Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. II. Энзимологические, биохимические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты

Резюме

Наноструктурный диоксид кремния (SiO2) типа ≪Аэросил≫ с размером первичных наночастиц (НЧ) 5-30 нм в виде водной суспензии, обработанной ультразвуком, вводили крысам с исходной массой тела 80Ѓ}4 г в течение первых 30 сут внутрижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут в составе рациона в дозах 0,1; 1,0; 10 и 100 мг/кг массы тела в день. Животные контрольной группы получали носитель наноматериала (НМ) - деионизованную воду. Определяли содержание общих цитохромов Р450 и b5 в микросомальной фракции печени, активность (Vmax) микросомальных монооксигеназ со смешанной функцией изоформ CYP1A1, 1A2 и 2B1 по их специфическим субстратам, активность конъюгирующих ферментов печени глутатион-S-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы в микросомальной фракции и цитозоле, общую и неседиментируемую активность лизосомальных гидролаз β-глюкуронидазы, β-галактозидазы, арилсульфатаз А и В. В плазме крови измеряли содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и малонового диальдегида, а в эритроцитах - активность ферментов антиоксидантной защиты (глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, каталазы). Изучали комплекс стандартных биохимических показателей сыворотки крови (общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевая кислота, мочевина, активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, суммарной щелочной фосфатазы). В результате проведенных исследований выявлены изменения ряда молекулярных маркеров, которые могли быть интерпретированы как неблагоприятные. В их числе снижение активности изоформы CYP2B1 при дозе НМ 1-10 мг/кг массы тела, снижение содержания в сыворотке крови общего белка, альбумина и глюкозы в интервале доз от 0,1 до 10 мг/кг. Указанные изменения отсутствовали при максимальной дозе НМ, что не позволило однозначно установить зависимость ≪доза-ответ≫. Другие изученные показатели организмаживотных оставались в пределах нормы или испытывали изменения, которые не могли быть интерпретированы как токсические.

Ключевые слова:диоксид кремния, наночастицы, крысы, подострая токсичность, микросомы, цитохром Р450, лизосомы, неседиментируемая активность, ПОЛ

Аморфный диоксид кремния (SiO2) с первичными частицами размером менее 100 нм, известный также под техническим наименованием "Аэросил" (ГОСТ 14922-77), используется в настоящее время в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, а также в составе биологически активных добавок к пище, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств и большого числа лекарственных препаратов. Содержание этого НМ в указанных видах продукции в настоящее время не нормируется, несмотря на имеющиеся данные о его токсичности в системах in vitro [18, 26, 29, 35-37] и in vivo [5, 6, 28, 30, 31]. В нашей предыдущей работе [13] было охарактеризовано влияние перорального введения в течение 92 сут наноструктурного SiO2 на интегральные показатели организма, проницаемость кишечного барьера, уровень тканевых тиолов, окислительное повреждение ДНК и когнитивную функцию у растущих крыс. При этом значительных эффектов, которые могли бы быть интерпретированы как вредные (токсические), не выявлено в дозе SiO2 до 100 мг/кг массы тела. Целью настоящей работы является дальнейшее исследование возможных изменений в организме этих животных на уровне молекулярных маркеров токсического действия [содержание, активность и межфракционное распределение ключевых микросомальных и лизосомальных ферментов, состояние процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), активность компонентов системы антиоксидантной защиты, биохимические показатели сыворотки крови].

Материал и методы

Использован коммерческий высокодисперсный аморфный SiO2, полученный методом газофазного гидролиза химически чистого тетрахлорсилана, под торговым наименованием "Орисил 300" по ТУ 24.1-31695418-002-2003 (ООО "Силика", Россия, Московская обл., г. Долгопрудный).

По данным изготовителя, продукт соответствовал ГОСТ 14922-77. Согласно представленным в предыдущей публикации [13] данным исследования образца методами трансмиссионной электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния, образец представлял собой НМ, образованный непрочно агрегированными наночастицами (НЧ) размерами от 5 до 60 нм.

Эксперимент проведен на 75 крысах-самцах линии Вистар исходной массой 80±4 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Дизайн и условия эксперимента были подробно изложены в предыдущей публикации [13]. Все животные были разделены на 5 групп равной численности, животные 1-й группы (контроль) получали носитель - деионизованную воду, а 2-5-й группы - SiO2 в дозах 0,1; 1,0; 10 и 100 мг на 1 кг массы тела ежедневно. В течение первых 30 сут обработанную ультразвуком суспензию НМ вводили внутрижелудочно через зонд, а затем добавляли к рациону. Общая продолжительность эксперимента ставила 92 сут.

Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93-и сут опыта путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией.

Кровь отбирали дробно на антикоагулянт (0,01% по массе трикалиевой соли ЭДТА) для проведения анализа показателей ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов эритроцитов и в стерильную сухую пробирку для отделения сыворотки. Выделяли печень, разрезали на кусочки размером 0,5-1 см, троекратно промывали 0,1 М ТрисHCl буфером рН 7,4, охлажденным до 0-+2 оС, и далее гомогенизировали в том же буфере в соотношении 1:4 по массе. Гомогенат подвергали фракционированию методом дифференциального центрифугирования на препаративной ультрацентрифуге "L7-65" ("Beckman", США) с получением микросомальной и цитозольной фракций.

В микросомальной фракции определяли концентрацию цитохромов Р450 и b5 спектрофотометрически [27]. Содержание изоформ микросомальных монооксигеназ со смешанной функцией оценивали, используя специфические субстраты, по величине активности: этоксирезоруфин-деалкилазной (изоформа CYP1A1), 7-метоксирезоруфинО-деметилазной (CYP1A2) и 7-пентоксирезоруфинО-деалкилазной (CYP2B1) [15, 23].

Активность лизосомальных ферментов -глюкуронидазы, -галактозидазы, арилсульфатаз А и В исследовали согласно [4], в цельном гомогенате печени (общая активность) и во фракции цитозоля (неседиментируемая активность). Активность конъюгирующих ферментов глутатион-S-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы определяли суммарно в микросомах и цитозоле по методам [14, 21]. Все измерения ферментативных активностей проводили в условиях насыщения ферментов субстратами ([S] >>Km).

Биохимические показатели сыворотки крови [общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевая кислота, мочевина, активность трансаминаз печени (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы, (АСТ), а также суммарной щелочной фосфатазы (ЩФ)] определяли на биохимическом анализаторе ("Konelab", Финляндия) по стандартным методикам.

Исследования показателей системы антиоксидантной защиты проводили на биохимическом анализаторе "ФП-901" ("Labsystems OY", Финляндия). В эритроцитах определяли активность глутатионредуктазы на основе метода Tillotson и соавт. (1971) в адаптации, согласно [9], глутатионпероксидазы по методу Mille в модификации [10], каталазы согласно Oshino и соавт. в модификации [8], супероксиддисмутазы на основе метода Niashikimi и соавт. в модификации [8]. В плазме крови определяли содержание малонового диальдегида (МДА) по методу Mihara и соавт. [24] и диеновых конъюгатов ПНЖК спектрофотометрическим методом Placer в модификации [3].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 с помощью критерия Стьюдента, непараметрического рангового критерия Манна-Уитни и критерия ANOVA.

Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Показатели системы детоксикации ксенобиотиков в печени

Как следует из данных, представленных в табл.1, показатели, характеризующие состояние системы детоксикации ксенобиотиков в печени крыс опытных групп, в ряде случаев достоверно отличались от значений для 1-й (контрольной) группы. Так, в 5-й группе, получавшей наибольшую дозу SiO2, отмечалось достоверное (p<0,05) повышение содержания общего хромопротеина цитохрома b5 и активности изоформы СУР1А1 соответственно на 17 и 32%. Однако величина и направленность этих изменений не свидетельствовали о наличии токсического эффекта. Активность изоформы СУР2В1, напротив, снижалась у животных, получавших SiO2, причем наиболее выраженным (на 46%) и достоверным (p<0,05) это снижение было в 3-й группе (доза 1 мг на 1 кг массы тела).

Вместе с тем при наибольшей дозе НМ подобный эффект, как видно из полученных данных, не наблюдался. Активность глутатион-S-трансферазы также менялась немонотонно с ростом дозы SiO2, достигая максимума во 2-й и 4-й группах (рост на 25 и 28% в сравнении с контролем, p<0,05). Подобные выявленным, немонотонные изменения показателей системы детоксикации ксенобиотиков под действием НМ, вводимых перорально, были известны ранее. Так, в работе [32] было обнаружено аналогичное изменение активности глутатион-S-трансферазы и изоформы СУР1А1 при средних (но не максимальных) дозах фуллеренола С60. Немонотонным было изменение активности глутатион-S-трансферазы и с ростом дозы немодифицированного фуллерена С60 [12].

