веществ, стимулирующих воспаление и способствующих апоптозу гепатоцитов, вызванному цитотоксическими лимфоцитами [5], таким образом, они непосредственно участвуют в патогенезе НАСГ. Напротив, при АСГ β-окисление в значительной мере не страдает, в связи с этим содержание 15- и 11-НЕТЕ у этих больных в среднем в 2 раза ниже, чем у пациентов с НАСГ (см. табл. 4). При этом повреждение гепатоцитов у данной категории пациентов происходит в основном за счет трансформации клеточных мембран продуктом окисления алкоголя - ацетальдегидом, которая приводит к тому, что лимфоциты начинают распознавать эти изменения мембраны как чужеродные и повреждают клетки, что сопровождается их гибелью [7]. Таким образом, при изучении гистологических срезов печени больных с НАСГ и АСГ морфолог видит одни и те же гистологические изменения в ткани печени, однако их причины и последовательность событий, приводящих к ним, у этих больных совершенно разные.

Имеют ли установленные нами закономерности какое-то значение не только для понимания патогенеза НАСГ и АСГ, но и для лечения? Что касается АСГ, то единственным эффективным способом лечения является абстиненция, поскольку при ней исчезает избыток ацетальдегида в печени, гепатоциты перестают повреждаться, процессинг жиров восстанавливается и, вслед за воспалением в печени, уменьшается и стеатоз. Что касается больных НАСГ, то здесь возможно применение в лечении заболевания подходов на основе установленных нами закономерностей. Анализ фактического питания пациентов показал, что в отличие от больных НАСГ больные АСГ получают больше животных жиров, на что указывает и большее потребление ими белка, достоверно большее количество у них тощей массы и большая скорость окисления белка в основном обмене. При этом общее потребление жира между этими двумя группами больных не различалось. Нам также не удалось выявить различия в потреблении НЖК и ПНЖК (см. табл. 3), однако при подсчете соотношения НЖК/ПНЖК они оказались существенными. Следует отметить, что процесс окисления ЖК в печени зависит от двух условий - активности фермента и количества субстрата для окисления.

В связи с этим может быть выдвинута гипотеза о том, что обнаруженный феномен увеличения содержания в крови 11- и 15-НЕТЕ у больных НАСГ может быть обусловлен не только преимущественно альтернативным путем окисления арахидоновой кислоты, но также определенным соотношением субстратов - различных ЖК, поступающих с пищей.

В пользу такой гипотезы указывают данные, согласно которым гипокалорийная диета с уменьшенным содержания жиров дает худшие результаты и реже приводит к ремиссии НАСГ, нежели изокалорий- ная диета с адекватным потреблением жира [9].

Учитывая полученные нами данные, результаты этих исследований можно объяснить тем, что пул ЖК, захваченных печенью из кровотока, состоит из двух компонентов: ЖК, образующихся в результате липолиза периферической жировой ткани, который усилен при НАСГ вследствие инсулинорезистентности, и ЖК, которые попали в кровоток из кишечника, фактически из принятой пациентом жирной пищи. Безусловно, по химическому составу оба эти компонента различны, так как при периферическом липолизе образуются в основном ТГ, включая среднецепочечные ЖК. В то же время пул ЖК, поступающих с пищей, может быть различен и включать в себя как длинноцепочечные ЖК, так и мононенасыщенные ЖК (МНЖК) и ПНЖК. Исходя из этого весьма вероятныо, что соотношение различных ЖК в крови влияет на скорость и темпы метаболизма их в печени.

Таким образом, при гипокалорийной диете со сниженным содержанием жиров в крови доминируют ЖК, практически полностью поступающие за счет липолиза периферической жировой ткани, а в случае с изокалорийной диетой - имеется смесь разных ЖК. В последнем случае, вероятнее всего, гораздо меньше задействован липооксигеназный путь, что приводит к уменьшению образования 11- и 15-НЕТЕ, снижению общей липотоксичности этих продуктов и уменьшению образования провоспалительных веществ из арахидоновой кислоты. Результатом этого является довольно быстрое уменьшение воспаления печени в виде достаточно быстрой нормализации уровня АЛТ, что и было показано в цитируемых исследованиях.

