Состояние системы энергообеспечения митохондрий печени крыс при алиментарной белковой недостаточности

Резюме

В работе исследована NADH-дегидрогеназная и сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий печени крыс в условиях алиментарной белковой недостаточности. Исследования проведены на 65 белых нелинейных крысах, разделенных в зависимости от количества белка в рационе на 3 группы: 1-я - крысы, содержащиеся на низкобелковой диете (7% белка в виде казеина, 10% жиров и 83% углеводов; n=26); 2-я - крысы, содержащиеся на безбелковой диете (n=26); 3-я - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе (14% белка, 10% жиров, 76% углеводов, n=13). NADH-дегидрогеназную активность определяли спектрофотометрически, сукцинатдегидрогеназную активность - по интенсивности восстановления феррицианида калия. Установлено, что в условиях безбелкового рациона снижение NADH-дегидрогеназной активности митохондрий печени крыс наблюдается на 14-е сутки, при этом 4-недельное содержание крыс в указанных условиях приводит к снижению исследуемой ферментативной активности в 5,5 раза по сравнению с показателями контрольной группы животных (0,506±0,040 нм NADH/мин на 1 мг белка) и в 3 раза по сравнению с показателями, полученными на предыдущей стадии эксперимента. В то же время при частичной белковой недостаточности снижение активности NADH-дегидрогеназы митохондрий печени в 2 раза наблюдается только на 28-е сутки эксперимента. Показано, что в условиях 2-недельного содержания крыс на безбелковой диете активность сукцинатдегидрогеназы по сравнению с контролем (3,880 нмоль сукцината/мин на 1 мг белка) достоверно не изменяется, при этом 4-недельное содержание животных как на безбелковом, так и на низкобелковом рационе приводит к снижению сукцинатдегидрогеназной активности. При этом если в условиях низкопротеиновой диеты сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий печени снижается вдвое, то в условиях отсутствия белка в рационе - втрое. Сделан вывод, что в реализации изменений в системе биотрансформации энергии в митохондриях в условиях алиментарной белковой недостаточности в первую очередь лежат нарушения на уровне Комплекса I дыхательной цепи.

Ключевые слова:NADH-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, алиментарная белковая недостаточность, печень

Вопр. питания. - 2014. - № 3. - С. 12-16.

В условиях ограниченного поступления белка метаболическая адаптация направлена на обеспечение органов и тканей организма структурными субстратами и энергией за счет утилизации собственных запасов [5]. При этом алиментарная белковая недостаточность сопровождается дисрегуляторными изменениями в системе "анаболизм-катаболизм", развитием патологической толерантности тканей к нутриентам и одновременным ростом энергозатрат [1, 2].

Состояние энергообеспечения клеток в первую очередь определяется эффективностью работы дыхательной цепи митохондрий, трансформирующей энергию окисления субстратов дыхания кислородом в форму трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране [11].

В литературе показано, что в условиях низкобелкового питания наблюдается снижение эффективности окислительного фосфорилирования [13], однако причины не рассматриваются. Предполагается, что уменьшение активности ферментов дыхательной цепи может быть связано с нарушением синтеза восстановленных эквивалентов в цикле Кребса [15]. Снижение эффективности окислительного фосфорилирования у потомков самок, содержавшихся в условиях низкобелкового рациона, связывают с изменениями на уровне мтДНК, кодирующей субъединицы ферментов дыхательной цепи [7, 14]. В то же время в литературе нет систематизированных данных о биохимических механизмах нарушения клеточной энергетики при белковой недостаточности. Для рассмотрения причин изменений в системе энергообеспечения клеток в условиях алиментарной депривации протеина актуально определение звеньев, лимитирующих ее возможности. Учитывая, что сукцинатдегидрогеназа и NADH-дегидрогеназа являются маркерными ферментами эффективности функционирования системы биотрансформации энергии [6], целью нашей работы было изучение NADH-дегидрогеназной и сукцинатдегидрогеназной активности митохондрий печени крыс в условиях алиментарной белковой недостаточности.

Материал и методы

Исследования проводили на белых нелинейных крысах (n=65) с массой тела 90-100 г в возрасте 2-2,5 мес. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.

Крыс содержали по одной в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.