Такой характер изменения изучаемых показателей ферментативной активности (зависящей как от общего содержания ферментного белка, так и от его функционального состояния) указывает на их зависимость от комплекса факторов, т.е. при различных вводимых дозах НМ эффект может реализоваться как на уровне экспрессии гена [16, 20], так и за счет посттрансляционных эффектов воздействия на конформацию белка и структуру биологических мембран [34]. Для выяснения этих механизмов необходимы дополнительные исследования с привлечением постгеномных и протеомных технологий.

Общая и неседиментируемая активность лизосомальных гидролаз

Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что у крыс, получавших SiO2 в дозах 1 и 100 мг/кг, отмечалось небольшое по абсолютной величине (на 23 и 19%), но достоверное повышение активности общих лизосомальных арилсульфатаз А и В. Эти лизосомальные гидролазы ответственны за протекание в организме комплекса катаболических процессов, и при их недостаточности возможно развитие некоторых лизосомальных болезней накопления, проявляющихся, в частности, в отложении в тканях животных липофусцина [22]. В случае воздействия наноструктурного SiO2 направленность и абсолютная величина изменения активности арилсульфатаз при максимальной дозе НМ свидетельствовала, скорее, о развитии адаптивной реакции и не могла рассматриваться как признак токсического действия. Остальные показатели, представленные в табл. 2, достоверно не отличались у животных опытных групп от контроля. В частности, это относится к процентной доле неседиментируемых активностей лизосомальных ферментов, что указывает на отсутствие значимого влияния наноматериала на стабильность лизосомальных мембран. Таким образом, неблагоприятные изменения в общей и неседиментируемой активности лиосомальных гидролаз не отмечались при дозе наноструктурного SiO2 до 100 мг на 1 кг массы тела.

Показатели перекисного окисления липидов и системы антиоксидатной защиты

Результаты определения продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов ПНЖК и малонового диальдегида) в плазме крови, а также активности ферментов системы антиоксидантной защиты в эритроцитах приведены в табл. 3. Анализ этих показателей представляет особый интерес, поскольку, по данным ряда исследований, в системах in vitro токсический эффект НЧ SiO2 может реализоваться за счет усиления гетерофазной каталитической генерации реакционноспособных форм кислорода (оксидантов) [17, 25, 33]. Как следует из полученных данных, в условиях in vivo при пероральном введении этого НМ какого-либо усиления процессов ПОЛ не наблюдалось. Напротив, при дозах SiO2 0,1 и 10 мг/кг имело место небольшое по абсолютной величине (на 15 и 27%), но достоверное (p<0,05) снижение образования диеновых конъюгатов ПНЖК. Остальные изученные показатели, включая активность ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов, в опытных группах животных оставались без изменений. Таким образом, пероральное введение наноструктурного SiO2 в дозе до 100 мг/кг массы тела, во всяком случае не приводит, судя по изученным показателям, к усилению ПОЛ и ослаблению антиоксидантной защиты.

Биохимические показатели сыворотки крови

Результаты определения биохимических показателей сыворотки крови крыс представлены в табл. 4. При оценке этих показателей и их возможной связи с предполагаемой токсичностью НМ следует учитывать не только величину и направленность их изменений, но и соотношение с величиной нормальных значений для животных данного вида, пола и возраста. Соответствующие данные, полученные из доступных источников литературы, а также из результатов собственных исследований на протяжении 2008-2012 гг. (внутрилабораторная норма) также приведены в табл. 4.

Как следует из представленных данных, активность АЛТ была достоверно повышена во 2-й группе по сравнению с контролем при минимальной дозе НМ. Однако среднее значение этого показателя находилось вблизи или даже ниже известных нижних значений его нормы и тем самым не свидетельствовало о значимом усилении деструктивных процессов в ткани печени. Содержание общего белка и альбумина во всех опытных группах было снижено незначительно по абсолютной величине (максимум на 10 и 9% соответственно) и приблизительно равномерно, не демонстрируя какой-либо зависимости от дозы НМ. Видно, что по некоторым данным литературы эти изменения незначительно выходят за пределы нижней границы нормы. Причина этих изменений, возможно, состоит в тормозящем действии НМ, обладающего высокой сорбционной способностью, на всасывание в кишке некоторых эссенциальных пищевых факторов, участвующих в синтезе белка. В то же время их биодоступность в неменьшей степени зависит и от состава рациона и поэтому возможные эффекты требуют дополнительного изучения при варьирующих уровнях определенных макро- и миконутриентов в диете.

