Влияние ферментолизата мяса мидий на рост и некоторые показатели общего адаптационного синдрома у крыс

Резюме

Изучено влияние 15-дневного потребления ферментативного гидролизата мяса мидий в составе полусинтетического рациона на некоторые биомаркеры стресса и активность апоптоза в тимусе растущих крыссамцов линии Вистар. Ферментативный гидролизат мяса мидий (ФММ) получали в полупромышленных условиях с использованием ферментного препарата ≪Протозим≫. Животные 1-й (контрольной) группы (n=8 с исходной массой тела 179,4Ѓ}5,9 г) и 2-й опытной группы (n=8, 176,3Ѓ}4,5 г) получали полусинтетический рацион, животные 3-й опытной группы (n=8, 177,6Ѓ}4,0 г) получали полусинтетический рацион, в котором 50% казеина было заменено пептидами ФММ. В предпоследний день эксперимента животных 2-й и 3-й опытных групп подвергали стрессорному электрокожному воздействию электрическим током (электрокожное раздражение на лапы, ток 0,4 мА в течение 8 с) и помещали в обменные клетки для сбора суточной мочи. На 15-е сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. В плазме крови иммуноферментным методом определяли содержание простагландина Е2 и β-эндорфина. Содержание в моче кортикостерона определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В изолированных клетках тимуса методом ДНКкомет определяли уровень ДНК повреждений, а также процент апоптотических клеток. Относительное увеличение массы тела животных (68,2Ѓ}3,0%), получавших ФММ, было достоверно (p<0,05) выше данного показателя для животных 1-й и 2-й групп (соответственно 57,2Ѓ}4,0 и 59,7Ѓ}2,8%). Было выявлено достоверное (p<0,05) увеличение в тимусе индекса апоптоза у подвергнутых стрессу животных 2-й и 3-й групп (1,13Ѓ}0,09 и 1,09Ѓ}0,01%) по сравнению с интактными животными контрольной группы (1,04Ѓ}0,01%). Определение содержания в плазме крови β-эндорфина и простагландина Е2 не выявилодостоверных различий этих показателей между группами животных.

Статистически достоверно (p<0,05) более низкие концентрации кортикостерона обнаружены в суточной моче стрессированных животных 3-й группы (452Ѓ}78 нг/мл), потреблявших ФММ, по сравнению с аналогичным показателем у подвергнутых стрессу животных 2-й группы, получавших казеиновый рацион (834Ѓ}167 нг/мл). Таким образом, было показано, что прием ФММ с высоким содержанием средне- и короткоцепочечных пептидов эффективно обеспечивает прирост массы тела у растущих лабораторных животных, а также ограничивает характерное для общего адаптационного синдрома увеличение в крови крыс кортикостерона.

Ключевые слова:мясо мидий, ферментативный гиролизат, стресс, адаптация, апоптоз, кортикостерон, β-эндорфин, простагландин Е2

Использование мяса мидий как высокоценного пищевого сырья для получения специализированных продуктов имеет в нашей стране уже более чем полувековую традицию.

Начиная с 1960-х гг. и до настоящего времени проведены многочисленные экспериментальные и клинические исследования, подтверждающие безопасность и эффективность применения в лечебном и профилактическом питании гидролизатов мяса мидий, полученных по технологии, основанной на кислотном гидролизе сырья [12, 13]. Результаты этих испытаний свидетельствуют о том, что кислотные мидийные гидролизаты обладают широким спектром фармакологического действия: радиопротекторной, гемостимулирующей, иммуностимулирующей и антивирусной активностью [2, 15]. Однако недостаточно удовлетворительные органолептические свойства, низкая биологическая ценность вследствие разрушения некоторых незаменимых аминокислот в процессе кислотного гидролиза и высокое содержание солей в конечном продукте препятствуют широкому использованию кислотных гидролизатов в оздоровительном питании [9-11]. Эти недостатки в значительной степени могут быть устранены применением технологии ферментолиза. Результаты по разработке и оптимизации процесса ферментативного гидролиза мяса мидий в лабораторных и полупромышленных условиях представлены в ряде отечественных публикаций [4, 5, 16].

