Результаты и обсуждение
На основании результатов проведенных исследований размера и формы частиц диоксида кремния независимыми методами установлено, что изученный образец диоксида кремния является НМ. Об этом свидетельствует исследование суспензии образца в концентрации 1 мкг/мл методом ТЭМ (рис. 1, а-в). Установлено, что НЧ диоксида кремния на сеточке распределялись в основном в виде больших агрегатов, состоящих из первичных частиц размером 5, 20, 30, 40, 100 нм, и очень небольшого количества отдельных частиц размером 5-20 нм.
Исследование суспензии образца в концентрации 1 мг/мл методом АСМ показало на сканированных изображениях присутствие НЧ диоксида кремния, находящихся преимущественно в агрегированном состоянии. Агрегаты НЧ присутствовали на всех сканах с размером сканируемой области 20×20 мкм2 . Примеры характерных агрегатов приведены на рис. 2а (размеры агрегатов варьировали, достигая максимальной величины до 2 мкм в одном из измерений). Для всех агрегатов отмечено, что структурным элементом является частица с размерами менее 100 нм. Популяция НЧ в составе агрегатов была однородной по морфологии, состояла из сферических частиц размером от 20 до 60 нм. На рис. 2б представлены агрегаты, полученные при большом увеличении, в результате чего на изображениях хорошо различимы отдельные НЧ в составе агрегатов.
Спектроакустическое исследование водной суспензии диоксида кремния в концентрации 5% по массе показало бимодальное распределение частиц по размерам с преобладанием фракции НЧ со средним размером 20-40 нм (рис. 3).
Анализ размера частиц образца в концентрации 1% по массе методом динамического лазерного светорассеяния позволило установить, что в препарате преобладала фракция НЧ со среднечисловым гидродинамическим диаметром 56,6±32,1 нм, 90-й перцентиль размера - 91,7 нм (рис. 4). Содержание фракции частиц с диаметром более 100 нм не превышало 10% от общего числа частиц.
Результаты изучения острой токсичности показали, что клиническая картина при однократном внутрижелудочном введении через зонд водной суспензии наноструктурного диоксида кремния в высокой дозе (10 000 мг/кг массы тела) характеризовалась снижением двигательной активности животных в первые 20 мин после введения вещества, слабой реакцией на звуковые раздражители, поверхностным дыханием, что обусловлено неспецифической реакцией на процедуру введения через зонд. У мышей контрольной группы были зафиксированы схожие изменения.
В последующий период наблюдения животные сохраняли обычную двигательную активность, безусловные рефлексы и реакции на внешние раздражители исходной высоты, корм поедали охотно. Шерсть животных была чистая, блестящая, гладкая.
На протяжении всего срока наблюдения внешний вид, поведение и динамика прибавки массы тела у животных опытной группы не отличались от аналогичных показателей животных контрольной группы (см. таблицу). Снижения поедаемости корма, наличия признаков интоксикации и гибели животных в обеих группах в течение всего срока наблюдения не было.
Макроскопическое исследование тканей внутренних органов животных не выявило патологических изменений в изучаемой дозе (10 000 мг/кг массы тела). На примере морфологических исследований тощей и ободочной кишки показано, что у мышей опытной группы в гистологических препаратах ободочной кишки все слои хорошо дифференцируются (рис. 5): слизистая покрыта призматическим эпителием, видны бокаловидные клетки, крипты дифференцируются, имеют широкие просветы. Подслизистый слой рыхлый, представлен нежноволокнистой соединительной тканью с тонкостенными сосудами слабого кровенаполнения.
В слизистой и подслизистой оболочках визуализируются единичные лимфоциты (рис. 6). Мышечная оболочка типичного вида: в виде 2 слоев (продольного и циркулярного) гладкомышечных клеток. Серозная оболочка тонкая. Гистологические препараты тощей кишки характеризуются сохранностью слоев (рис. 7): кишечные ворсины слизистой тонкие, крипты хорошо дифференцируются, бокаловидные клетки прослеживаются на всем протяжении. Во всех отделах слизистой оболочки небольшие скопления лимфоцитов (рис. 8). Мышечная оболочка тонкая, состоит из двух слоев разнонаправленных пучков гладкомышечных волокон. Серозная оболочка тонкая, содержит единичные лимфоциты.
У животных контрольной группы (данные не приведены) в гистологических препаратах ободочной кишки визуализируется неизмененная структура стенки. В гистологических препаратах тощей кишки отмечается сохранность структуры стенки, кишечные ворсинки тонкие с рыхлой стромой, прослеживаются бокаловидные клетки.
Таким образом, каких-либо различий в морфологии препаратов тощей и ободочной кишки между животными контрольной и опытной групп не выявлено.
