Влияние фитоэкдистероидов на гормональный статус и апоптоз у растущих крыс

Резюме

Изучено влияние 15-дневного потребления фитоэкдистероидсодержащего экстракта Serratula coronata на некоторые показатели гормонального статуса и активность апоптоза в различных органах растущих крыс-самцов линии Вистар (масса тела 127,8±2,5 г). Животным 2-й и 3-й опытных групп (n=8 в каждой группе) ежедневно в воду добавляли сухой экстракт из листьев серпухи венценосной из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов на 1 кг массы тела. Животные контрольной группы (n=8) получали в течение всего эксперимента воду без добавки. Ежедневно фиксировали объем выпитой жидкости. На 15-е сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. В плазме крови иммуноферментным методом определяли содержание кортикостерона, простагландина Е2 и β-эндорфина. Содержание в плазме крови норадреналина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В изолированных клетках тимуса, сердца и головного мозга методом щелочного гель-электрофореза (метод ДНК-комет) определяли уровень ДНК повреждений, а также процент апоптотических клеток (индекс апоптоза). Статистически достоверно (р≤0,05) более низкие концентрации норадреналина обнаружены в плазме крови животных 2-й и 3-й опытных групп (10,3±1,1 и 7,2±0,8 нг/мл соответственно) по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы (20,4±3,4 нг/мл). Достоверных различий средних значений других определяемых биохимических показателей для всех трех групп животных не выявлено. Соотношение кортикостерон/норадреналин статистически достоверно выше (р≤0,05) у крыс, потреблявших максимальную дозу фитоэкдистероидов, по сравнению с животными контрольной группы (4,29±1,01 против 1,11±0,56). Не выявлено достоверных различий в степени фрагментации ДНК и индексе апоптоза у животных, получавших фитоэкдистероидсодержащие экстракты, по сравнению с животными контрольной группы. Отсутствие повышения активности апоптоза в клетках сердца, мозга и тимуса у крыс, потреблявших тестируемый экстракт, может свидетельствовать в пользу безопасности его использования в питании этих животных.

Ключевые слова:адаптоген, фитоэкдистероиды, норадреналин, индекс апоптоза, степень фрагментации ДНК

Вопр. питания. - 2014. - № 2. - С. 16-21.

Согласно современным представлениям фитоэкдистероиды - полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоз членистоногих. Они обнаружены не только в лекарственных, но и в пищевых растениях, то есть могут рассматриваться как минорные компоненты пищи.

20-гидроксиэкдизон (20Е), обладающий адаптогенным действием, был выделен из таких растений, как левзея сафлоровидная, серпуха венценосная, а также шпинат [2, 11]. Фитоэкдистероиды могут рассматриваться как адаптогены, то есть биологически активные соединения, способные повышать неспецифическую сопротивляемость организма к неблагоприятным воздействиям различной природы [6, 11].

Cоответственно, представляют интерес экспериментальные исследования влияния фитоэкдистероидов на биомаркеры общего адаптационного синдрома Селье как при отсутствии стрессорного воздействия, так и при его последующем проявлении. Множественность фармакологических эффектов в сочетании с низкой токсичностью одного из наиболее изученных фитоэкдистероидов 20Е позволяет использовать его в составе лекарственных препаратов [5] и биологически активных добавок (БАД) к пище, особенно в питании спортсменов [1, 3, 10]. Перспективным природным источником фитоэкдистероидов являются растения рода Serratula L (сем. Asteraceae), в частности серпуха венценосная (Serratula coronata), в наземной части которой содержание 20Е составляет около 2% в пересчете на сухую массу [11]. В водном экстракте наземных частей Serratula coronata, помимо 20-гидроксиэкдизона, присутствует другой мажорный экдистероид - 25S-инокостерон [2].

В данном сообщении представлены результаты экспериментального исследования влияния 15-дневного потребления фитоэкдистероидсодержащего экстракта Serratula coronata на некоторые показатели гормонального статуса и активность апоптоза в различных органах крыс-самцов линии Вистар.