В одной из наших предыдущих публикаций по сравнительной оценке биологической ценности гомогената мяса мидий (ГММ) и ферментативного гидролизата мяса мидий (ФММ) было высказано предположение о возможном наличии у ФММ заданного состава адаптогенных свойств [17].

В данной работе представлены результаты сравнительного определения аминокислотного скора ГММ и ФММ и исследования in vivo влияния потребления ФММ на рост и показатели общего адаптационного синдрома (ОАС) у крыс линии Вистар, подвергнутых дистрессу путем электрокожного раздражения.

Материал и методы

В работе использован ФММ, полученный в полупромышленных условиях с применением ферментного препарата "Протозим" ("ЕНЗИМ", Украина), микрофильтрации и распылительной сушки [1].

Химический состав препарата (табл. 1) и молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе ФММ были определены в нашей предыдущей работе [17]. Суммарное содержание пептидов (средне- и короткоцепочечных) с молекулярной массой менее 3,5 кДа и аминокислот в ФММ составляло более 45%.

Аминокислотный скор исходного ГММ и ФММ определяли на анализаторе "ААА-835" ("Hitachi", Япония) с последующей компьютерной обработкой данных по программе Мультихром для Windows; содержание триптофана в составе ГММ и ФММ определяли методом щелочного гидролиза [7].

В опытах при проведении исследования использовали половозрелых крыс-самцов линии Вистар, полученных из питомника "Столбовая". Животных разделили случайным образом на 3 группы по 8 особей в каждой. Исходная масса тела животных контрольной и опытных групп достоверно не различалась.

Животные 1-й (контрольной) группы и 2-й опытной группы получали изокалорийный (381 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20,2% казеина по калорийности) полусинтетический рацион (табл. 2) [18]. Животные 3-й опытной группы получали полусинтетический рацион, в котором 50% казеина было заменено пептидами ФММ (табл. 3).

Воду и корм животные всех групп получали без ограничений.

Крыс ежедневно осматривали и периодически взвешивали.

В предпоследний день эксперимента животных 2-й и 3-й опытных групп подвергали стрессорному воздействию, используя установку ("PanLab", Испания), представляющую собой большое освещенное белое отделение и маленькое черное отделение, разделенные опускными моторизированными воротами. Решетчатый пол малого черного отделения электрифицирован (выход 0-2 мА).

Крысу помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 с).

Затем животных помещали в обменные клетки и в течение следующих суток собирали мочу. На 15-е сутки эксперимента животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию для извлечения тимуса, взвешивали его.

Кровь собирали в пробирки с предварительно добавленным раствором Трилона Б (1,25%, 400 мкл) и отбирали плазму крови центрифугированием при t=4 °С в течение 25 мин на центрифуге "J-6B" ("Beckman", Австрия). Образцы хранили в замороженном состоянии.

В плазме крови иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов определяли содержание β-эндорфина (набор "Peptide Enzyme immunoassay (EIA) kit", "Peninsula lab. immunoassay", США) и простагландина Е2 (набор "Rat Prostaglandin E2 (PGE2) ELISA Kit", "CUSABIO", Китай).

Содержание в моче кортикостерона определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), согласно [21] c некоторыми модификациями. К 0,75 мл мочи добавляли 100 мкл раствора внутреннего стандарта (дексаметазон) с концентрацией 10 мкг/мл, затем 5,0 мл этилового спирта. Пробу помещали на лабораторный встряхиватель на 30 мин при комнатной температуре.

После чего смесь фильтровали через шприцевой фильтр (0,45 мкм) и упаривали на роторном испарителе. Анализируемый образец смывали 0,5 мл 50% этилового спирта и вводили в хроматографическую систему. Хроматографический анализ проводили на колонке Нуклеосил С18 (250×5 мм, 5 мкм) в условиях линейного градиента от 20 до 60% ацетонитрила (в воде) в течение 45 мин при скорости элюирования 0,75 мл/мин и объеме петли 100 мкл. В качестве детектора использовали спектрофотометрический проточный детектор "V/VIS-151" ("GILSON", США) при длине волны 254 нм [14].