В зависимости от количества белка в рационе были сформированы 3 группы животных: 1-я - крысы, содержащиеся на низкопротеиновой диете ( 1/2 К); 2-я - крысы, содержащиеся на безбелковой диете ( - К); 3-я - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе (К). Животные 1-й группы (n=26) получали рацион, включающий 7% белка (в виде казеина), 10% жиров и 83% углеводов. Животные 2-й группы (n=26) получали полусинтетический безбелковый рацион. Животные 3-й, контрольной, группы (n=13) получали рацион, содержащий 14% белка, 10% жиров, 76% углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [10]. Энергетическая ценность рациона составляла 3601,0 ккал/кг.

Длительность эксперимента составляла 28 сут.

Цервикальную дислокацию крыс (по 13 животных каждой опытной группы) под легким эфирным наркозом осуществляли на 14-е и 28-е сутки эксперимента.

Выделение митохондриальной фракции из гомогената печени проводили с помощью метода дифференциального центрифугирования при 0-3 °С [4]. NADH-дегидрогеназную активность определяли спектрофотометрически [12] (коэфициент молярной экстинкции 6,22×10 3 М -1 ×см -1 ).

Сукцинатдегидрогеназную активность выявляли по интенсивности восстановления феррицианида калия [4]. Содержание белка определяли по методу Лоури [8].

Статистическую значимость полученных результатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований показали, что в группе животных, содержавшихся на безбелковом рационе, уже на 14-е сутки эксперимента достоверно снижалась NADH-дегидрогеназная активность в митохондриальной фракции печени по сравнению с показателями контрольной группы (рис. 1).

4-недельное содержание крыс на безбелковом рационе приводило к снижению исследуемой ферментативной активности в 5,5 раза по сравнению с показателями контрольной группы и в 3 раза по сравнению с показателями, полученными на предыдущей стадии эксперимента.

Таким образом, в условиях безбелкового рациона торможение активности NADH-дегидрогеназы митохондрий печени крыс наблюдается уже на начальных этапах эксперимента. Причиной установленного факта, с одной стороны, может быть снижение поступления восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь, а с другой - ингибирование ферментативной активности Комплекса І электронтранспортной цепи митохондрий в данных экспериментальных условиях.

В то же время в группе животных, содержавшихся на низкобелковой диете, на 14-е сутки эксперимента наблюдалась активация NADH-дегидрогеназы с тенденцией к торможению на 28-е сутки (см. рис. 1). Вероятно, в условиях 2-недельной белковой недостаточности наблюдается усиление потоков электронов и протонов через Комплекс І дыхательной цепи как следствие интенсификации катаболических процессов в организме экспериментальных животных, направленных на удовлетворение энергетических и пластических потребностей организма [3].

Итак, если в условиях безбелкового питания торможение NADH-дегидрогеназной активности наблюдалась уже на 14-е сутки эксперимента, то белковая недостаточность сопровождается нарушением функционирования NADH-дегидрогеназы митохондрий печени только на 28-е сутки исследований. Снижение NADH-дегидрогеназной активности может свидетельствовать о нарушении окисления NADH-зависимых субстратов в дыхательной цепи митохондрий с последующим дисбалансом работы системы биотрансформации энергии.

Посредником между FAD-зависимыми субстратами и дыхательной цепью является Комплекс ІІ, ключевой фермент которого сукцинатдегидрогеназа [9]. Результаты исследования показали, что в обеих экспериментальных группах животных на 14-е сутки эксперимента активность сукцинатдегидрогеназы по сравнению с контролем достоверно не изменялась (рис. 2).

Вероятно, в условиях установленного нами снижения NADH-дегидрогеназной активности в указанный экспериментальный период в группе животных, содержащихся на безбелковом рационе, сохранение сукцинатдегидрогеназной активности на уровне контрольных значений определяет поддержку энергообеспечения митохондрий клеток печени. В то же время 4-недельное содержание животных на экспериментальной диете приводило к достоверному снижению сукцинатдегидрогеназной активности в обеих группах животных. При этом если в условиях низкобелковой диеты сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий печени снижается вдвое, то в митохондриальной фракции печени крыс в условиях отсутствия белка в рационе наблюдается снижение активности сукцинатдегидрогеназы в 3 раза. Снижение сукцинатдегидрогеназной активности только в условиях длительной алиментарной депривации протеина можно рассматривать как компенсаторный механизм, направленный на поддержку энергообеспечения в условиях повышенной потребности в энергии.

