Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени

Резюме

Наноструктурный аморфный диоксид кремния (SiO2) широко используется в составе пищевых добавок, лекарственных препаратов и косметической продукции. Данные о пероральной токсичности этого наноматериала (НМ) in vivo, полученные в острых и подострых экспериментах, противоречивы. Цель работы - оценка некоторых параметров токсичности наноструктурного SiO2 при его пероральном введении крысам в течение 3 мес. В работе использовали коммерческий наноструктурный SiO2 , полученный газофазным гидролизом тетрахлорсилана, с размером первичных наночастиц 5-30 нм, который был охарактеризован как НМ рядом независимых методов. SiO2 в виде водной дисперсии, обработанной ультразвуком, вводили крысам с исходной массой тела 80,0±4,0 г в течение первых 30 сут внутрижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут в составе рациона в дозах 0,1; 1,0; 10 и 100 мг/кг массы тела в день. Животные контрольной группы получали носитель НМ - деионизованную воду. Определяли прибавку массы тела, относительную массу внутренних органов, проницаемость кишечной стенки для макромолекул овальбумина (определение концентрации в сыворотке крови с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста), экскрецию с мочой продукта окислительной деструкции ДНК 8-оксо-2дезоксигуанозина (8-oxo-G) (с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии), уровень тиоловых соединений в ткани печени (спектрофотометрически), апоптоз клеток печени (проточный цитофлуориметр), эффективность закрепления условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Показано, что в результате введения наноструктурного SiO2 в течение 3 мес во всех дозах масса тела животных снижается на 10-15%; в дозах 1 и 10 мг/кг отмечается достоверное увеличение массы надпочечников, в дозе 10 мг/кг достоверно снижается экскреция с мочой 8-oxo-G. При максимальной дозе НМ (100 мг/кг) после 2 мес введения достоверно уменьшалось число животных, входивших в темный отсек экспериментальной установки при первичном тестировании УРПИ. По остальным изученным показателям не отмечено достоверных изменений при всех дозах вводимого НМ. Сделан вывод об отсутствии по изученным показателям выраженного токсического эффекта наноструктурного SiO2 для крыс при ежедневной дозе до 100 мг/кг массы тела в течение 3 мес.

Ключевые слова:диоксид кремния, наночастицы, крысы, подострая токсичность, аддукты ДНК, глутатион, проницаемость кишечной стенки, апоптоз, поведенческие реакции

Вопр. питания. - 2014. - № 3. - С. 52-62.

Аморфный диоксид кремния (кремнезем, SiO2 ) широко используется в настоящее время в качестве пищевой добавки (Е551), а также входит в состав большого числа таблетированных лекарственных средств и многих видов косметической продукции. В спецификации JECFA на данную пищевую добавку [23] отсутствует информация о размере ее частиц, что допускает использование высокодисперсного аморфного SiO2 , полученного газофазным гидролизом тетрахлорсилана высокой степени чистоты. Данный материал, известный как "Аэросил" (ГОСТ 14922-77), характеризуется размером первичных частиц 5-30 нм, образующих рыхлые агрегаты субмикронного размера, т.е. является наноматериалом (НМ), многие биологические свойства которого, в том числе предполагаемая токсичность, изучены недостаточно.

Необходимость оценки безопасности НМ обосновывается в постановлении Главного государственного санитарного врача РФ № 54 от 23.07.2007 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы" и информационном письме Роспотребнадзора "О надзоре за производством и оборотом продукции, содержащей наноматериалы" [5, 6].

В связи с этим в последние годы были проведены исследования по оценке безопасности при пероральном введении лабораторным животным различных образцов наноструктурного SiO2 , которые дали противоречивые результаты [1, 3, 4].

Цель работы - токсиколого-гигиеническая оценка в подостром эксперименте на крысах длительностью 92 сут вводимого перорально наноструктурного SiO2 , соответствующего по своим характеристикам ГОСТ 14922-77 и применяемого в качестве пищевой добавки, а также в фармацевтической и парфюмерно-косметической промышленности.