Уровень мочевины в крови был достоверно повышен в сравнении с контролем у крыс 2-й группы (на 27%) и 5-й группы (на 11%), однако при этом он оставался вблизи нижней границы нормы и тем самым не свидетельствовал о развитии токсического эффекта.

У крыс 3-й группы при дозе НМ 1 мг/кг отмечалось достоверное (p<0,05) снижение уровня глюкозы на 16% по сравнению с контролем; при этом данный показатель выходил за пределы интервала нормальных значений. Однако при более высоких дозах НМ данный эффект не воспроизводился, т.е. зависимость "доза-ответ" отсутствовала.

Остальные изученные биохимические показатели у крыс опытных групп достоверно не отличались от контроля и находились в пределах изменений, характерных для здоровых животных.

Обсуждение

Для частиц наноразмерного SiO2 характерно наличие свойств цитотоксичности in vitro, проявляющихся в отношении ряда линий клеток животных и человека [18, 26, 29, 35-37]. Механизм этих эффектов, как и в случае других видов оксидных НЧ (диоксида титана, оксида алюминия и др.), крайне мало растворимых в биологических средах, является, скорее всего, неспецифическим и опосредуемым продукцией цитотоксических реакционноспособных форм кислорода на межфазных границах [33]. Вместе с тем с учетом низких величин биодоступности НЧ SiO2 (как и других нерастворимых оксидных НЧ) в желудочно-кишечном тракте остается неясным, могут ли такие эффекты проявляться in vivo. Данные ранее проведенных экспериментов по оценке острой и подострой токсичности НЧ SiO2 дали противоречивые результаты [2, 5, 6]. При этом по своим характеристикам примененные в этих работах НМ значительно различались между собой и не соответствовали наноструктурному SiO2 типа "Аэросил", используемому в пищевой и фармацевтической промышленности [13]. В нашей работе был использован максимально чистый образец наноструктурного SiO2, с размером подавляющей доли частиц в суспензии менее 100 нм, который в наибольшей степени отвечал по своим характеристикам продукту такого рода, применяемому в качестве пищевой добавки. Как показано в предыдущей работе [13], этот НМ при пероральном введении крысам в течение 3 мес в дозе до 100 мг/кг массы тела не оказывал дозозависимого неблагоприятного воздействия на интегральные и физиологические показатели организма животных, повреждение ДНК, уровень тканевых тиолов и когнитивную функцию. Как следует из данных, представленных в настоящей статье, в интервале доз 0,1-100 мг/кг массы тела в течение 92 сут опыта наноструктурный SiO2 способен оказывать отдельные воздействия, которые можно интерпретировать как неблагоприятные (снижение активности CYP2B1, уровня общего белка, альбумина, глюкозы в сыворотке крови). Впрочем, для всех этих показателей не удалось установить однозначную зависимость доза - эффект. Для уточнения токсиколого-гигиенической характеристики изучаемого НМ необходимо изучение альтернативных биомаркеров, связанных с предполагаемыми процессами развития его токсического действия. Они могут реализоваться, во-первых, на тканевом уровне, после проникновения НЧ во внутреннюю среду организма и возможного захвата клетками [19].

Наиболее вероятными мишенями такого воздействия являются быстрообновляемые клетки организма, в первую очередь входящие в состав системы кроветворения и иммунной системы.

Во-вторых, токсический эффект НЧ может реализоваться опосредованно, за счет их влияния на видовой состав, численность и активность компонентов кишечного микробиоценоза. Данные о возможности проявления указанных эффектов под действием наноструктурного SiO2 будут представлены в последующих публикациях.

Литература

1. Ананич И.В., Дерхо М.А. Биохимические показатели крови крыс // Ветеринар. клиника. - 2008. - № 10. - С. 18-19.

2. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ-2010". - Астрахань: Астраханский университет, 2010. - С. 4-7.

3. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 33-35.

4. Дингл Д. Лизосомы. Методы исследования: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980.- 342 с.

5. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. - 2013. - № 1. - С. 65-72.

6. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных животных // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 5. - С. 78-79.

7. Кавешникова С.В., Иванов В.М. Биохимические особенности крови крыс линии Вистар в постнатальном онтогенезе при интоксикации их оксидами азота // Вестн. Ставропольского гос. ун-та. - 2011. - Т. 74, № 1. - С. 100-105.

8. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и суперок-сиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа. // Вопр. мед. химии. - 1994. - № 2. - С. 56-58.

9. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. - 1994. - № 2. - С. 59-61.

10. Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В. Методы определения содержания глютатиона и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Гиг. и сан. - 2002. - № 2. - С. 69-72.

11. Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Семенов Д.Е. и др. Биохимические показатели крови и количество гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом при действии аланинамида бетулоновой кислоты // Фундаментальные исследования (Fundamental Research). - 2012. - № 5. - С. 120-123.

12. Шипелин В.А., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика фуллерена С60 при его введении в желудочно-кишечный тракт крыс // Гиг. и сан. - 2012. - № 2. - С. 90-94.

13. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 3. - С. 52-62.

14. Burchell B., Weatherill P. 4-Nitrophenol UDP-glucuroniltransferase (rat liver) // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 77. - P. 169-176.

15. Burke M.D., Thompson S., Elcombe C.R. et al. Ethoxy-, pentoxy- and benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450 // Biochem. Pharmacol. - 1985. - Vol. 34, N 18. - P. 3337-3345.

16. Dhawan A., Taurozzi J.S., Pandey A.K. et al. Stable colloidal dispersions of C60 fullerenes in water: Evidence for genotoxicity // Environ. Sci. Technol. - 2006. - Vol. 40, N 23. - P. 7394-7401.

17. Eom H.J., Choi J. Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 7. - P. 1326-1332.

18. Eom H.J., Choi J. Nanoparticles induced cytotoxicity by oxidative stress in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Environ. Health Toxicol. - 2011. - Vol. 26.- P. e2011013.

19. Fisichella M., Dabboue H., Bhattacharyya S. et al. Mesoporous silica nanoparticles enhance MTT formazan exocytosis in HeLa cells and astrocytes 2009 // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 4. - P. 697-703.

20. Fujita K., Morimoto Y., Endoh S. et al. Identification of potential biomarkers from gene expression profiles in rat lungs intratracheally instilled with C60 fullerenes // Toxicology. - 2010. - Vol. 274, N 1-3. - P. 34-41.

21. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol.Chem. - 1974. - Vol. 249, N 22. - P. 7130-7139.

22. Jolly R.D., Walkley S.U. Lysosomal storage diseases of animals: an essay in comparative pathology // Vet. Pathol. - 1997. - Vol. 34, N 6. - Р. 527-548.

23. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xenobiotic metabolism // Biochemical Toxicology. A Practical Approach / Eds K. Snell, B. Mullock. - Oxford, UK: IRL Press, 1990. - P. 183-215.

24. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid per- oxidation in aging, CCl4 intoxication and vitamin E deficiency // Biochem. Med. - 1980. - Vol. 23, N 3. - P. 302-311.

25. Nabeshi H., Yoshikawa T., Matsuyama K. et al. Amorphous nanosilica induce endocytosis-dependent ROS generation and DNA damage in human keratinocytes // Part. Fibre Toxicol. - 2011. - Vol. 8, N 1. - P. 1-10.

26. Napierska D., Thomassen L.C., Rabolli V. et al. Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in human endothelial cells // Small. - 2009. - Vol. 5, N 7. - P. 846-853.

27. Omura T., Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature // Biol. Chem. - 1964. - Vol. 239, N 7. - P. 2370-2377.

28. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. - 2009. - Vol. 184, N 1. - P. 18-25.

29. Park M.V., Annema W., Salvati A. et al. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, N 1. - P. 108-116.

30. Rossi E.M., Pylkkдnen L., Koivisto A.J. et al. Airway exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, N 2. - P. 422-433.

31. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P. et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. - 2010. - Vol. 22, N 4. - P. 348-354.

32. Shipelin V.A., Trushina E.N., Avreneva L.I. et al. Toxicological and sanitary characteristics of fullerenol (hydroxylated fullerene C60) in 28-day in vivo experiment // Nanotechnologies in Russia.- 2013. - Vol. 8, N 11-12. - Р. 799-809.

33. Thomassen L.C., Aerts A., Rabolli V. et al. Synthesis and characterization of stable mono-disperse silica nanoparticle sols for in vitro cytotoxicity testing // Langmuir. - 2010. - Vol. 26, N 1. - P. 328-335.

34. Ueng T.H., Kang J.J., Wang H.W. et al. Suppression of microsomal cytochrome P450-dependent monooxygenases and mitochondrial oxidative phosphorylation by fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60 // Toxicol. Lett. - 1997. - Vol. 93, N 1. - P. 29-37.

35. Yang H., Wu Q., Tang M. et al. In vitro study of silica nanoparticleinduced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 1. - P. 561-568.

36. Yang X., Liu J., He H. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells // Part. Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-10.

37. Ye Y., Liu J., Xu J. et al. Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 751-758.