Активность апоптоза в изолированных клетках тимуса определяли методом щелочного гель-электрофореза (метод ДНК-комет) по степени ДНК повреждений, а также рассчитывали процент апоптотических клеток (индекс апоптоза) [3, 20].

Микроскопический анализ проводили на микроскопе "Zeiss Axio Imager Z1" ("Zeiss", Германия) при увеличении 400. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system ("Metasystems GmbH", Германия). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы 75%. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток [22].

Результаты исследований приведены в виде М±m, где М - выборочное среднее измеряемых величин, m - стандартная ошибка. Статистическую обработку полученных результатов провод с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Аминокислотный скор белка мяса мидий и его ферментативного гидролизата относительно шкалы идеального белка представлен в табл. 4.

Как следует из представленных результатов, ферментолиз в основном не приводил к существенной деградации незаменимых аминокислот в исходном сырье, за исключением суммы ароматических аминокислот (фенилаланин + тирозин).

Аминокислотный скор ФММ, также как и аминокислотный скор мяса мидий, был лимитирован в первую очередь по сумме серосодержащих аминокислот, однако, как об этом свидетельствуют нижеприведенные результаты, полученные в опыте in vivo, замена в полусинтетическом рационе 50% белка казеина на ФММ не имела негативных последствий. Действительно, общее состояние всех животных при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным: по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению не было выявлено отличий у животных, потреблявших ФММ, по сравнению с животными контрольных группы.

В табл. 5 приведены средние значения (по группе) относительного прироста массы тела животных по дням эксперимента.

Потребление ФММ в составе рациона оказало выраженное положительное влияние на рост массы тела крыс. Начиная с 8-х суток относительное увеличение массы тела животных, получавших ФММ, стало достоверно выше данного показателя животных 1-й и 2-й групп. Одним из возможных объяснений наблюдаемого феномена может быть наличие у пептидов ФММ анаболических свойств.

Визуальная оценка тимуса не выявила какихлибо неблагоприятных изменений этого органа, масса тимуса достоверно не различалась у животных всех групп. Однако было выявлено достоверное увеличение в тимусе индекса апоптоза (табл. 6) у животных 2-й и 3-й групп, подвергнутых воздействию электрического тока, по сравнению с интактными животными контрольной группы.

Этот результат свидетельствовал о том, что электрокожное раздражение крыс, использован- ное в данном исследовании, позволило достаточно корректно промоделировать дистресс.

Интенсивность протекания общего адаптационного синдрома определяется взаимосвязанным функционированием центральной стресссистемы и лимитирующих стресс-систем и характеризуется биохимическими биомаркерами - кортикостероидами, эндорфинами, простагландинами и другими биологически активными соединениями. Некоторые из этих показателей были определены в нашем исследовании.

В табл. 7 представлены результаты определения содержания β-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс и кортикостерона в суточной моче животных всех групп по окончании эксперимента.

Определение содержания в крови β-эндорфина - нейропептида, рассматриваемого некоторыми авторами в качестве "возможного информативного показателя адаптабельности организма" [8, 19], не выявило достоверных различий этого показателя между группами животных. Содержание простагландина Е2 в плазме крови также достоверно не различалось для животных опытных и контрольной групп. Однако статистически достоверно более низкие значения концентраций кортикостерона обнаружены в суточной моче подвергнутых стрессу животных 3-й опытной группы, потреблявших ФММ, по сравнению с аналогичным показателем у стрессированных животных 2-й опытной группы, получавших казеиновый рацион.

Таким образом, прием ФММ с высоким содержанием средне- и короткоцепочечных пептидов ограничивал характерное для общего адаптационного синдрома увеличение в суточной моче крыс классического стресс-гормона кортикостерона, что в определенной степени соответствует высказанному ранее предположению о наличии у ФММ адаптогенных свойств [17]. В работе [6] было показано, что радиозащитная и гемостимулирующая активность ГММ возрастают с увеличением содержания в их составе низкомолекулярных пептидных фракций. Выяснение вопроса о зависимости адаптогенных свойств ФММ от содержания низкомолекуляных пептидов и свободных аминокислот также представляет существенный интерес при разработке новых специализированных продуктов для лиц, связанных с неблагоприятными условиями труда, и должно стать предметом дальнейших исследований.