Материал и методы

Использован коммерческий высокодисперсный аморфный SiO2 "Орисил 300" по ТУ 24.1-31695418002-2003 (ООО "Силика", Россия, Московская обл., г. Долгопрудный). Индекс "300" в наименовании продукта означал удельную площадь поверхности в м 2 /г, определенную методом изотерм адсорбции инертных газов. В соответствии со спецификацией изготовителя изучаемое вещество соответствовало ГОСТ 14922-77. Продукт представлял рентгеноаморфный легкий белый порошок, дающий при диспергации ультразвуком в воде опалесцирующий бесцветный коллоидный раствор, стабильный не менее 2 сут.

По данным изготовителя, частицы SiO2 в продукте являлись непористыми.

Оценка размера и формы частиц продукта выполнена методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) на просвечивающем электронном микроскопе "JEM-100СХ" ("JEOL", Япония); методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на приборе "SmartSPM" ("АИСТ-НТ", Россия), спектроакустическим методом на анализаторе "DT-1202" ("Dispersion technology Inc.", США); методом динамического лазерного светорассеяния на анализаторе частиц "Nanotrack Wave" ("Microtrac Inc.", США). В двух последних случаях исследование суспензии проводили после ультразвуковой обработки.

Эксперимент выполнен на 75 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±4 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09, тождественный по составу AIN93 [20]. Крыс размещали в клетках группами по 3 особи, рацион и воду предоставляли в режиме свободного неограниченного доступа. В начале эксперимента животные были случайным образом разделены на 5 групп равной численности (по 15 крыс), совпадающих по исходной средней массе тела. Животным 1-й (контрольной) группы вводили носитель (деионизованную воду). Крысы 2-5-й групп получали наноструктрный SiO2 в виде обработанной ультразвуком (в течение 5 мин, частота 44 кГц, мощность 1 Вт/см 3 ) суспензии в деионизованной воде. В течение первых 30 сут введение НМ осуществляли внутрижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут суспензию SiO2 добавляли к корму животных; дозу при этом рассчитывали исходя из поедаемости рациона.

Доза SiO2, вводимая животным 2-5-й групп, составляла соответственно 0,1; 1,0; 10 и 100 мг/кг массы тела. В ходе эксперимента крыс ежедневно взвешивали на электронных весах (с точностью ±1 г), фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, особенности поведения.

По истечении 60 сут эксперимента у 8-14 животных из каждой группы, выбранных случайным образом, исследовали закрепление УРПИ по методике, описанной в работе [11]. На I стадии тестирования (выработка у животных УРПИ, "обучение") крыс однократно помещали в светлый отсек камеры.

Под влиянием поискового рефлекса и врожденного предпочтения темных участков пространства (фотофобии) определенное число крыс из каждой группы заходили в темный отсек. Регистрировали латентный период (ЛП) пребывания крыс в светлом отсеке камеры и число животных, отказавшихся от захода в темное помещение на протяжении всего времени наблюдения (180 с). Как только крыса переходила в темный отсек камеры, ворота автоматически закрывались и животное получало электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 с). После этого ворота между отсеками поднимались, и животное во всех случаях немедленно переходило в светлый отсек установки. Сразу после этого крысу переводили в клетку постоянного содержания.

На II стадии тестировали стойкость закрепления УРПИ у животных, совершивших заход в темный отсек на I стадии эксперимента. Для этого через 24 ч после первого тестирования этих животных повторно помещали в светлый отсек и фиксировали число заходов животных в темный отсек без нанесения болевого раздражителя и полное время пребывания в темном и светлом отсеках.

Общее время пребывания крысы в установке составило 180 с. Третью серию тестов (исследование угасания УРПИ как показателя когнитивной функции) осуществляли через 14 сут после первого тестирования в условиях, идентичных второму тестированию.

