Влияние наночастиц диоксида титана и диоксида кремния на накопление и токсичность свинца в эксперименте при их внутрижелудочном введении

Резюме

Целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка предположения о возможности потенцирования накопления и усиления токсичности свинца (Pb) в условиях его совместного внутрижелудочного введения с наночастицами (НЧ) диоксидов титана (TiO2 ) и кремния (SiО2). Ацетат свинца вводили внутрижелудочно крысам в дозе 20 мг/кг массы тела из расчета на свинец в виде раствора в воде или в водной суспензии НЧ TiO2 или НЧ SiO2 , взятых в дозе 1 и 100 мг/кг массы тела. Продолжительность эксперимента составила 21 и 23 сут.

Получены данные, что совместное введение Pb с НЧ TiO2 и НЧ SiО2 вызывало изменения в ряде показателей, которые можно трактовать как некоторое увеличение токсического действия изучаемых веществ.

Величина и направленность выявленных эффектов зависели от вида и дозы вводимых НЧ TiO2 и SiО2 . При совместном введении Pb с НЧ TiO2 в дозе 100 мг/кг крысам с исходной массой тела 80±8 г имело место снижение концентрации гемоглобина на 17% (p<0,05), количества лимфоцитов на 13% (p<0,05) и тромбоцитов на 10% (p<0,05) в крови, а также отмечалась активация процессов апоптоза гепатоцитов. При введении Pb вместе с НЧ SiО2 в дозе 100 мг/кг крысам с исходной массой тела 140±4 г концентрация гемоглобина, напротив, возрастала на 24% (p<0,05) и отмечалось достоверное снижение суточной экскреции 5-аминолевулиновой кислоты с мочой. Накопление Pb при его введении совместно с НЧ TiO2 в дозе 100 мг/кг не изменялось в печени и снижалось в почках на 50% (p<0,05), семенниках на 79% (p<0,05) и головном мозге на 38% (p<0,05). НЧ SiО2 не влияли на этот показатель. Сделан вывод, что гипотеза усиления токсичности Pb за счет облегчения его транспорта через стенку кишки в форме, адсорбированной на НЧ, не получает экспериментального подтверждения, а наблюдаемые эффекты, скорее всего, связаны как с токсичностью самого Pb, так и токсичностью (в изученных дозах) НЧ TiO2 и НЧ SiО2

Ключевые слова:диоксид титана, диоксид кремния, наночастицы, свинец, крысы, токсичность, 5-аминолевулиновая кислота, накопление свинца

Вопр. питания. - 2014. - № 2. - С. 57-63.

В настоящее время нанотехнологии позволяют целенаправленно создавать и производить в промышленном масштабе искусственные наноматериалы (НМ) и наночастицы (НЧ), которые могут быть использованы, в том числе, в качестве источников биологически активных веществ, пищевых добавок и т.д. [2, 12]. Наряду с безусловно положительными аспектами их применения, эти НМ и НЧ должны быть всесторонне оценены в отношении их токсического потенциала и возможности оказывать отрицательное воздействие на здоровье населения, особенно учитывая тот факт, что они могут накапливаться в объектах окружающей среды и в связи с этим в продовольственном сырье, что может привести к нерегулируемому их поступлению во внутреннюю среду организма человека. Кроме их прямого влияния на клетки, в литературе высказывается предположение о возможности взаимодействия НЧ с традиционными контаминантами пищевых продуктов, такими как, например, ионы тяжелых металлов [4, 13], в результате чего НМ и НЧ за счет своей высокоразвитой поверхности и высокой адсорбционной способности могут определенным образом взаимодействовать с ними и тем самым усиливать проникновение этих токсикантов в организм человека (служить в определенной степени проводниками), модифицируя их токсическое действие.

На принципиальную возможность такого эффекта указывает недавно выявленная способность НЧ диоксида титана (TiO2 ) приводить к накоплению токсичных элементов в ряде модельных биологических систем in vitro и in vivo [15, 16]. В связи с этим целью настоящей работы явилась экспериментальная проверка предположения о возможности потенцирования накопления и усиления токсичности свинца (Pb) в условиях его совместного внутрижелудочного введения с НЧ TiO2 и диоксида кремния (SiO2 ).

