Определение хондроитин сульфата в биологически активных добавках к пище методом капиллярного зонального электрофореза

РезюмеХондроитин сульфат широко представлен в качестве одного из активных ингредиентов в составе биологически активных добавок (БАД) к пище. Для качественного и количественного анализа хондроитин сульфата в БАД к пище была разработана методика капиллярного зонального электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза Agilent 3D CE (США) со спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (регистрировали спектр поглощения в диапазоне длин волн 190-400 нм, для количественного определения детектирование проводили при длине волны 192 нм), кварцевого капилляра Agilent с эффективной длиной 56 см (США) (внутренний диаметр 50 мкм; температура 25 °С; напряжение 30 кВ; полярность отрицательная) и 50 мМ фосфатного буфера (рН 3,5). Предел количественного определения разработанной методики составил 0,5 г/кг. При помощи разработанной методики было определено содержание хондроитин сульфата в составе 14 образцов БАД к пище. По результатам проведенных исследований хондроитин сульфат был обнаружен во всех испытуемых образцах с отклонением от декларированного содержания (25-600 мг/капсула или таблетка) на уровне от 1 до 9%. Показана применимость разработанной методики для оценки качества БАД к пище и специализированных пищевых продуктов, содержащих хондроитин сульфат.

Ключевые слова:хондроитин сульфат, капиллярный электрофорез

Вопр. питания. - 2013. - № 3. - С. 67-71.

Хондроитин сульфат (ХС) широко представлен в качестве одного из активных ингридиентов в составе биологически активных добавок (БАД) к пище. На данный момент в России зарегистрировано более 140 БАД к пище, содержащих ХС (по данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека). БАД к пище, содержащие ХС, как правило, используются для профилактики ряда нарушения опорно-двигательного аппарата. ХС в составе БАД к пище характеризуется достаточно хорошей биодоступностью - в системный кровоток поступает около 12-15% ХС, причем, как было показано в эксперименте, большая часть абсорбированного ХС, меченного изотопами, обнаруживается в синовиальной ткани и суставном хряще [4].

Основным источником ХС являются хрящевая ткань крупного рогатого скота, свиней, а также птицы (куры) и акул [1, 6]. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионтов. Современные методы получения ХС представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки [5]. В связи с этим актуальным является вопрос стандартизации БАД к пище, содержащих ХС.

По химической структуре ХС представляет собой сульфатированный глюкозаминогликан, состоящий из длинных неразветвленных полисахаридных цепей с повторяющимися остатками N-ацетилгалактозамина и глюкуроновой кислоты (общей сложностью до 100 углеводных остатков). Большинство N-ацетилгалактозаминовых остатков сульфатированы в 4-м и 6-м положениях. Полисахаридные цепи, образуя ковалентные связи с белками, формируют протеогликаны, которые совместно с макромолекулами коллагена (главным образом II типа) обеспечивают уникальные свойства экстрацеллюлярного матрикса: растяжимость ткани и ее устойчивость к компрессии. Молекула ХС обладает полианионными свойствами, благодаря чему участвует в транспорте воды, аминокислот и липидов в аваскулярных участках хряща, что обеспечивает вязкоэластичные и механические свойства ткани [1, 6, 5].

Для качественной и количественной оценки ХС используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез (КЭ). Описаны различные методики определения ХС методом ВЭЖХ. Чаще всего используется градиентный тип элюирования, а для детектирования применяют спектрофотометрический детектор на диодной матрице, а также масс-спектрометрическое или флуорометрическое (после дериватизации) детектирование [7, 8, 10, 15, 17, 18]. Оптимальным представляется использование КЭ в связи с ионогенными свойствами исследуемого вещества. Метод основан на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле [2, 3]. При помощи КЭ исследуют различные группы биологически активных соединений, в том числе и глюкозаминогликаны. Существуют различные варианты методик КЭ для исследования ХС в составе различных объектов (табл. 1). Недостатком описанных методик является невозможность их применения для анализа содержания ХС в пищевых продуктах, в том числе в БАД к пище, без адаптации предложенных условий.