За 4 сут до завершения эксперимента у 5 животных из каждой группы осуществляли выборочное тестирование экскреции продукта окислительной деструкции ДНК 8-oxo-G с мочой, для чего крыс с 18.00 до 9.00 следующего дня помещали в обменные клетки. В ходе сбора образца мочи животные корм не получали, при этом доступ к воде не ограничивали. Экскрецию 8-oxo-G определяли с помощью обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [2, 13] на колонке "Supersphere 100 RP18" (125×2 мм, 4 мкм) с предколонкой "Supersphere 100 RP18" (10×2 мм) ("Merck", Германия), уравновешенной 10 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 4,3, в градиенте концентрации метанола 1-80%.

В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный масс-спектрометр "API 3000" ("PE Biosystems", Германия), на котором определяли содержание иона с M/Z=168. Подготовку пробы проводили, как указано в работе [7].

Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93 сут опыта путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией.

За 3 ч до этого по 8-9 крыс из каждой группы получали внутрижелудочно через зонд раствор овальбумина куриного яйца (ОВА) 0,15 М NaCl в дозе 3 г/кг массы тела. Определяли абсолютную и относительную массу внутренних органов (печени, почек, селезенки, сердца, семенников, тимуса, легких, надпочечников) путем взвешивания на электронных весах (с точностью ±0,01 г); в асептических условиях отбирали фрагмент правой доли печени для изучения апоптоза и содержимое слепой кишки для изучения состава кишечного микробиоценоза. Кровь отбирали дробно с антикоагулянтом (0,01% трикалиевая соль ЭДТА) для проведения биохимического и гематологического анализа и в стерильную сухую пробирку для отделения сыворотки. У части животных отбирали печень целиком, гомогенизировали ее в 0,1 М трис-HCl буфере рН 7,4, охлажденном до 0-+2 °С в соотношении 1:4 по массе. Для определения концентрации тканевых небелковых тиолов аликвоту 1 мл цельного гомогената печени смешивали при 0-+2 °С с 3 мл 6% трихлоруксусной кислоты (ч.д.а.) и через 10 мин центрифугировали при 3000g в течение 20 мин 0,5 мл супернатанта смешивали с 2 мл 0,4 М трис-HCl буфера рН 8,9 и 0,05 мл 0,4% раствора 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (реактива Эллмана) в этиловом спирте. Оптическую плотность измеряли при длине волны 412 нм на спектрофотометре СФ-46 ("Ломо", Россия).

При построении стандартных графиков использовали восстановленный глутатион. Остальную часть гомогената использовали для выделения микросомальной фракции печени, используемой в биохимических и протеомных исследованиях.

Проницаемость кишечной стенки для макромолекул ОВА оценивали по его концентрации в сыворотке крови, которую определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста согласно [24] с незначительными модификациями. Величину всасывания ОВА в процентах от введенной дозы в расчете на весь кровоток рассчитывали исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% от массы тела при гематокрите около 50%.

Состояние апоптоза клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" ("Beckman Coulter International S.A.", Австрия) [12]. Суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани "BD Medimachine" ("Becton Dickenson and Company", США), однократно отмывали клетки забуференным фосфатами до рН 7,2-7,4 раствором 0,15 М хлорида натрия и готовили пробу с концентрацией клеток 1×10 6 см -3 . Гепатоциты окрашивали конъюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) ("Beckman Coulter Int.", США) [8-10].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическим критериям Манна-Уитни, χ 2 и критерию ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты

Характеристика наноматериала

Исследование суспензии SiO2 в концентрации 1 мкг/мл методом ТЭМ (рис. 1а) показало, что частицы на сеточке распределялись в основном в виде больших агрегатов, состоящих из первичных частиц размером от 5 до 100 нм, и очень небольшого количества отдельных частиц размером 5-20 нм.

Метод АСМ показал на сканированных изображениях образцов суспензии, высушенных на подложке, присутствие наночастиц (НЧ), находящихся преимущественно в агрегированном состоянии. Агрегаты НЧ присутствовали на всех сканах с размером сканируемой области 20×20 мкм2 ; размеры агрегатов варьировали, достигая максимальной величины до 2 мкм в одном из измерений.

