Коррекция изопротеренолового повреждения миокарда у крыс разными формами магния в условиях его алиментарного дефицита
РезюмеПроведено сравнительное изучение влияния 3-недельного введения магния L-аспарагината, магния хлорида и магния сульфата на интенсивность ишемии миокарда, вызванной подкожным введением изопротеренола (30 мг/кг, дважды с интервалом 24 ч), у животных с дефицитом магния. Дефицит магния вызывали у 28 крыс кормлением рационом с низким содержанием магния (<15 мг/кг) и использованием деминерализованной воды. Через 7 нед животные были рандомизированно разделены на 4 группы: животные 1-й группы продолжали получать магнийдефицитный рацион, животные 2-й группы на фоне дефицитного рациона получали per os MgSO4, 3-й группы - Mg-L-Asp и 4-й группы - MgCl2 (50 мг магния на кг массы тела). Животные контрольной группы в течение 10 нед получали полноценный рацион (содержание магния составило 500 мг/кг) и воду (20 мг/л). На 70-й день эксперимента у крыс, получавших магнийдефицитную диету, концентрация магния в плазме крови и эритроцитах была на 47 и 45% ниже, чем у животных, получавших магнийсбалансированный рацион (p<0,05). Изопротеренол вызывал у магнийдефицитных животных более выраженное повышение уровня активности креатининкиназы (в 3,06 раза против 1,91 у интактных) и аспартатаминотрансферазы (в 4,67 раза против 3,92 у интактных). После введения изопротеренола объемная плотность фуксинофильных кардиомиоцитов в группе, получавшей магнийдефицитную диету, возросла до 54,2±1,7%, тогда как в группе, получавшей магнийсбалансированный рацион, она составила 38,9±1,9% (p<0,05). Магния хлорид, магния сульфат, магния L-аспарагинат, вводимые профилактически в течение 21 сут, уменьшали чувствительность миокарда к повреждающему действию изопротеренола.
Ключевые слова:изопротеренол, алиментарный дефицит магния, ишемия миокарда, магния L-аспарагинат, магния сульфат, магния хлорид
Вопр. питания. - 2013. - № 5. - С. 29-35.
За последние 50 лет поступление магния в организм снизилось - в развитых странах 61% населения не получает рекомендуемого количества магния с пищей [12]. Основными причинами этого является характер питания (активное внедрение системы фаст фуд, современные технологии обработки зерна, в ходе которой теряется до 97% магния [15], изменение экологической обстановки, уменьшение содержания магния в экосистеме в целом, а также применение различных лекарственных препаратов (диуретиков, сердечных гликозидов, антибиотиков, противоопухолевых средств) [11]. Кроме того, важным фактором в формировании алиментарного дефицита магния служит снижение его содержания в питьевой воде, равно как и рост соотношения кальций/магний, что сопровождается возрастающим риском развития ишемической болезни сердца [19, 22].
Соединения магния широко применяются в терапии сердечно-сосудистых заболеваний [9, 26].
Ранее было проведено большое количество исследований по изучению влияния дефицита магния и его соединений на формирование очага ишемии миокарда. Например, D.M. Demaria и соавт. в исследованиях на изолированном сердце показали, что магния хлорид, вводимый перед ишемией или в период реперфузии, способствует уменьшению площади инфаркта до 4,5 и 18% соответственно (в группе экспериментальной патологии, не получавшей лечения, площадь некроза составила 44%) [10]. Вместе с тем результаты клинических исследований эффективности препаратов магния, в основном магния сульфата, в условиях миокардиальной ишемии неоднозначны. Так, в исследовании LIMIT-2 магния сульфат снижал смертность больных инфарктом миокарда в течение первых 4 нед на 24%. В то же время в исследовании ISIS-4 статистически значимого снижения смертности не выявлено [17, 23, 27]. Ранее при изучении скорости компенсации дефицита магния его различными солями было показано, что максимально быстрое восполнение дефицита магния достигалось при введении магния L-аспарагината и магния хлорида [6].
Одной из моделей ишемии миокарда вследствие повышенной симпатической стимуляции является индукция патологических изменений с помощью токсических доз изопротеренола [18]. По данным A.H. Atrakchi и соавт., дефицит магния усугубляет течение ишемии при введении данного β-адреномиметика [8]. Вместе с тем вопрос о сравнительной эффективности различных солей магния в условиях данной патологии остается открытым.
Целью исследования было сравнительное изучение влияния магния L-аспарагината, магния хлорида и магния сульфата на интенсивность изопротеренол-индуцированной ишемии миокарда у животных с дефицитом магния.