Напротив, при гипокалорийной диете в течение месяца содержание АЛТ не только не снижалось, но и у части пациентов оказалось выше исходного [8]. Таким образом, для подтверждения этой гипотезы требуется проспективное исследование содержания метаболитов арахидоновой кислоты на фоне диеты, содержащей разное количество МНЖК и ПНЖК. При этом, учитывая накопленные данные, можно предположить, что эффект можно будет получить достаточно быстро - в течение 1-2 мес при условии соблюдения соответствующей диеты. Интересно, что в процессе изучения липидного спектра у пациентов с АСГ и НАСГ не обнаружено достоверного различия в уровнях ОХС, ТГ, ЛПВП, ЛПНП. Однако, если учесть, что установленные нами различия реализуются на стадии окисления ЖК (внутри митохондрий или комплекса Гольджи), то отсутствие изменений в указанных показателях липидного спектра не выглядит удивительным, так как транспортная система обеспечивает формирование липопротеидов, происходящее в другой области гепатоцита.

Это подтверждается отсутствием различий показателей в липидном спектре у больных с НАСГ и без такового (см. табл. 3).

Таким образом, нами впервые выявлены различия в метаболизме ЖК при НАСГ и АСГ, которые, несмотря на то что приводят к аналогичным гистологическим изменениям в печени, представляют собой совершенно разные с биохимической точки зрения процессы. Обнаруженные нами закономерности могут стать основой для разработки совершенно нового подхода к диетотерапии НАЖБ и, в частности, НАСГ.

Литература

1. Васильев А.В, Шаранова Н.Э, Кулакова С.Н. Нутриметаболомика - новый этап развития биохимии питания. Роль нутрилипидомных исследований // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 4-11.

2. Argo C.K., Caldwell S.H. Epidemiology and natural history of nonalcoholic steatohepatitis // Clin. Liver Dis. - 2009. - Vol. 13, N 4. - P. 511-531.

3. Bechmann L.P., Hannivoort R.A., Gerken G. et al. The interaction of hepatic lipid and glucose metabolism in liver diseases // J. Hepatol. - 2012. - Vol. 56, N 4. - P. 952-964.

4. Ludwig J., Viggiano T.R., McGill D.B., Oh B.J. Nonalcoholic steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease // Mayo Clin. Proc. - 1980. - Vol. 55, N 7. - P. 434-438.

5. Neuschwander-Tetri B.A. Hepatic lipotoxicity and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis: the central role of nontriglyceride fatty acid metabolites // Hepatology. - 2010. - Vol. 52, N 2. - P. 774-788.

6. Pinto H.C., Baptista A., Camilo M.E. et al. Nonalcoholic steatohepatitis. Clinicopathological comparison with alcoholic hepatitis in ambulatory and hospitalized patients // Dig. Dis. Sci. - 1996. - Vol. 41, N 1. - P. 172-179.

7. Ribeiro P.S., Cortez-Pinto H., Sola S. et al. Hepatocyte apoptosis, expression of death receptors, and activation of NF-kappaB in the liver of nonalcoholic and alcoholic steatohepatitis patients // Am. J. Gastroenterol. - 2004. - Vol. 99, N 9. - P. 1708-1717.

8. Selezneva K., Kirillova O., Vorozhko I. et al. Short-term effect of low-calorie diet versus isocalorie diet on to blood aminotransferases level and lipids profile in patients with non-alcoholic steatohepatitis // J. Hepatol. - 2014. - Vol. 60, N 1. - P. 353.

9. Topilskaya N., Isakov V., Kaganov B. Diet therapy of non-alcoholic fatty liver disease // J. Hepatol. - 2012. - Vol. 56. N 2. - P. 522.

10. Vernon G., Baranova A., Younossi Z.M. Systematic review: the epidemiology and natural history of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in adults // Aliment. Pharmacol. Ther. - 2011 - Vol. 34. N 3. - P. 274-285.