Для всех агрегатов отмечено, что структурным элементом является частица с размерами менее 100 нм. Популяция НЧ в составе агрегатов была однородной по морфологии: состояла из сферических частиц с размерами от 20 до 60 нм (рис. 1б).

Спектроакустическое исследование водной суспензии SiO2 с концентрацией 5% по массе, обработанной ультразвуком, выявило бимодальное распределение частиц по размерам с преобладанием фракции НЧ со средним размером 20-40 нм. Анализ размера частиц образца в концентрации 1% по массе методом динамического лазерного светорассеяния показал, что в препарате преобладала фракция НЧ со среднечисловым гидродинамическим диаметром 56,6±32,1 нм, 90-й перцентиль - размера 91,7 нм (рис. 2). Содержание фракции частиц с диаметром более 100 нм после ультразвуковой обработки не превышало 10% от общего числа частиц.

Таким образом, на основании определения размера и формы частиц SiO2 четырьмя независимыми методами было установлено, что исследуемый образец являлся НМ.

Состояние и рост животных в ходе эксперимента

На протяжении 1-го мес внутрижелудочного введения животным суспензии SiO2 наблюдали гибель 1 крысы в 4-й группе и 3 животных в 5-й группе. Вскрытие всех павших животных показало, что гибель наступила от двусторонней пневмонии, которая развивалась, как можно предположить, вследствие случайного попадания в дыхательные пути следов вводимой через зонд суспензии, содержащей высокую концентрацию НЧ. Наличие у НЧ SiO2 ингаляционной токсичности известно по данным работ [18, 21, 22]. Кроме того, 1 крыса погибла в 3-й группе на 3-м месяце эксперимента. Остальные животные всех опытных групп по своему внешнему виду, состоянию шерстяного покрова и слизистых оболочек, двигательной активности, поведению не отличались от животных контрольной группы, имели нормальный стул. Определение средних ежемесячных прибавок массы тела (рис. 3) показало, что на протяжении 1-го и 2-го месяцев эксперимента животные всех групп прибавляли в массе практически одинаково (p>0,1 критерий ANOVA), однако по истечении 3-го месяца наблюдалось небольшое (не более 15%), но достоверное отставание в прибавке массы у животных во всех 4 опытных группах по сравнению с крысами из контрольной группы. Данный эффект не являлся дозозависимым и был связан у животных данного возраста, по всей вероятности, с сокращением прироста жировой массы, что не может быть интерпретировано как признак неблагоприятного (токсического) действия вводимого в рацион SiO2 .

Уровень тревожности и состояние когнитивной функции

Тестирование животных по методу УРПИ осуществляли по истечении 1 мес введения SiO2 в составе рациона и 2 мес с начала эксперимента.

Как показали результаты исследований (табл. 1), на I стадии эксперимента все животные 1-й (контрольной) группы зашли в темный отсек в течение тест-периода 180 с. При этом в опытных группах (со 2-й по 5-ю) определенное число животных отказались от вхождения в темный отсек, причем их доля росла с увеличением дозы НМ. В 5-й группе при наибольшей дозе SiO2 5 (39%) из 13 животных не вошли в темный отсек, что достоверно отличается от контроля (p<0,05, критерий χ2 ).

Как показало второе тестирование, только одна крыса из 1-й группы вошла в темный отсек; во 2-5-й группах таких животных не было, т.е. рефлекс УРПИ у них полностью закрепился. Закрепление УРПИ было очень стойким, так что и через 14 сут, при третьем тестировании, ни одно животное из всех 5 групп не вошло в темный отсек. Таким образом, результаты показали отсутствие негативного влияния SiO2 на когнитивную функцию (стойкость закрепления УРПИ) во всех изученных дозах, однако при наибольшей из них (100 мг/кг) можно предположить наличие у животных повышенного уровня дискомфорта (тревожности), что выразилось в достоверном сокращении числа первичных заходов в темный отсек.