Материал и методы

В работе были использованы стандартизованные препараты НЧ TiO2 (в кристаллической форме рутила) и аморфного SiO2 (оба производства "Sigma-Aldrich", Германия), физико-химическая и токсиколого-гигиеническая характеристика которых была проведена ранее [3, 8, 11]. По данным трансмиссионной электронной микроскопии, НЧ TiO2 имели игольчатую или стержневидную форму со средним размером 5×40 нм. НЧ SiO2

имели неправильную форму и размер в пределах15-30 нм (площадь их поверхности, по данным анализа методом изотерм инертных газов, составила 220 м 2 /г) (исследование проведено на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (проф. К.В. Шайтан)). В эксперименте использовали свинец уксуснокислый трехводный квалификации х.ч. (ООО "Хромресурс", Россия) по ГОСТ 1027-67.

Были проведены 2 эксперимента, в которых использовали в общей сложности 26 и 27 белых крыс самцов линии Вистар с исходной массой тела соответственно 80±8 и 140±4 г, полученных из питомника филиала ФГБУН "Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН (г. Пущино Московской области). Крыс содержали группами по 3-4 особи в пластмассовых клетках и кормили на протяжении каждого эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом, идентичным по составу AIN93 [14]. Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали. Условия содержания и порядок работы с животными соответствовали действующим в Российской Федерации требованиям (приказ Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н). Крысы были разделены на 6 групп по 8-9 животных.

В первом эксперименте крысам 1-й группы вводили внутрижелудочно через зонд раствор ацетата свинца в дозе 20 мг/кг массы тела (в расчете на свинец) в целях воспроизведения модели свинцовой интоксикации [6]. Животные 2-й и 3-й групп, которым также вводили свинец в той же дозе, получали дополнительно дисперсию НЧ TiO2 в дозе 1 и 100 мг/кг массы тела. Во 2-м эксперименте животным 4 группы вводили свинец по той же дозе, что и животным 1-й группы, а крысы 5-й и 6-й групп дополнительно получали НЧ SiO2 в дозе 1 и 100 мг/кг массы тела. Непосредственно перед введением суспензии НЧ обрабатывали ультразвуком (5 мин, 44 кГц, 40 Вт). В ходе экспериментов у крыс всех групп ежедневно определяли массу тела на электронных весах (с точностью ±1,0 г).

На 20-й день эксперимента проводили сбор суточной мочи, в которой определяли 5-аминолевулиновую кислоту (5-АЛК) спектрофотометрическим методом с использованием наборов фирмы "Biosystems S.A." (Испания). На 21-23-й день животных обескровливали под эфирной анестезией, отбирали для анализа органы и ткани. Биохимические и гематологические показатели определяли, как описано ранее [8]. Апоптоз гепатоцитов изучали методом проточной цитофлуориметрии с окрашиванием FITC-аннексином V (AnV-FITC) и 7-аминоактиномицином (7-AAD). Принцип метода и процедура анализа изложены ранее [7, 9, 10].

Содержание свинца в органах (печень, почки, селезенка, семенники, головной мозг) определяли методом атомно-абсорбционной спектрометрии на приборе "SOLAAR 969" ("UNICAM", Великобритания) согласно ГОСТ 30178-96.

Пробоподготовку выполняли в соответствии с ГОСТ 26929-94.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни и критерию ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ). Различия признавали достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Как показали проведенные исследования, ни НЧ TiO2 , ни НЧ SiO2 на фоне введения свинца не оказывали влияния на прирост массы тела животных на протяжении всего эксперимента. Введение Pb совместно с НЧ TiO2 не влияло на относительную массу внутренних органов у животных, в то время как введение НЧ SiO2 приводило к достоверному дозозависимому снижению массы печени с 4,17±0,08% в 4-й группе до 3,76±0,07% в 6-й группе (p<0,003, критерии Стьюдента и Манна-Уитни).

