Ускоренный метод определения зараженности продовольственного зерна грибами рода Fusarium и их видовой идентификации (сообщение 1)

Резюме

В настоящее время зараженность зерна грибами Fusarium spp. определяется общепринятым методом микологического посева и может длиться до 30-40 сут. При этом специфичность метода в большой степени зависит от субъективной оценки исследователей. Альтернативой традиционным микологическим методам является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)-идентификации. Целью настоящего исследования было совершенствование метода анализа зараженности продовольственного зерна грибами Fusarium для сокращения времени анализа и повышения специфичности видовой идентификации при использовании метода ПЦР. Исследования проводили на образцах продовольственного зерна урожая 2009-2011 гг. из 5 федеральных округов РФ. На первом этапе делали посев 100 зерен на картофельно-сахарозную среду и термостатировали при 24 °С в течение 7-10 сут. На втором этапе определяли видовой состав грибов рода Fusarium, выросших из зерна, с использованием двух методов. Первый метод - микологический для моноспоровых изолятов. Второй - ПЦР-анализ экстракта ДНК из объединенной пробы мицелия грибов Fusarium, выросших в образце зерна. Для идентификации методом ПЦР использовали видоспецифичные праймеры продуцентов микотоксинов: F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrchiodes, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum. Видовой состав жизнеспособных Fusarium spp., выявленный в образцах зерна микологическим методом, полностью совпал с результатами ПЦР-анализа.

В результате был предложен метод, который сочетает традиционный метод микологического посева для выявления жизнеспособных видов с видовой идентификацией методом ПЦР из объединенной пробы мицелия. Указанный метод в 3-4 раза сокращает время исследований за счет исключения стадии рассева при получении моноспоровых изолятов грибов для последующей видовой идентификации. Метод также позволяет получать достоверные данные о жизнеспособных видах Fusarium, в том числе продуцентах фузариотоксинов, в продовольственном зерне. Таким образом, реализована идея усовершенствования этапа видовойидентификации, позволяющая сократить трудозатраты и увеличить специфичность метода.

Ключевые слова:Fusarium spp., ускоренное обнаружение микотоксигенных плесневых грибов, ПЦР в реальном времени, продовольственное зерно, зараженность продовольственного зерна Fusarium spp., видовая идентификация Fusarium spp.

Вопр. питания. - 2013. - № 3. - С. 61-66.

В настоящее время зараженность зерна Fusarium spp. Выявляется общепринятым методом микологического посева [2], осуществляемым в несколько этапов: первичный посев поверхностно стерилизованного зерна на агаризованную среду с последующим отбором характерных колоний по внешним признакам и под контролем микроскопии; рассевы для выделения моноспоровых изолятов; посев на идентификационные среды для оценки макро- и микроморфологических признаков и определение видовой принадлежности при сопоставлении с описанием в определителях. Общие затраты времени на весь комплекс исследований до получения окончательного результата составляют от 30 до 40 сут. При таком подходе специфичность метода в большой степени зависит от субъективной оценки исследователя. Однако известно, что виды, сходные фенотипически и морфологически, могут проявлять очень большие различия (F. langsethiae и F. poae, первый из них является сильнейшим продуцентом Т-2- и НТ-2-токсинов, а второй образует их лишь в следовых количествах и то не всегда) [11, 12].

Кроме того, по мере накопления данных филогенетических, морфологических и токсикологических исследований многие существовавшие ранее самостоятельно виды Fusarium реклассифицированы в одноименные комплексы видов, например F. graminearum, F. oxysporum, F. solani. Вид F. moniliforme, в соответствии с изменениями в систематике грибов, принятыми на VIII Международном совещании по грибам рода Fusarium в 1998 г., был переименован в F. verticillioides, а близкородственные виды отнесены к комплексу грибов Gibberella fujikuroi, включающему F. verticillioides, F. sacchari, F. fujikuroi, F. proliferatum, F. subglutinans, F. thapsinum, F. nygamai, F. circinatum, F. konzum. Общим признаком для этого комплекса грибов является присутствие в окраске мицелия различных оттенков лилового цвета, отсутствие розового и красного пигментов, а также отсутствие способности к биосинтезу трихотеценовых микотоксинов [4]. Идентификация видов комплекса G. fujikuroi сложна морфологически и для точного разграничения видовой принадлежности изолятов требуется проведение дополнительных исследований, в частности по спектру продуцируемых метаболитов.

Учитывая вышеизложенное, очевидно, что в испытательных лабораториях для видовой идентификации Fusarium spp. требуется наличие специально подготовленного (в области микологии) квалифицированного персонала.