Масса внутренних органов

Данные, приведенные в табл. 2, показали, что каких-либо изменений в массе большинства внутренних органов в зависимости от дозы SiO2 не наблюдалось. Исключение составляют надпочечники, относительная масса которых была достоверно (p<0,05) повышена в 3-й и 4-й группах по сравнению с 1-й группой, максимум, на 32%.

В 5-й группе, получавшей наибольшую дозу НМ, данный эффект не воспроизводился, т.е. не являлся дозозависимым.

Проницаемость кишечной стенки

Перорально вводимые НЧ некоторых видов могут оказать раздражающее воздействие и вызвать воспаление в стенке тонкой кишки. Ввиду этого представляло интерес выявить, способен ли наноструктурный SiO2 оказать влияние на проницаемость кишечной стенки для макромолекул белка.

Данные, представленные на рис. 4, показали, что при воздействии на животных изучаемого НМ в течение 3 мес в дозе до 100 мг/кг массы тела не наблюдалось каких-либо достоверных систематических изменений всасываемости макромолекул белка в кровь.

Окислительное повреждение ДНК

Данные, представленные на рис. 5, показали, что экскреция 8-oxo-G с мочой у животных 2-й, 3-й и 5-й групп достоверно не отличалась от контроля, а в 4-й группе была достоверно снижена, что свидетельствовало об ослаблении процессов окислительного повреждения ДНК в этой группе.

Этот эффект не может быть интерпретирован как вредный и, как ясно из полученных данных, он не являлся дозозависимым. Таким образом, какоголибо негативного влияния SiO2 на геном животных по показателю его окислительного повреждения не выявлено в дозе, как минимум, 100 мг/кг массы тела.

Содержание тиоловых соединений в печени

Содержание в печени небелковых тиоловых соединений, представленных у крысы главным образом восстановленным глутатионом, является важным показателем, характеризующим состояние окислительно-восстановительного (Red/Ox) гомеостаза организма. Как следует из данных, представленных на рис. 6, общее содержание в печени небелковых тиоловых соединений (в пересчете на глутатион) у животных опытных групп достоверно не отличалось от контроля (p>0,1, ANOVA для 1-5-й групп). Таким образом, наноструктурный SiO2 не оказывал сколько-нибудь выраженного влияния на этот параметр в дозе вплоть до 100 мг/кг массы тела.

Апоптоз клеток печени

Количество клеток печени, находившихся на разных стадиях апоптоза, и мертвых клеток, по данным анализа проточной цитофлуориметрии, представлено в табл. 3. Содержание живых клеток в печени животных всех четырех опытных групп находилось в пределах нормальных значений, определенных ранее [8, 9], и не отличалось достоверно от контроля (p>0,05; ANOVA и тест Манна-Уитни). То же было справедливо и для количества клеток, находившихся в раннем и позднем апоптозе, и общего числа клеток в апоптозе.

Количество мертвых клеток было незначительно по величине, отличалось большой вариабельностью и также достоверно не различалось между опытными и контрольной группами. Таким образом, свидетельств об усилении процессов апопотоза клеток печени при потреблении животными наноструктурного SiO2 в дозе до 100 мг/кг массы тела не получено.

Обсуждение результатов

Токсикологическая оценка наноструктурного SiO2 в эксперименте продолжительностью 3 мес проведена в данной работе в интервале доз НМ от 0,1 до 100 мг/кг массы тела, что соответствует количеству кремния от 0,047 до 47 мг на 1 кг массы тела. Поскольку адекватный уровень (АУ) потребления кремния в России составляет 30 мг, а верхний допустимый уровень (ВДУ) - 50 мг (МР 2.3.1.1915-04), минимальная использованная доза в расчете на человека с массой тела 70 кг составляет 11% от АУ, а максимальная достигает 11000% от АУ и 6600% от ВДУ кремния. Дальнейшая аггравация дозы SiO2 не представлялась возможной, так как при этом резко возрастал риск гибели животных вследствие аспирации следов суспензии НМ в ходе зондовых введений в течение первого месяца опыта.