Таким образом, целью работы являлась разработка методики определения ХС методом капиллярного зонального электрофореза в БАД к пище и специализированных пищевых продуктах.

Материалы и методы

Электрофоретическое разделение проводили на системе КЭ Agilent 3D CE (США) с диодноматричным детектором, на кварцевом капилляре Agilent Lэ/Lо=56/64 см (США), внутренний диаметр капилляра 50 мкм; температура термостата 25 °С; эффективное напряжение 30 кВ; полярность отрицательная. Общее время анализа 20 минут. Детектирование проводили при длине волны 192 нм. Ввод пробы осуществляли гидродинамически (300 мбар/10 с) автосемплером.

Перед началом работы капилляр последовательно промывали 0,1 М раствором натрия гидроксида, деионизированной водой и рабочим буфером (50 мМ фосфатный буфер, рН=3,5). Этот же буфер использовали для анализа ХС.

Центрифугирование образцов проводили на центрифуге Eppendorf 5418 (Германия), встряхивание - на шейкере Biosan OS-10 (Латвия), озвучивание - на УЗ-ванне CTBRAND (Китай).

Для приготовления буфера использовали деионизированную воду (Milli-Q, США), а также однозамещенный фосфат натрия, моногидрат марки "ч.д.а.", фосфорную кислоту марки "ч.д.а.". Для пробоподготовки применяли дистиллированную воду.

Таблица 1. Условия определения хондроитин сульфата методом капиллярного электрофореза

Стандартные вещества и приготовление стандартных растворов

В качестве стандартного вещества использовали субстанцию натриевой соли ХС, полученную из коровьего хряща (Chondroitin sulfate sodium salt from bovine cartilage 100%, Sigma-Aldrich). Готовили рабочие стандартные растворы с концентрацией 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мг/см3, при необходимости озвучивая на УЗ-ванне до полного растворения вещества, и центрифугировали их 10 мин при 20 000g. Стандартные рабочие растворы хранили при температуре 2-8 °С в течение одной недели.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования были выбраны содержащие ХС БАД к пище и специализированные пищевые продукты (14 образцов), приобретенные в аптеках Москвы.

Подготовка проб. Около 0,5-2,0 г (точная навеска) тщательно измельченного образца помещали в мерную колбу вместимостью 100 см3, экстрагировали 50 см3 воды очищенной, встряхивали на шейкере в течение 10 мин, озвучивали на УЗ-ванне в течение 2 мин. Далее доводили объем раствора образца до метки деионизированной водой и перемешивали. Полученный раствор центрифугировали в течение 10 мин при 20 000 g и анализировали надосадочную жидкость.

Условия электрофоретического разделения

Рабочий буфер. Для анализа ХС использовали 50 мМ фосфатный буферный раствор, рН 3,5, который предварительно фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Перед работой новый капилляр последовательно промывали 5 мин 1 М раствором натрия гидроксида, 5 мин деионизированной водой и 5 мин рабочим буфером. Между анализами для промывки капилляра использовали следующую схему: 3 мин 0,1 М раствором натрия гидроксида, 3 мин деионизированной водой и 3 мин рабочим буфером.

Детектирование. Детектирование ХС проводили на спектрофотометрическом детекторе на диодной матрице при длине волны 192 нм (диапазон 190-400 нм). Выбор длины волны объясняется стремлением достичь наибольшей чувствительности методики. ХС на электрофореграмме идентифицировали путем сравнения со стандартом по времени миграции и спектру в УФ-области спектра. В качестве примера идентификации ХС в предложенных условиях на рис. 1 и 2 приведены электрофореграммы стандартного раствора и БАД к пище. Количественное содержание ХС оценивали методом абсолютной градуировки по внешнему стандарту.