Материал и методы
Эксперимент проведен на 45 крысах-самцах массой 200-240 г. Животных содержали в условиях вивария, согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ Р 50258-92, ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе исследований Волгоградского государственного медицинского университета. Интактная группа животных составляла контроль (n=6).
У 33 крыс вызывали магнийдефицитное состояние, для моделирования которого использовали специальную магнийдефицитную диету [5, 25], в состав которой входили казеин (20,0%), крахмал (70,0%), DL-метионин (0,3%), холина битартрат (0,2%), кукурузное масло (5%), витаминная смесь (1%) и минеральная смесь, не содержащая магний (3,5%), аналогичная минеральной смеси AIN-76 фирмы "MP Biomedicals" (США, Ohio).
Весь рацион готовили на деионизированной воде, эту же воду в ходе эксперимента использовали в качестве питьевой воды для животных, находящихся на диете. Интактные животные получали полноценную диету, содержащую 0,84 г MgO на 1 кг диеты, что соответствовало 0,5 г элементарного магния на кг диеты.
Скорость и глубину развития гипомагнезиемии контролировали, определяя содержание магния в эритроцитах животных по цветной реакции с титановым желтым [2]. Снижение концентрации магния до уровня менее 1,4 ммоль/л в эритроцитах свидетельствовало о развитии у животных гипомагнезиемии средней тяжести. Через 7 нед части животных, получавших диету, ежедневно перорально вводили магния L-аспарагинат, магния хлорид или препарат сравнения магния сульфат в дозе 50 мг элементарного магния на кг массы тела.
На 70-й день эксперимента животным вводили изопротеренол в дозе 30 мг/кг подкожно, дважды с интервалом 24 ч [1]. Через 24 ч после второго введения изопротеренола проводили забор крови для определения ферментов - маркеров ишемического повреждения. Активность креатинкиназы (КК), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли с помощью коммерчески доступных наборов реактивов производства "Витал Диагностик" (Россия): "АСТ-01", "ЛДГ-01" и "Креатинкиназа-03". Также рассчитывали процент гибели животных. В последующем проводили морфологическую оценку срезов миокарда, окрашенных по стандартным методикам гематоксилином и эозином, гематоксилином-основным фуксином-пикриновой кислотой (ГОФП) по Лии [3].
Для изучения морфологического состояния сократительного аппарата кардиомиоцитов применяли метод поляризационной микроскопии. Для исследования в поляризационном свете использовали окрашенные гематоксилином и эозином срезы ткани миокарда. На срезах сердца с помощью системы анализа изображений и программы "Видеотест-Морфо-4" (Россия) определяли такой морфометрический показатель, как объемную плотность фуксинофильных кардиомиоцитов.
Вариационно-статистическую обработку данных проводили с использованием пакета анализа данных в программе Excel Microsoft Office XP и программы STATISTICA 6.0 (Statsoft, USA). При проведении дисперсионного анализа данных применяли критерий Манна-Уитни. Значимыми считали различия, если вероятность ошибки р≤0,05.
Результаты и обсуждение
На 70-й день эксперимента у крыс, получавших магнийдефицитную диету, было зарегистрировано статистически значимое снижение концентрации магния в плазме крови и эритроцитах соответственно на 47 и 45% по сравнению с животными, получавшими магнийсбалансированный рацион.
Изопротеренол вызывал у магнийдефицитных животных более выраженное повышение активности КК (в 3,06 раза против 1,91 у интактных) и АСТ (в 4,67 раза против 3,92 у интактных) (табл. 1). Таким образом, можно заключить, что при дефиците магния развивалось более выраженное изопротеренол-индуцированное повреждение миокарда. Тем не менее степень повышения активности ЛДГ после воздействия изопротеренола оказалась сравнимой у интактных и магнийдефицитных животных (в 2,35 и 2,21 раза соответственно). Повышенная чувствительность магнийдефицитных животных к изопротеренолу в определенной степени подтверждалась тенденцией к более высокой смертности магнийдефицитных животных (45%) в результате воздействия изопротеренола по сравнению с интактными животными (16,6%) (табл. 2).
После двукратного введения изопротеренола при морфологическом исследовании миокарда крыс (табл. 3), получавших магнийполноценную диету, отмечалась дистрофия кардиомиоцитов.