Согласно данным исследований in vitro, НЧ аморфного SiO2 при поступлении во внутреннюю среду организма могут быть токсичными. В основе неблагоприятных эффектов НЧ может лежать каталитическая генерация свободнорадикальных соединений, которая была выявлена в бесклеточной системе [25], в культуре кератиноцитов [16] и альвеолярных эпителиоцитов человека [14].

Цитотоксические эффекты НЧ SiO2 для клеток линии EAHY926 были выявлены в исследовании [17]. При этом частицы субмикронного размера (100-330 нм) не были токсичны. В культуре стволовых клеток эмбриона мыши НЧ аморфного SiO2 диаметром 10 и 30 нм (но не 80 нм) подавляли дифференцировку в нормальные кардиомиоциты [19]. Апоптоз и изменения в экспрессии р53, Вах и Bcl-2 под действием НЧ SiO2 размером 21 нм были выявлены в нормальных клетках печени линии L-02 [28]. О наличии у НЧ SiO2 цитотоксических свойств указывают также данные работ [15, 26, 27].

Однако с учетом предположительно крайней низкой всасываемости и биодоступности НЧ SiO2 по аналогии с другими оксидными НЧ перечисленные данные, полученные на моделях in vitro, трудно распространить на ситуацию перорального поступления НЧ в организм. По данным ряда исследований in vivo, наноструктурный аморфный SiO2 обладает выраженной ингаляционной токсичностью [18, 21, 22]. Однако при изучении эффектов НЧ SiO2 после перорального введения получены противоречивые результаты. Внутрижелудочное зондовое введение крысам наноструктурного аморфного SiO2 с удельной поверхностью 220 м 2 /г в дозах 1 и 100 мг на 1 кг массы тела на протяжении 30 сут не вызвало выраженного токсического воздействия, судя по всему комплексу изученных биохимических, физиологических, гематологических и аллергологических показателей [1]. В работах [3, 4] мышам внутрижелудочно в остром опыте вводили "монодисперсные" НЧ SiO2 , полученные методом жидкокристаллического темплатирования с использованием цетилтриметиламмония бромида в качестве темплата. Частицы SiO2 имели эллиптическую форму размером около (50~70)×(20~30) нм.

Отмечалась гибель животных в группах, получивших НМ, на 3-и и 4-е сут при величине LD50 , равной 4600 мг/кг массы тела. При дозе НЧ SiO2 выше 0,2 LD50 отмечено повреждение форменных элементов крови, а в дозе 0,3LD50 выявлены морфологические изменения системы кровообращения, лимфоидной и макрофагальной систем, а также дегенеративные изменения в печени и почках. Изученные НЧ SiO2 характеризовались значительной кумулятивностью (индекс кумулятивности 0,45).

Можно предположить, что основной причиной расхождения результатов работ [1] и [3, 4] является различие в свойствах применявшихся препаратов SiO2 . При этом следует отметить, что оба изученных вида наноструктурного SiO2 не применяются в составе потребительской, в том числе пищевой продукции, и не соответствуют по своим характеристикам наиболее распространенной в пищевых производствах форме наноструктурного SiO2 типа "Аэросил". Изучение подострой пероральной токсичности этого НМ с размером первичных частиц 5-30 нм, проведенное в настоящей работе, показало, что для него отсутствовали выраженные признаки токсического действия при введении в течение 3 мес в дозе до 100 мг/кг массы тела ежедневно по интегральным показателям, включая прибавку массы тела, проницаемость кишечной стенки для макромолекул, стойкость закрепления УРПИ. Не выявлено негативного влияния НЧ на такие маркеры токсического действия, как уровень тканевых тиолов, окислительное повреждение ДНК, апоптоз клеток печени. Отдельные выявленные эффекты (гипертрофия надпочечников у животных 3-й и 4-й групп) были относительно незначительными по абсолютной величине и не демонстрировали четкой зависимости от дозы НЧ.