Материал и методы

При проведении исследования использовали половозрелых крыс-самцов линии Вистар, полученных из питомника "Столбовая". Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики" и требованиями, изложенными в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики".

Половозрелые крысы-самцы Вистар, полученные из питомника "Столбовая", после 7-дневного карантина были помещены в отдельные клетки по одной особи в каждой, они получали стандартный общевиварный рацион [7], сбалансированный по содержанию основных макрои микронутриентов. Эксперимент проведен с использованием 24 животных, разделенных на 3 группы по 8 особей в каждой. Средние значения массы тела животных контрольной группы (1-й) и опытных групп (2-й и 3-й) перед началом эксперимента составили соответственно 127,6±2,5, 127,9±2,6 и 127,9±2,4 г.

Водный экстракт из листьев растения серпухи венценосной (Seratulla coronata L.) получали согласно [9]. Количественный анализ содержания фитоэкдистероидов в полученном водном сухом экстракте серпухи венценосной проводили методом ВЭЖХ на приборе "Agilent 1100 Series" (Agilent Technology, США) с дегазатором и насосом [18].

Пробу наносили на колонку Atlantis C18 4,6×250 мм, 5 мкм, скорость элюирования 0,9 мл/мин, подвижная фаза: вода (А) - ацетонитрил (В), аналитическая длина волны 247 нм, объем вводимой пробы - 10 мкл. Суммарное содержание фитоэкдистероидов в сухом экстракте составило 61,5 мг/г, концентрации 20Е и 25S-инокостерона - соответственно 40,6 и 14,2 мг/г.

Крысы 2-й и 3-й опытных групп вместо воды получали водный раствор этого экстракта из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов (суммарно) на килограмм массы тела. Животные контрольной группы получали в течение всего эксперимента воду. Крыс ежедневно осматривали, фиксировали объем выпитой жидкости и регулярно через сутки взвешивали. Продолжительность эксперимента составила 15 сут, по его окончании животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию для извлечения внутренних органов: тимуса, мозга и сердца; тимус взвешивали.

Кровь собирали в пробирки с предварительно добавленным раствором Трилона Б (1,25%, 400 мкл) и отделяли плазму крови центрифугированием при t=4 °С, 3000 об/мин в течение 25 мин на центрифуге "J-6B" ("Beckman", Австрия).

В плазме крови с использованием коммерческих наборов определяли содержание кортикостерона (набор "Corticosterone EIA kit", "Immunodiagnostic System", Великобритания), простагландина Е2 (набор "Rat Prostaglandin E2 (PGE2) ELISA Kit", "CUSABIO", Китай) и β-эндорфина (набор "Peptide Enzyme immunoassay (EIA) kit", "Bahem", США) иммуноферментным методом.

Содержание в плазме крови норадреналина определяли методом ВЭЖХ [8] c модификациями. Пробоподготовку тестируемых образцов проводили следующим образом: плазму крови (1-2 мл) фильтровали через шприцевой фильтр с размерами пор 0,2 мкм, добавляли 1/10 от объема плазмы 1,0 М Трис-HCl буфер (рН 8,6) и проверяли значение рН по универсальному индикатору.

Затем добавляли 30 мкл раствора внутреннего стандарта - 3,4-дигидробензиламина гидробромида ("ALDRICH", США) и количественно наносили на стеклянную микроколонку (0,5×1,0 см) с окисью алюминия (нейтральная, по Брокману II, "ХромРесурс", РФ), уравновешенную 0,1 М Трис-HCl буфером, рН 8,5-8,6. Промывали колонку 3,0 мл дистиллированной воды при центрифугировании со скоростью 1500 об/мин (центрифуга "ОПН-3", РФ) и затем элюировали катехоламины и 3,4-дигидробензиламина гидробромид 300 мкл 1,0 М уксусной кислоты при тех же режимах центрифугирования. Полученный смыв наносили на хроматографическую колонку (Nucleodur C18, 5 мкм, 250×5 мм), предварительно откалиброванную по стандартам определяемых катехоламинов (норадреналина, адреналина, "ALDRICH", США) и внутреннему стандарту. Состав подвижной фазы: 0,1 М фосфатно-цитратный буфер, рН 4,0, содержащий 50 мг/л ион-парного реагента (1-октансульфоновой кислоты натриевая соль для ВЭЖХ, "Dudley Chemical", США) и 2,5% ацетонитрила (квалификации "для ВЭЖХ"). Объем вводимого образца составлял 100 мкл. Скорость элюирования - 1,0 мл/мин.