Результаты и обсуждение

При помощи разработанной методики было определено содержание ХС в составе 14 БАД к пище и специализированных пищевых продуктов (см. табл. 2). Декларированное значение ХС составляло от 25 до 600 мг в 1 капсуле или таблетке (или 44,6-375 мг/г). В одном случае исследовали раствор с содержанием ХС 4 г/100 см3. По результатам проведенных исследований ХС был обнаружен во всех испытуемых образцах с отклонением от заявленного содержания на уровне от 1 до 9% (в растворе отклонение составило 5%).

Рис. 1. Электрофореграмма стандартного раствора хондроитин сульфата

Рис. 2. Электрофореграмма биологически активного вещества к пище, содержащего хондроитин сульфат

Предел повторяемости предложенной методики составил 14%, предел воспроизводимости - 8%, показатель точности - 23%.

Таким образом, разработанная методика может быть использована в целях контроля качества БАД к пище, содержащих ХС. Нижний предел количественного определения составил 0,5 г/кг, что позволяет проводить определение содержания ХС в БАД к пище и специализированных пищевых продуктах.

Таблица 2. Содержание хондроитин сульфата в биологически активных добавках к пище и специализированных пищевых продуктах

Литература

1. Алексеева Л.И., Шарапова Е.П. // РМЖ. - 2009. - № 21. - С. 14-48.

2. Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. // Вопр. питания. - 2011. - № 3. - С. 67-74.

3. Богачук М.Н., Передеряев О.И., Раменская Г.В. // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. - 2011. - № 9. - С. 14-22.

4. Горячев Д .В. // РМЖ. - 2008. - Т. 16, № 10. - С. 693-698.

5. Порцель М.Н. Разработка технологии получения хондроитин сульфата из гидробионтов Баренцева моря и изучение его физико-химических свойств: Автореф. дис. - канд. техн. наук. - Мурманск, 2011. - С. 3.

6. Шкарина Т .Н. Анализ и стандартизация хондроитин сульфата натрия: Автореф. дис. - канд. фармацевт. наук. - М., 2009. - 24 с.

7. David J.I., Mark R., Joseph Z. et al. // J. AOAC Int. - 2007. - Vol. 3, N 90. - P. 659-669.

8. Deakin G.A., Lyon M. // Glycobiology. - 2008. - Vol. 18, N 6. - P. 4 8 3 - 4 9 1.

9. Elisabetta Z., Antonio Junior L., Antonio C. et al. // Biochem. Res. Int. - 2011. - Vol. 2012. - Article ID 281284.

10. Frazier S.B., Roodhouse K.A., Hourcade D.E. et al. // Open Glycosci. - 2008. - Vol. 1. - P. 31-39.

11. Hitchcock A.M., Bowman M.J., Staples G.O. et al. // Electrophoresis. - 2008. - Vol. 22, N 29. - P. 4538-4548.

12. Malavaki C.J., Athanasia P., Lamari F.N. et al. // Anal. Biochem. - 2008. - Vol. 374. - P. 213-220.

13. Marco G., Zhenqing Z., Zachary S. et. al. // PNAS. - 2009. - Vol. 106, N 40. - P. 16956-16961;

14. Sadatoshi M., Takayoshi M., Janet K. et al. // J. Vet. Med. Sci. - 2001. - Vol. 9, N 63. - P. 1039-1043;

15. Solakyildirim K., Zhang Z., Linhardt R.J. // Anal. Biochem. - 2010. - Vol. 1, N 397. - P. 24-28.

16. Zamfir A., Seidler D.G., Kresse H. et al. // Glycobiology. - 2003. - Vol. 13,- N 11. - P. 733-742.

17. Zhenling L., Zhongping X., Sayaka M. et al. // Anal. Biochem. - 2011. - Vol. 1, N 408. - P. 147-156.

18. Zhou J.Z., Waszkuc T., Mohammed F. // J. AOAC. - 2004. - Vol. 87, N 5. - P. 1083-1092.