Таким образом, в условиях 4-недельной недостаточности или отсутствия белка в рационе наблюдается снижение как NADH-дегидрогеназной, так и сукцинатдегидрогеназной активности, что может приводить к нарушению энергозависимых процессов в клетках печени. В то же время полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в реализации изменений в системе биотрансформации энергии в митохондриях в условиях алиментарной белковой недостаточности в первую очередь, по-видимому, лежат нарушения на уровне Комплекса I дыхательной цепи, что открывает новые перспективы для поиска критических участков в его работе. Результаты исследований могут стать базовыми для понимания биохимических механизмов метаболического ответа клеток на алиментарную белковую недостаточность и биохимического обоснования терапевтических подходов к коррекции и устранению последствий нарушения энергетического обмена при белковой недостаточности.

Литература

1. Антонов А.Р., Баталова E.Ю., Новоселов Я.Б., Начаров Ю.В. Особенности течения катаболического синдрома у лиц с пониженной массой тела на фоне функционального питания // Пат. физиол. - 2006. - Т. 7. - С. 427-434.

2. Дундаров З.А., Майоров В.М. Основные проблемы проведения нутритивной поддержки у пациентов в критических состояниях // Новости хирургии. - 2009. - Т. 17, № 2. - С. 119-123.

3. Запорожченко Б.С., Муравйов П.Т., Горбунов А.А. Корекція білково-енергетичної недостатності в комплексному хірургічному лікуванні ускладненого гострого деструктивного панкреатиту // Хірургія. - 2011. - Т. 2, № 41. - С. 81-84.

4. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Волощук О.М. Активність ферментів енергозабезпечення карциноми Герена, трансплантованої на фоні попереднього опромінення малими дозами // Доповіді НАН України. - 2011. - № 1. - С. 153-156.

5. Моцарь В.В., Никитина Н.В., Трофимова И.А. и др. Опыт применения препарата “Иммунофлазид” при белковоэнергетической недостаточности у детей раннего возраста // Совр. педиатрия. - 2011. - № 6(40). - С. 63-64.

6. Finel M., Skehel J.M., Albracht S.P.J. et al. Resolution of NADH:ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria into two subcomplexes, one of which contains the redox centers of the enzyme // Biochemistry. - 2000 - Vol. 31, N 46. - P. 11425-11434.

7. Jia Y., Li R., Cong R. et al. Maternal low-protein diet affects epigenetic regulation of hepatic mitochondrial DNA transcription in a sex-specific manner in newborn piglets associated with GR binding to its promoter // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, N 5. - P. e63855.

8. Lowry O.H., Rosenbrough M.J., Farr A.L., Rendal R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, N 1. - P. 265-275.

9. Miles B. The electron Transport Chain // LSM. - 2003. - Vol. 2. - Р. 1-11.

10. Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.

11. Sangar V., Eddy A., Price N.D., Simeonidis E. Mechanistic modeling of aberrant energy metabolism in human disease // Front. Physiol. - 2012. - Vol. 3. - P. 404.

12. Sharova I.V., Vekshin N.L. Rotenone-insensitive NADH oxydation in mitochondrial suspension occurs by NADH dehydrogenase of respiratory chain fragments // Biophysic. - 2004. - Vol. 49, N 5. - Р. 814-821.

13. Tanakaa M., Ishibashia T., Toyomizua M. Time course of oxidative phosphorylation in liver mitochondria of chickens fed on high - protein diet // Br. Poult. Sci. - 1995. - Vol. 36, N 1. - Р. 143-154.

14. Theys N., Bouckenooghe T., Ahn M.T. et al. Maternal lowprotein diet alters pancreatic islet mitochondrial function in a sex-specific manner in the adult rat // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2009. - Vol. 297. - P. 1516-1525.

15. Tyzbir R.S., Kunin A.S., Sims N.M., Danforth E.Jr. Influence of diet composition on serum triiodothyronine concentration, hepatic mitochondrial metabolism and shuttle system activity in rats // J. Nutr. - 1981. - Vol. 111 (2). - P. 252-259.