В качестве детектора использовали амперометрический детектор (НПО "Химавтоматика, Россия, программное обеспечение "Мультихром 3", Россия) со стеклоуглеродным электродом и рабочим напряжением +1,0 В.

В изолированных клетках тимуса, сердца и головного мозга методом щелочного гель-электрофореза (метод ДНК-комет) определяли уровень ДНК-повреждений, а также процент апоптотических клеток (индекс апоптоза) [4]. Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК.

Микроскопический анализ проводили на микроскопе "Zeiss Axio Imager Z1" ("Zeiss", Германия) при увеличении 400×. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения "Comet Imager system" ("Metasystems GmbH", Германия). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы ≥75%. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 клеток [13, 14].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Общее состояние всех животных при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным: по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению и скорости роста не выявлено отличий у животных, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт, по сравнению с животными контрольной группы. Прирост массы тела крыс всех групп соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста. Относительное увеличение массы тела животных за весь эксперимент для контрольной группы 1 и опытных групп 2 и 3 составило соответственно 58,3±2,2, 59,9±2,3 и 59,3±2,3% и достоверно между группами не различалось.

Визуальная оценка и взвешивание тимуса не выявили каких-либо неблагоприятных изменений этого органа у животных всех групп.

В табл. 1 представлены результаты определения средних значений содержания кортикостерона, норадреналина, β-эндорфина и простагландина Е2 в плазме крови крыс всех групп по окончании эксперимента.

Статистически достоверно более низкие значения концентраций норадреналина обнаружены в плазме крови животных обеих опытных групп по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. При этом самое низкое содержание этого катехоламина отмечено у крыс, потреблявших фитоэкдистероиды из расчета 15 мг/кг массы тела. Достоверных различий других определяемых биохимических показателей для всех трех групп животных не выявлено.

Cтатистически достоверное различие соотношения кортикостерон/норадренолин по сравнению с контрольной группой животных установлено также для крыс 3-й группы, потреблявших максимальную дозу фитоэкдистероидов, достоверных различий с опытной 2-й группой не выявлено (рисунок).



Как следует из данных, представленных в табл. 2, не выявлено достоверных различий в степени фрагментации ДНК и индексе апоптоза у животных, получавших фитоэкдистероидсодержащие экстракты, по сравнению с животными контрольной группы.

При обсуждении выявленного в работе достоверного снижения (по сравнению с животными контрольной группы) содержания норадреналина в крови крыс, потреблявших фитоэкдистероидсодержащий экстракт, приведем гипотетические предположения, выдвинутые авторами некоторых научных публикаций. Так, в работах [15-17] обсуждается возможная связь проявляемого биологически активными соединениями адаптогенного эффекта с их структурной схожестью с наиболее важными эндогенными стресс-медиаторами симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем: катехоламинами - активаторами стресссистемы - и кортикостероидами - ингибиторами стресс-системы, защищающими организм от чрезмерной реакции по отношению к стрессорному воздействию. Предполагается, что в отсутствие воздействия на организм экзогенного стрессора адаптоген сам способен играть роль мягкого прострессора, изменяющего соотношение наиболее важных активаторов и ингибиторов стресса. Такое сбалансированное адекватное изменение уровня наиболее важных стресс-медиаторов может снижать их "избыточное" возрастание при последующем стрессорном воздействии [12]. 20-гидроксиэдизон и 25S-инокостерон - это полигидроксилированные стерины, химическая структура которых близка структуре кортикостерона - основного и наиболее активного глюкокортикостероида у крысы.