В качестве специфических критериев, характеризующих воздействие Pb на организм, были выбраны такие показатели, как содержание Pb в органах (табл. 1) и суточная экскреция 5-АЛК с мочой (см. рисунок). Результаты исследований с введением НЧ TiO2 свидетельствовали, что содержание Pb в печени крыс, получавших НЧ обоих видов, практически не отличалось от контрольных значений для животных, получавших только ацетат свинца (данные не показаны). Что касается остальных органов, то здесь наблюдалось выраженное снижение накопления Pb у животных 3-й группы, получавших рутил в дозе 100 мг/кг: на 50% в почках (p<0,05), на 79% в гонадах (p<0,05), на 38% в головном мозге (p<0,05) и на 42% в селезенке (различие на уровне тенденции, p=0,06). Во втором эксперименте не наблюдалось существенных различий между группами животных по содержанию Pb в органах. Вместе с тем у животных, получавших Pb и НЧ SiO2 , отмечено достоверное (р≤0,05) уменьшение экскреции 5-АЛК с мочой, что может свидетельствовать о некотором снижении токсического действия Pb на организм (см. рисунок).







Несколько разноречивые данные были получены при изучении концентрации гемоглобина (Hb) в крови (табл. 2). У животных, получавших Pb и НЧ TiO2 , наблюдалось достоверное и дозозависимое снижение содержания Hb в крови по сравнению с животными, получавшими только Pb. Во втором эксперименте, наоборот, имело место дозозависимое увеличение концентрации Hb в крови животных 5-й и 6-й групп (по сравнению с животными 4-й группы), что сопровождалось увеличением количества эритроцитов в крови, показателя гематокрита при некотором снижении средней концентрации Hb в эритроците. Каких-либо достоверных различий в количестве лейкоцитов и лейкоцитарной формулы не выявлено (данные не приведены), за исключением содержания лимфоцитов в крови у животных 1-3-й групп, а именно: у крыс, которым вводили Pb в сочетании с НЧ TiO2 , наблюдалось дозозависимое снижение количества лимфоцитов в периферической крови (79,4±1,3, 72,6±2,6, 68,9±2,9% в 1, 2 и 3-й группах соответственно; р 1-3 ≤0,05), чего не было выявлено во 2-м эксперименте при введении Pb и НЧ SiO2 . Аналогичные изменения были выявлены и в отношении количества тромбоцитов в периферической крови: у животных, получавших НЧ TiO2 вместе с Pb (2-я и 3-я группы), имело место достоверное снижение количества тромбоцитов в крови по сравнению с животными 1-й группы (866±16×10 9 , 784±52×109 и 776±22×109 дм-3 для 1-3-й групп соответственно р 1-2 ≤0,05, р 1-3 ≤0,05). Изменения в количестве тромбоцитов в периферической крови не наблюдались при введении Pb совместно с НЧ SiO2.

Как следует из данных, представленных в табл. 3, изученные биохимические показатели у животных, получавших НЧ TiO2 и НЧ SiO2 на фоне введения Pb, в основном не отличались от параметров соответствующих групп животных, получавших только Pb. Следует отметить только снижение уровня глюкозы на 13% (p<0,05) во 2-й группе и мочевой кислоты на 28% (р<0,05) в 3-й группе по сравнению с 1-й группой.

Исследование апоптоза гепатоцитов (табл. 4) показало, что у животных, которым вводили Pb и НЧ TiO2 , достоверно увеличивалось количество гепатоцитов, находящихся в ранней стадии апоптоза, при введении обеих изучаемых доз НЧ TiO2 , по сравнению с животными 1-й группы.

В то же время не отмечено увеличения количества мертвых клеток. При введении НЧ SiO2 совместно со Pb достоверных изменений в количестве клеток на ранней и поздней стадиях апоптоза и мертвых клеток не выявлено.

Таким образом, НЧ TiO2 (независимо от дозы) на фоне введения свинца активизировали апоптоз, в то время как НЧ SiO2 практически не влияли на этот процесс.