Единственным показателем, характеризовавшимся зависимостью от дозы, было число животных, отказавшихся от первичного захода в темный отсек в тесте УРПИ, причем эффект был достоверным при дозе 100 мг/кг. Однако данный показатель не входит в стандартный протокол УРПИ-теста, и ввиду этого его корректная интерпретация затруднена. В итоге необходимо констатировать, что свидетельств подострой пероральной токсичности наноструктурного SiO2 типа "Аэросил" в эксперименте длительностью 3 мес не выявлено, в том числе и при значительно аггравированной дозе 100 мг/кг массы тела. Для подтверждения либо уточнения этого результата в последующих публикациях будет проведен анализ более широкого набора маркеров токсического действия, включая биохимические, гематологические, иммунологические и микробиологические показатели.

Литература

1. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ-2010". - Астрахань: ИД "Астраханский университет", 2010. - С. 4-7.

2. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Перспективы определения 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса в эксперименте и клинике // Вестн. РАМН. - 2002. - № 2. - С. 45-49.

3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. - 2013. - № 1. - С. 65-72.

4. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных животных // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 5. - С. 78-79.

5. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

6. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. О концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 4-8.

7. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в виде дисперсии в желудочно-кишечный тракт крыс. Сообщение 1. Интегральные, биохимические и гематологические показатели, степень всасывания макромолекул в тонкой кишке, повреждение ДНК // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

8. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

9. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Мустафина О.К. и др. Характеристика эффективности использования наночастиц оксида цинка в питании. Эксперименты на лабораторных животных // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 39-44.

10. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Бекетова Н.А. и др. Влияние пищевых волокон на апоптоз гепатоцитов крыс с алиментарной поливитаминной недостаточностью // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 33-40.

11. Фоломкина А.А., Орлова Н.В., Базян А.С Влияние однократного введения мелипрамина на двигательную активность и оборонительные условные рефлексы пассивного и активного избегания у крыс // Журн. высш. нервн. деят. - 2004. - Т. 54, № 6. - С. 829-834.

12. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии, клиническое примечание. - Челябинск, 2008. - C. 63-112.

13. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. - 2002. - Vol. 46, N 2. - P. 129-131.

14. Eom H.J., Choi J. Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 7. - P. 1326-1332.

15. Eom H.-J., Choi J. Nanoparticles induced cytotoxicity by oxidative stress in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Environ. Health Toxicol. - 2011. - Vol. 26. - P. e2011013.

16. Nabeshi H., Yoshikawa T., Matsuyama K. et al. Amorphous nanosilica induce endocytosis-dependent ROS generation and DNA damage in human keratinocytes // Part Fibre Toxicol. - 2011. - Vol. 8, N 1. - P. 1-10.

17. Napierska D., Thomassen L.C., Rabolli V. et al. Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in human endothelial cells // Small. - 2009. - Vol. 5, N 7. - P. 846-853.

18. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. - 2009. - Vol. 184, N 1. - P. 18-25.

19. Park M.V., Annema W., Salvati A. et al. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, N 1. - P. 108-116.

20. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.

21. Rossi E.M., Pylkkдnen L., Koivisto A.J. et al. Airway exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, N 2. - P. 422-433.

22. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P. et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. - 2010. - Vol. 22, N 4. - P. 348-354.

23. Silicon dioxide, amorphous. - Rome: JECFA, 1973-1992. - 2 p. http://www.fao.org/food/food-safety-quality/scientificadvice/jecfa/jecfa-additives/en/.

24. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K., Hide D.W. Passage of cow’s milk proteins in breast milk // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

25. Thomassen L.C., Aerts A., Rabolli V. et al. Synthesis and characterization of stable monodisperse silica nanoparticle sols for in vitro cytotoxicity testing // Langmuir. - 2010. - Vol. 26, N 1. - P. 328-335.

26. Yang H., Wu Q., Tang M. et al. In vitro study of silica nanoparticle-induced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 1. - P. 561-568.

27. Yang X., Liu J., He H. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells // Part Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-10.

28. Ye Y., Liu J., Xu J. et al. Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 751-758.