Как было показано в условиях данного эксперимента, потребление лабораторными животными фитоэкдистероидсодержащего экстракта привело к дозозависимому снижению содержания норадреналина в крови и достоверному повышению соотношения кортикостерон/норадреналин, выявляемому при наибольшей дозе потребляемых фитоэкдистероидов. Выяснение вопроса о том, может ли такое изменение благоприятно повлиять на адаптацию животного к дисстрессу, должно стать предметом наших дальнейших исследований. Как было установлено, ежедневное потребление крысами в течение 15 дней экстракта серпухи венценосной из расчета 5 и 15 мг фитоэкдистероидов на 1 кг массы тела не влияло на активность апоптоза. Отсутствие повышения активности апоптоза в клетках сердца, мозга и тимуса у крыс, потреблявших тестируемый экстракт, может свидетельствовать в пользу безопасности его использования в питании этих животных.

Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке программы президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" (проект № 12-П-4-1023: "Научные основы создания адаптогеннных и геропротекторных средств растительного происхождения").

Литература

1. Бойко Е.Р., Володин В.В., Мартынов Н.А. и др. Сочетанное влияние витаминно-минерального комплекса Витабаланс-мультивит и БАД "Серпистен" на физическую работоспособность лыжников-гонщиков высокой квалификации // Сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участ. "Спорт и медицина. Сочи-2013". 19-22 июня 2013 г. - Сочи, 2013. - С. 34-36.

2. Володин В.В., Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов // Вестн. биотехнологии. - 2011. - Т. 7, № 2. - С. 52-59.

3. Володин В.В., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. 20-гидроксиэкдизон - растительный адаптоген: анаболическое действие, возможное использование в спортивном питании // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 6. - С. 24-31.

4. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. - М., 2006. - 27 с.

5. Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен - тонизирующее средство в таблетках по 0,005 г // Новые лекарственные препараты. - М., 1990. - Вып. 6. - С. 16-18.

6. Лазарев, Н.В., Люблина Е.И., Розин М.А. Состояние неспецифически повышенной сопротивляемости // Пат. физиол. - 1959. - Т. 3, № 2. - С. 16-21.

7. Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 "Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения".

8. Сидорова А.А., Карцова Л.А. Хроматографическое и электрофоретическое определение катехоламинов, метанефринов и 3,4-дигидроксифенилаланина в моче и плазме крови // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2009. - Т. 9, вып. 6. - С. 774-782.

9. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Василевская Л.С. и др. Влияние внутрижелудочного введения фитоэкдистероидов на некоторые показатели гормонального статуса крыс линии Вистар // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 4. - С. 22-26.

10. Сыров Н.В. Фармокологическая оценка фитоэкдистероидов и созданных на их основе препаратов как потенциальных стимуляторов психической и физиологической активности в нормальных и осложненных условиях // 5-я междунар. конф. "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам". - М., 2010. - С. 84-85.

11. Фитоэкдистероиды / Под ред. В.В. Володина. - СПб.: Наука, 2003. - 293 с.

12. Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. - СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2008. - С. 129.

13. Chandna S. Single-cell gel electrophoresis assay monitors precise kinetics of DNA fragmentation induced during programmed cell death // Cytometry A. - 2004. - Vol. 61, N 2. - P. 127-133.

14. Smith C.C., Adkins D.J., Martin E.A. et al. Recommendations for design of the rat comet assay // Mutagenesis. - 2008. - Vol. 23, N 3. - P. 233-240.

15. Panossian A., Wikman G., Wagner H. Plant adaptogens III. Earlier and more recent aspects and concepts on their mode of action // Phytomedicine. - 1999. - Vol. 6, N 4. - P. 287-300.

16. Panossian A., Wikman G. Effect of adaptogens on the central nervous system // Arq. Bras. Fitomed. Cientifica. - 2005. - Vol. 3, N 1. - P. 29-51.

17. Panossian A.G. Adaptogens: A historical overview and perspective // Nat. Pharmacy. - 2003. - Vol. 7 (4), N 1. - P. 19-20.

18. Zimmer Aline R., Bruxel Fernanda. HPLC method for the determination of ecdysterone in extractive solution from Pfaffia glomerata // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2006. - Vol. 40. - P. 450-453.