Мышечные клетки окрашивались эозином неравномерно, поперечной исчерченности во многих из них не было видно. Было отмечено увеличение объемной плотности кардиомиоцитов с фуксинофильной цитоплазмой при окраске по Лии до 38,9±1,9% по сравнению с интактной группой, не получавшей изопротеренол, где ишемические изменения практически не отмечались. В артериях среднего и мелкого калибра обнаруживались признаки спазма, плазматического пропитывания стенки и выраженного периваскулярного отека.
В капиллярах отмечались склеивание эритроцитов в столбики по 10-15 штук (сладж-феномен) и диапедез эритроцитов, периваскулярно определялась выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация.
Таблица 1. Влияние солей магния на активность креатинкиназы, лактатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы после изопротереноловой интоксикации (30 мг/кг подкожно) (M±m)
)
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 2, 3: * - статистически значимые отличия от интактных животных (p<0,05; критерий Манна-Уитни); ** - статистически значимые отличия от интактных животных + изопротеренол (p<0,05; критерий Манна-Уитни); # - статистически значимые отличия от животных, содержавшихся на магнийдефицитной диете (p<0,05; критерий Манна-Уитни); ## - статистически значимые отличия от магний-дефицитных животных + изопретеренол (p<0,05; критерий Манна-Уитни); ИЗО - изопротеренол; Деф.
Mg - группа, получавшая магнийдефицитную диету.
Таблица 2. Влияние солей магния на выживаемость (%) после изопротереноловой интоксикации (30 мг/кг подкожно)
)
Таблица 3. Влияние солей магния на объемную плотность фуксинофильных кардиомиоцитов после изопротереноловой интоксикации (30 мг/кг подкожно) (M±m)
)
В препаратах сердец крыс с дефицитом магния, не получавших изопротеренол, отмечались гетерогенность кардиомиоцитов по отношению к красителям (эозину и пикриновой кислоте) и деформация отдельных мышечных волокон. Обнаруживались эозинофильные мышечные сегменты с пикнотичными ядрами. В миокарде отмечались выраженное капиллярное и венозное полнокровие, периваскулярный и интерстициальный отек, дистрофия интрамуральных артерий миокарда, мелкие очаги периваскулярных кровоизлияний. Просвет сосудов был зачастую деформирован. В адвентиции сосудов и периваскулярно определялись гистиоциты.
В периваскулярном пространстве и межпучковых прослойках соединительной ткани наблюдалось увеличенное количество соединительнотканных клеток, причем среди них преобладали фибробласты и макрофаги. Объемная плотность фуксинофильных кардиомиоцитов составила 35,7±2,1%, т.е. даже без действия повреждающего фактора в миокарде магнийдефицитных животных были выявлены ишемические изменения, что согласуется с полученными ранее данными [4].
У животных с дефицитом магния после введения изопротеренола в препаратах миокарда обнаруживались дистрофические изменения кардиомиоцитов (вакуольная дистрофия). Отмечались умеренное венозное полнокровие, спазм интрамуральных артерий среднего и мелкого калибра, их плазматическое пропитывание и выраженный периваскулярный отек. Наблюдалось набухание эндотелия. Периваскулярно располагались рассеянные лимфогистиоцитарные инфильтраты.
В межмышечных пространствах встречались мелкие очаги подобных инфильтратов, не связанных с сосудами. Обнаруживались признаки разрастания молодой соединительной ткани (периваскулярный склероз). Объемная плотность фуксинофильных кардиомиоцитов возросла до 54,2±1,7%, при этом она статистически значимо превосходила данный показатель в группах магнийдефицитных животных, получавших и не получавших (табл. 3) соли магния.
В группах животных, получавших соли магния в течение 3 нед, отмечалось повышение концентрации магния в плазме крови и эритроцитах до контрольных значений.
Соли магния при профилактическом введении приводили к небольшому снижению смертности, вызванной изопротеренолом. Тем не менее при оценке смертности не удалось обнаружить статистически значимых отличий ни в одном случае (табл. 2).
После повторного введения изопротеренола у животных, получавших магния хлорид и магния аспарагинат, активность АСТ была сравнима с таковой у интактных животных, а у животных, получавших магния сульфат, была достоверно ниже, чем в интактной группе. Уровень активности ЛДГ после инъекций изопротеренола был статистически не отличим у интактных животных и животных, получавших сульфат или хлорид магния, а у животных, получавших магния аспарагинат, был достоверно ниже на 27%. К понижению активности КК до уровня, сравнимого с группой интактных животных с интоксикацией изопротеренолом, приводило лишь применение магния сульфата и магния аспарагината. После инъекций изопротеренола у животных, получавших магния хлорид, повышение активности КК было большим, чем у интактных, но меньшим, чем у магнийдефицитных животных. Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что магния сульфат и магния аспарагинат в наибольшей степени корригировали патологические изменения ферментного профиля, вызванные изопротеренолом у магнийдефицитных животных.