Литература

1. Арнаутов М.В., Абрамова Л.С., Абрамов Д.В. и др. Отработка технологии ферментативного гидролиза мяса мидий в полупромышленных масштабах // Рыбное хозяйство. - 2013. - № 1. - С. 112-116.

2. Гончаренко Е.Н., Деев Л.И., Кудряшов Ю.Б., Пархоменко И.М. Мидийный кислотный гидролизат и его биологическое действие // Успехи соврем. биологии. - 1995. - Т. 115, вып. 2. - С. 213-224.

3. Дурнев А. Д., Жанатаев А. К., Анисина Е. А. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. - М., 2006. - 27 с.

4. Зорин С.Н., Бучанова А.В., Матяш А.И. и др. Влияние комплекса органического цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий на всасываемость в желудочно-кишечном тракте потенциально аллергенных пищевых белков // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 2. - С. 73-77.

5. Зорин С.Н., Матяш А.И., Нгуан Иен и др. Одностадийный ферментативный гидролиз мяса мидий // Вопр. дет. диетологии. - 2008. - Т. 6, № 3. - С. 36-38.

6. Кудряшов Ю.Б. Фундаментальные механизмы лучевого поражения и противолучевой защиты. Принцип "четвертого состояния" и МИГИ-К // Материалы межвузовского координационного совещания по проблеме модификации лучевых повреждений. - 1989. - С. 11-21.

7. Лисицын А.Б., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Методы практической биотехнологии. Анализ компонентов и микропримесей в мясных и других пищевых продуктах. - М.: ВНИИМП, 2002.

8. Лишманов Ю.Б., Трифонова Ш.Б., Цибин А.Н. и др. Эндорфин и стресс-гормоны плазмы крови при состояниях напряжения и адаптации // Бюл. экспер. биол. - 1987. - Т. 103, № 4. - С. 422-424.

9. Моллин Р., Панек Я., Мияхара М. Белковые гидролизаты в пищевых продуктах // Мясные технологии. - 2007. - № 11. - С. 30-31.

10. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Свойства и применение белковых гидролизатов (обзор) // Приклад. биохим. - 2000. - Т. 36, № 5. - С. 525-534.

11. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов (обзор) // Приклад. биохим. - 2000а. - Т. 36, № 4. - С. 371-379.

12. Новикова М.В. Гидробионты как промышленное сырье: Учебное пособие. - М.: Изд-во ВНИРО, 2005. - 116 с.

13. Новикова М.В., Абрамова Л.С., Котенев Б.Н. Технология получения и применения биологически активных добавок из беспозвоночных и отходов их разделки. Методические рекомендации по комплексному использованию морских и пресноводных беспозвоночных для получения пищевых и кормовых биологически активных добавок. - М.: Изд-во ВНИРО, 2008. - Вып. 3. - 24 с.

14. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - Гл. 4. - С. 109-166.

15. Рехина Н.И., Новикова М.В., Беседина Т.В. и др. Пищевой продукт из мяса мидий для лечебно-профилактического применения // Рыбное хозяйство. - 1995. - № 4. - С. 53-56.

16. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Мазо В.К. и др. Новый источник органических форм цинка // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 6. - С. 72-75.

17. Сидорова Ю.С., Арнаутов М.В., Байгарин Е.К. и др. Сравнительная оценка влияния гомогената и ферментолизата мяса мидий на рост и усвоение белка крысами Вистар // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 2. - С. 17-22.

18. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.

19. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. - СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. - С. 129.

20. Chandna S. Single-cell gel electrophoresis assay monitors precise kinetics of DNA fragmentation induced during programmed cell death // Cytometry A. - 2004. - Vol. 61, N 2. - P. 127-133.

21. Petra Quillfeld, Maud Poisbleau Measuring corticosterone in seabird egg yolk and the presence of high yolk gestagen concentrations // Gen. Comp. Endocrinol. - 2011. - Vol. 173. - P. 11-14.

22. Smith C.C., Adkins D.J., Martin E.A., O’Donovan M.R. Recommendations for design of the rat comet assay // Mutagenesis. - 2008. - Vol. 23, N 3. - P. 233-240.