Альтернативой традиционным микологическим методам являются методы идентификации с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с различными форматами детекции результатов (гель-электрофорез, флуоресценция в процессе амплификации - ПЦР в реальном времени или после ее завершения - FLASH ПЦР) [7]. Высокая чувствительность и специфичность методов на основе ПЦР-анализа позволяет выявлять ДНК токсигенных грибов не только в культуре, но и непосредственно в пищевых продуктах, а при сочетании с анализом загрязненности тех же партий зерна микотоксинами позволяет получить цельную картину присутствия конкретных продуцентов и их токсинов в продовольственных цепях. Быстрота анализа (в течение суток) и возможность одновременного тестирования большого количества образцов зерна и зерновых продуктов, а также выделенных продуцентов дает методам ПЦР неоспоримые преимущества перед классическим микологическим методом посева.

Целью настоящего исследования с учетом вышеизложенного было совершенствование метода анализа зараженности продовольственного зерна грибами рода Fusarium, их видовой идентификации с применением метода ПЦР для повышения специфичности и скорости определения.

Поставленную задачу решали двумя способами:

- ускорение этапа идентификации Fusarium spp. в зерне с помощью ПЦР, минуя стадии рассева и получения моноспоровых изолятов;

- прямое обнаружение в зерне ДНК наиболее вероятных продуцентов трихотеценовых микотоксинов (ТТМТ).

Материал и методы

Отработку данного подхода к изучению зараженности грибами рода Fusarium и определение видовой принадлежности Fusarium spp. проводили на образцах продовольственного зерна урожая 2009-2011 гг. из 5 федеральных округов РФ с известными уровнями загрязнения ТТМТ - Т-2- и НТ-2-токсинами [13].

Метод микологической идентификации Fusarium spp. Содержание Fusarium spp. во внутренней микофлоре зерна оценивали путем посева 100 поверхностно стерилизованных зерен исследуемого образца на агаризованную картофельносахарозную среду (КСА). После термостатирования при 24±1 °С через 7-14 сут проводили рассевы для получения моноспоровых изолятов, что особенно важно для корректной видовой идентификации, в соответствии с ранее описанной методикой [2]. В качестве идентификационных сред использовали: картофельно-сахарозную среду (КСА), синтетическую среду Ниренберг (СНА) и гвоздичнолистовой агар (ГЛА). Видовую принадлежность моноспоровых изолятов Fusarium spp. устанавливали по совокупности макро- и микроморфологических признаков при сопоставлении с описаниями в определителях грибов рода Fusarium широко используемых в мире в настоящее время [8-10].

Идентификацию Fusarium spp. на основе ПЦР в режиме реального времени проводили в 2 этапа:

1. Экстракция ДНК из мицелия грибов. Пробу объединенного мицелия, полученного на 7-14-е сутки после посева 100 зерен, составляли (с соблюдением правил асептики) путем отбора частей мицелия от всех выросших грибов, исключая мукоровые, темноокрашенные, аспергиллы и пенициллы, и последующего объединения. Для экстракции ДНК использовали набор "Проба ГС" производства ООО "ДНК-технология", рекомендованный для диагностики фитопатогенов методом ПЦР [6], в том числе для грибов рода Fusarium. Общую пробу мицелия растирали в фарфоровой ступке с 0,3 см3 лизирующего буфера из набора. Полученную суспензию переносили в пластиковые пробирки объемом 1,5 см3 и термостатировали при 50 °С в течение 20 мин, периодически перемешивая. Затем после центрифугирования при 16 000g в течение 5 мин супернатант переносили в пробирки, добавляли предварительно ресуспендированный сорбент, после чего проводили экстракцию в соответствии с методикой, прилагаемой к набору. В результате получали экстракт ДНК из пробы объединенного мицелия жизнеспособных видов Fusarium spp. для каждого образца зерна.

2. Проведение ПЦР в режиме реального времени. Использовали коммерческие наборы реагентов (производства ООО "Агродиагностика") для ПЦР-амплификации с видоспецифичными праймерами для определения: F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrchiodes, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum с фрагментами ДНК гена фактора элонгации трансляции 1α (tef-1α) [7].

Набор включал амплификационную смесь (ПЦРбуфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, видоспецифичные праймеры для Fusarium spp., флуоресцентные ДНК-зонды, внутренний контрольный образец); минеральное масло; раствор Taq-полимеразы; положительный контрольный образец ДНК. Реакцию амплификации проводили в формате "Real-Time PCR" на детектирующем амплификаторе ABI PRISM 7500 (Applied Biosistems, США) по режиму, представленному в табл. 1.