При морфологическом исследовании в группах животных, получавших соли магния, изопротеренол приводил к менее выраженным ишемическим изменениям в миокарде (р<0,05) по сравнению с группой, получавшей магнийдефицитный рацион. Так, объемная плотность фуксинофильных кардиомиоцитов уменьшилась по сравнению с группой магнийдефицитных животных на 21% в группе крыс, получавших магния L-аспарагинат, и на 23% - в группах крыс, получавших магния сульфат и магния хлорид (табл. 3).
Таким образом, дефицит магния приводит к достоверно более выраженному повышению активности ферментов после введения изопротеренола, что в совокупности с данными морфологического исследования свидетельствует о более интенсивном развитии ишемического повреждения миокарда. Данные результаты согласуются с полученными ранее данными A.H. Atrakchi и соавт. [8]. Подъем активности АСТ и КК в ответ на введение изопротеренола магнийдефицитным животным был более выражен, чем в интактной группе, тогда как различия между приростом ЛДГ были мало выражены. Этот факт можно объяснить следующим образом: повышение активности КК в сыворотке крови как биомаркера инфаркта миокарда начинается через 4-6 ч от начала развития инфаркта и достигает своего пика к 18-24-му часам. Аналогично, но позднее реагирует активность АСТ. В то же время активность ЛДГ является самым поздним маркером некроза кардиомиоцита, поскольку ее повышение начинается не ранее 10-го часа от начала инфаркта и достигает пика в течение 2 сут после его развития. В наших экспериментах кровь для анализа брали через 24 ч после повторной инъекции изопротеренола, т.е. в ходе первых суток от возможного момента начала предполагаемого инфаркта миокарда. Таким образом, активности КК и АСТ уже могли приближаться к пиковым, и отличия между опытной и контрольной группами характеризовали различия в объеме ишемизированной ткани.
Как было показано ранее, дефицит магния снижает функциональные резервы миокарда, в том числе и в ответ на введение адреналина [24], что может объясняться нарушением энергетического баланса в миокарде при росте его потребности в кислороде [28]. При снижении уровня магния усиливается синтез эндотелина-1, являющегося мощным вазоконстрикторным фактором и стимулирующего симпатические окончания сердца [14], снижается активность эндотелиальной NO-синтазы [20]. Дефицит магния способствует перегрузке кальцием [21], что приводит к необратимой активации цистеиновых протеаз, в частности кальпаина, и служит одной из причин гибели кардиомиоцитов [16]. Окислительный стресс также вносит весомый вклад в патогенез ишемического повреждения, вызванного изопротеренолом при дефиците магния.
Так, A.M. Freedman и соавт. показали, что α-токоферол снижает выраженность ишемических изменений, вызванных изопротеренолом у магнийдефицитных животных [13].
В нашем исследовании магния L-acпарагинат, магния сульфат и магния хлорид предотвращали выраженный рост активности ферментов - маркеров ишемии по сравнению с группой крыс, находившихся на магнийдефицитной диете. При морфологическом исследовании было показано, что изучаемые соли примерно в равной степени обеспечивали кардиопротективный эффект. Это может быть связано с менее выраженной перегрузкой кальцием, возникающей при введении катехоламинов в условиях превентивной терапии препаратами магния, что согласуется с данными, полученными R. Alcalai и соавт., в исследованиях которых магний у крыс с отсутствием гена кальсеквестрина снижал активность кальциевых каналов L-типа и рианодиновых рецепторов [7]. При изучении скорости компенсации дефицита магния различными его соединениями было показано, что магния L-аспарагинат приводит к 100% восстановлению уровня магния в эритроцитах на 10-е сут введения, магния хлорид - на 12-е, магния сульфат на 19-е [6]. Таким образом, по-видимому, к моменту введения изопротеренола на 21-е сут введения изучаемых соединений было достигнуто насыщение депо, восстановлен уровень магния в кардиомиоцитах, миоцитах сосудов и эндотелиоцитах, поэтому эффект разных солей оказался сопоставимым.
Заключение
Дефицит магния приводит к более выраженным ишемическим изменениям миокарда в условиях симпатической стимуляции, что подтверждается более интенсивной ферментемией и большим объемом ишемизированных кардиомиоцитов, выявленных при морфологическом исследовании.