Анализ полученных результатов позволяет сделать заключение, что водная суспензия наноструктурного диоксида кремния при однократном внутрижелудочном введении через зонд мышам в дозе 10000 мг/кг не вызывает гибели и явлений интоксикации. Изменений в интегральных показателях общего состояния экспериментальных животных не наблюдается. В гистологических препаратах ободочной и тощей кишки какие-либо морфологические изменения не выявлены. Таким образом, по критерию LD 50 (больше 10 000 мг/кг) изученный наноструктурный диоксид кремния с размером первичных частиц 20-60 нм в виде водной суспензии относится к IV классу опасности (малоопасные вещества) при пероральном пути введения в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. Низкая острая токсичность НЧ диоксида кремния при их введении через желудочно-кишечный тракт может быть связана с весьма низкой биодоступностью (всасываемостью) НЧ диоксида кремния при однократном внутрижелудочном введении, как это можно предположить по аналогии с другими видами оксидных наночастиц (оксиды титана, лантана), не проникающих или очень слабо проникающих через слизистую оболочку кишки, по данным электронной микроскопии [4, 8]. Косвенно об этом свидетельствует и выявленное в настоящей работе отсутствие видимых морфологических изменений в слизистой оболочке тощей и ободочной кишки животных, однократно получавших НЧ SiO2 в высокой дозе.
Вместе с тем в условиях длительного (подострого и хронического) введения НЧ SiO2 в желудочно-кишечный тракт нельзя исключить проникновения их небольших количеств во внутреннюю среду организма по механизмам персорбции [22], накопления во внутренних органах и возможного токсического действия. Нельзя также исключить и наличия у этого наноматериала и косвенного механизма воздействия на организм, через влияние на состав кишечного микробиоценоза.
Поэтому следующим этапом токсикологической оценки НЧ диоксида кремния будет изучение их воздействий на организм лабораторных животных в длительном эксперименте.
Авторы благодарят А.А. Лошкарева, ведущего эксперта Метрологического центра РОСНАНО (г. Долгопрудный) за проведение спектроакустического исследования.
Литература
1. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. Нанотехнологии в пищевых производствах: перспективы и проблемы // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.
2. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов наноструктурированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Материалы междунар. науч. конф. "АСТИНТЕХ-2010". - Астрахань: ИД "Астраханский университет", 2010. - Т. 3. - С. 4-7.
3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н. и др. Токсикологогигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. - 2013. - № 1. - С. 65-72.
4. Морозов И.А., Хвыля С.И., Лысиков Ю.А. Электронномикроскопическое изучение проницаемости энтероцитов тонкой кишки для коллоидного лантана в опытах in vitro и in vivo // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 1982. - Т. 68, № 9. - С. 1261-1268.
5. О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы: Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 54 от 23.07.2007.
6. О надзоре за производством и оборотом продукции, содержащей наноматериалы: Информационное письмо Роспотребнадзора № 0100/4502-07-02 от 02.05.2007 г.
7. Обоснование гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования: Методические указания. МУ 2.1.5.720-98.
8. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. Влияние наночастиц диоксида титана на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.
9. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов: Метод. указания. МУ 1.2.2520-09.
10. Ebbesen M., Jensen T.G. Nanomedicine: techniques, potentials, and ethical implications // J. Biomed. Biotechnol. - 2006. - N l. - Article ID51516. - P. 1-11.
11. Eom H.-J., Choi J. Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 7. - P. 1326-1332.
12. Eom H.-J., Choi J. Nanoparticles induced cytotoxicity by oxidative stress in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Environ. Health Toxicol. - 2011. - Vol. 26. - P. e2011013.
13. Fisichella M., Dabboue H., Bhattacharyya S. et al. Mesoporous silica nanoparticles enhance MTT formazan exocytosis in HeLa cells and astrocytes 2009 // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 4. - P. 697-703.
14. Guide for the care and use of laboratory animals. 8 th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. - Washington: The National Academies Press, 2011. - 248 p.
15. Holsapple M.P., Farland W.H., Landry T.D. et al. Research strategies for safety evaluation of Nanomaterials. Part II. Toxicological and safety evaluation of nanomaterials, current challenges and data needs // Toxicol. Sci. - 2005. - Vol. 88, N 1. - P. 12-17.
16. Meynen P., Cool E., Vansant F. Verified syntheses of mesoporous materials // Microporous and Mesoporous Materials. - 2009. - Vol. 125, N 3. - P. 170-223.
17. Nabeshi H., Yoshikawa T., Matsuyama K. et al. Amorphous nanosilica induce endocytosis-dependent ROS generation and DNA damage in human keratinocytes // Part. Fibre Toxicol. - 2011. - Vol. 8, N 1. - P. 1-10.
18. Napierska D., Thomassen L.C., Rabolli V. et al. Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in hu-man endothelial cells // Small.- 2009.- Vol. 5, N 7.- P. 846-853.
19. Park M.V., Annema W., Salvati A. et al. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, N 1.- P. 108-116.
20. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.
21. Thomassen L.C., Aerts A., Rabolli V. et al. Synthesis and characterization of stable mono-disperse silica nanoparticle sols for in vitro cytotoxicity testing // Langmuir.- 2010.- Vol. 26, N 1.- P. 328-335.
22. Volkheimer G. Persorption of particles: physiology and pharmacology // Adv. Pharmacol. Chemother. - 1977. - Vol. 14. - P. 163-187.
23. Yang H., Wu Q., Tang M. et al. In vitro study of silica nanoparticle-induced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol.- 2010.- Vol. 10, N 1.- P. 561-568.
24. Yang X., Liu J., He H. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells // Part Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-10.
25. Ye Y., Liu J., Xu J. et al. Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 751-758.