Таким образом, совместное введение Pb с НЧ TiO2 и НЧ SiO2 в условиях данного эксперимента показало изменения в ряде показателей, которые можно трактовать как некоторое увеличение токсического действия изучаемых веществ. Однако они зависели от вида и дозы вводимых НЧ. При совместном введении Pb с НЧ TiO2 (по крайней мере в наибольшей из доз) имело место снижение концентрации Hb, количества лимфоцитов и тромбоцитов в крови и активация процессов апоптоза гепатоцитов. Введение НЧ SiO2 приводило к достоверному снижению экскреции 5-АЛК, что свидетельствует, по-видимому, об ослаблении тяжести свинцовой интоксикации. Исходя из полученных данных можно заключить, что наблюдаемые изменения у животных в первом эксперименте (с НЧ TiO2 ) обусловлены токсичностью не только Pb, но и самих НЧ TiO2 [8], притом что накопление Pb во внутренних органах не возрастает (в печени) или даже снижается (в остальных изученных органах). Этого не наблюдается при совместном введении Pb и НЧ SiO2 (имеющиеся эффекты практически в полном объеме связаны с воздействием Pb), что позволяет говорить о значительно меньшей токсичности НЧ SiO2 как таковых. Хотя проникновение оксидных НЧ через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта весьма ограничено, как это было показано на примере НЧ TiO2 в исследованиях с использованием радиоактивных индикаторов [1] и электронной микроскопии [5], можно все же предположить, что всасывание этих НЧ в небольших количествах все же имеет место, что и определяет наблюдаемые токсические эффекты.

Таким образом, в настоящем исследовании не получено прямых доказательств увеличения всасывания Pb в желудочно-кишечном тракте за счет его абсорбции на НЧ, а наблюдаемые эффекты были, скорее всего, связаны как с токсичностью самого Pb, так и токсичностью (в изученных дозах) НЧ TiO2 , но не SiO2

Литература

1. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Распопов Р.В. и др. Изучение абсорбции и биораспределения наночастиц некоторых неорганических веществ, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс, с использованием метода радиационных индикаторов // Мед. радиол. и радиац. безопасность. - 2012. - Т. 57, № 3. - С. 5-12.

2. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. Нанотехнологии в пищевых проиводствах: перспективы и проблемы // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

3. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности "АСТИНТЕХ-2010". - Астрахань: ИД "Астраханский университет", 2010. - С. 4-7.

4. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

5. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.

6. Патент Российской Федерации № 2286607.

7. Распопов Р.В., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. Характеристика биодоступности наночастиц нульвалентного селена у крыс // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 36-41.

8. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в виде дисперсии в желудочнокишечный тракт крыс. Сообщение 1. Интегральные, биохимические и гематологические показатели, степень всасывания макромолекул в тонкой кишке, повреждение ДНК // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

9. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

10. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Бекетова Н.А. и др. Влияние пищевых волокон на апоптоз гепатоцитов крыс с алиментарной поливитаминной недостаточностью // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 33-40.

11. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс.

Сообщение 2. Состояние микробиоценоза толстой кишки, продукция цитокинов, аллергическая чувствительность // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

12. Chaudhry Q., Scotter M., Blackburn J. et al. Applications and implications of nanotechnologies for the food sector // Food Addit. Contam. Part A. - 2008. - Vol. 25, N 3. - P. 241-258.

13. Holsapple M.P., Farland W.H., Landry T.D. et al. Research strategies for safety evaluation of nanomaterials, part II: toxicological and safety evaluation of nanomaterials, current challenges and data needs // Toxicol. Sci. - 2005. - Vol. 88, N 1. - P. 12-17.

14. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951

15. Sun H., Zhang X., Zhang Z. et al. Influence of titanium dioxide nanoparticles on speciation and bioavailability of arsenite // Environ. Pollut. - 2009. - Vol. 157, N 4. - P. 1165-1170.

16. Zhang X., Sun H., Zhang Z. et al. Enhanced bioaccumulation of cadmium in carp in the presence of titanium dioxide nanoparticles // Chemosphere. - 2007. - Vol. 67, N 1. - P. 160-166.