Магния L-аспарагинат, магния сульфат и магния хлорид в равной степени уменьшали выраженность ишемических изменений в условиях интоксикации изопротеренолом.
Литература
1. Гурова Н.A., Харитонова М.В., Паньшин Н.Г. и др. // Волгогр. науч.-мед. журн. - 2012. - № 2. - С. 51-54.
2. Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.
3. Микроскопическая техника: Руководство для врачей и лаборантов / Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М., 1996. - 544 с.
4. Смирнов А.В., Паньшин Н.Г., Спасов А.А. и др. // Вестн. нов. мед. технол. - 2010. - Т. ХVII, № 2. - С. 42.
5. Спасов А.А., Иежица И.Н., Харитонова М.В. и др. // Экспер. и клин. фармакол. - 2008. - Т. 71, № 4. - С. 35-40.
6. Спасов А.А., Петров В.И., Иежица И.Н. и др. // Вестн. РАМН. - 2010. - № 2. - С. 29-37.
7. Alcalai R., Wakimoto H., Arad M. et al. // Cardiovasc. Electrophysiol. - 2011. - Vol. 22, N 3. - Р. 316-324.
8. Atrakchi A.H., Bloom S., Dickens B.F. et al. // Cardiovasc. Pathol. - 1992. - Vol. 1, N 2. - P. 155-160.
9. Beckstrand R.L., Pickens J.S. // J. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. - 2011. - Vol. 16, N 3. - P. 181-189.
10. Demarнa D.R.M., Cingolani H.E., Mosca S.M. // Exp. Clin. Cardiol. - 2003. - Vol. 8, N 1. - P. 17-20.
11. Fawsett W.J., Haxby E.J., Male D.A. // Br. J. Anaesth. - 1999. -Vol. 83. - P. 302-320.
12. Ford E.S., Mokdad A.H. // J. Nutr. - 2003. - Vol. 133, N 9. - P. 2879-2882.
13. Freedman A.M., Atrakchi A.H., Cassidy M.M. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1990. - Vol. 170, N 3. - P. 1102-1106.
14. Fu L.W., Guo Z.L., Longhurst J.C. // J. Physiol. - 2010. - Vol. 588 (Pt 13). - P. 2473-2486.
15. Hans C.P., Sialy R., Bansal D.D. // Curr. Sci. - 2002. - Vol. 83, N 12. - P. 25.
16. Hernando V., Inserte J., Sartоrio C.L. et al. // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2010. - Vol. 49, N 2. - С. 271-279.
17. ISIS-4: a randomised factorial trial assessing early oral captopril, oral mononitrate, and intravenous magnesium sulphate in 58,050 patients with suspected acute myocardial infarction. ISIS-4 (Fourth International Study of Infarct Survival) Collaborative Group // Lancet. - 1995. - Vol. 18, N 345 (8951). - Р. 669-685.
18. Kung H.F., Blau M. // J. Nucl. Med. - 1978. - Vol. 19, N 8. - Р. 948-951.
19. Morii H., Matsumoto K., Endo G. et al. New perspectives in magnesium research: nutrition and health / Eds Y. Nishizawa, H. Morii, J. Durlach. - London: Springer-Verlag, 2007. - P. 11-18.
20. Paravicini T.M., Yogi A., Mazur A., Touyz R.M. // Hypertension. - 2009. - Vol. 53, N 2. - Р. 423-429.
21. Rob P.M., Goebel Y., Lebeau A., Classen H.G. // Clin. Investig. - 1994. - Vol. 72, N 2. - Р. 137.
22. Rylander R., Bonevik H., Rubenowitz E. // Scand. J. Work Environ. Health. - 1991. - Vol. 17. - P. 91-94.
23. Shechter M., Hod H., Rabinowitz B. et al. // Cardiology. - 2003. - Vol. 99, N 4. - Р. 205-210.
24. Spasov A.A., Iezhitsa I.N., Kharitonova M.V. et al. // Микроэлементы в медицине. - 2010. Vol. 11, N 2. - P. 64.
25. Spasov A.A., Iezhitsa I.N., Kravchenko M.S. et al. // Neurosci. Behav. Physiol. - 2009. Vol. 39, N 7. - Р. 645-653.
26. Ueshima K. // Magnes. Res. -2005. - Vol. 18, N 4. - Р. 275-284.
27. Woods K.L., Fletcher S., Roffe C., Haider Y. // Lancet. - 1992 - Vol. 27, N 339 (8809). - Р. 1553-1558.
28. Yang W., Lee J.Y., Nowotny M. // Mol. Cell. - 2006. - Vol. 22. - P. 5-13.