Таблица 1. Режим амплификации

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы было проведено исследование зараженности зерна видами Fusarium spp. традиционным методом микологического посева. Видовой состав грибов в исследуемых образцах зерна был количественно выражен в виде показателя - зараженность зерна определенным видом Fusarium, который рассчитывали как отношение числа зерен, зараженных определенным видом Fusarium, к числу анализируемых зерен в образце (100 шт.) в процентном выражении [2]. Полученные данные представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 следует, что зараженность исследованных образцов зерна грибами рода Fusarium варьировала в широком диапазоне - от 0 до 83%. Доминировал комплекс грибов G. fujikuroi (встречаемость от 0 до 39%). Далее в порядке убывания следовали F. tricinctum, F. sporotrichiodes, F. avenaceum, F. poae, F. culmorum, F. semitectum, F. graminearum, F. oxisporum, F. sambucinum. В ячмене выявлены 10 видов Fusarium, а также виды комплекса G. fujikuroi. В образцах овса чаще отмечалось присутствие F. tricinctum.

Среди выявленных видов грибов к потенциальным продуцентам фузариотоксинов относятся: F. sporotrichiodes (Т-2- и НТ-2-токсины, диацетоксисцирпенол), F. graminearum (дезоксиниваленол, ниваленол) и F. culmorum (дезоксиниваленол, ниваленол), F. poae (ниваленол, диацетоксисцирпенол), F. sambucinum (Т-2-токсин, диацетоксисцирпенол).

На втором этапе определение видового состава Fusarium в тех же образцах зерна проводили методом ПЦР с видоспецифичными праймерами.

Обнаружение Fusarium spp. в экстрактах ДНК из пробы объединенного мицелия проводили методом ПЦР в реальном времени с праймерами для 7 наиболее часто встречаемых видов на территории РФ [1-3, 5], продуцирующих ТТМТ. Полученные данные в сравнении с результатами микологического посева приведены в табл. 3 (образцы зерна № 6-18).

Из полученных данных следует, что видовой состав жизнеспособных Fusarium spp., обнаруженный в образцах зерна микологическим методом, полностью совпал с результатами ПЦР-анализа.

Таблица 2. Зараженность образцов зерна определенными видами Fusarium spp. (% зерен из 100 исследуемых)

Таблица 3. Видовой состав жизнеспособных Fusarium spp., обнаруженных в зерне методом полимеразной цепной реакции с видоспецифичными праймерами и методом микологического посева

Таблица 4. Сравнительная характеристика использованных методов обнаружения жизнеспособных грибов рода Fusarium в продовольственном зерне

Проведенная сравнительная характеристика двух используемых подходов представлена в табл. 4.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что длительный и трудоемкий метод микологической идентификации может быть заменен методом, сочетающим микологический посев с видовой идентификацией методом ПЦР в реальном времени из объединенной пробы мицелия. Применение такого подхода значительно - в 3-4 раза! - позволяет сократить время исследований, исключив стадии рассева при получении моноспоровых изолятов для последующей видовой идентификации. Предложенный новый подход позволяет получать достоверные данные о жизнеспособных видах Fusarium, в том числе продуцентах фузариотоксинов, в продовольственном зерне. Таким образом, реализована идея усовершенствования этапа идентификации, позволяющая сократить трудозатраты и увеличить специфичность.

Стоит отметить, что в настоящее время систематика на основе филогенетических исследований в микологии еще находится в стадии развития, ведется активный поиск новых генетических маркеров для таксономической характеристики видов, поэтому набор видоспецифичных праймеров, позволяющих определять широкий спектр видов Fusarium, пока ограничен. Но бурное развитие этой области исследований в последнее время позволит в будущем перевести метод ДНК-идентификации токсигенных грибов в разряд рутинных методов для контроля их в зерне и зернопродуктах.

Литература

1. Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю. // Защита и карантин растений. - 2010. - № 2. - С. 23-25.

2. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Левитин М.М. и др. Фузариоз зерновых культур // Приложение к журн. "Защита и карантин растений". - 2011. - № 5. - 52 с.

3. Гагкаева Т.Ю., Ганнибал Ф. Б., Гаврилова О.П. // Защита и карантин растений. - 2011. - № 5. - С. 37-41.

4. Гагкаева Т.Ю., Левитин М.М. // Микология и фитопатология. - 2005. - Т. 39, № 6. - С. 1-14.

5. Гагкаева Т.Ю., Левитин М.М., Санин С.С.и др. // Агро ХХI. - 2009. - № 4-6. - С. 4-6.

6. Методические указания. Диагностика токсигенных возбудителей фузариоза зерна методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией результатов с использованием наборов производства ООО "АгроДиагностика". - М., 2012. - 20 с.

7. Рязанцев Д.Ю., Абрамова С.Л., Евстратова С.В. и др. // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34(6). - С. 799-807.

8. Gerlach W., Nirenberg H. The genus Fusarium - a Pictorial Atlas Mitt. - Berlin: Biol. Bundesanst, 1982. - 406 p.

9. Leslie J.F., Summerell B.A. The Fusarium laboratory manual. - Blackwell, 2006. - 388 p.

10. Nelson P.E., Toussoun T.A., Marasas W.F.O. Fusarium species: An Illustrated Manual for Identifications. - The Pennsylvania State University Press, 1983. - 193 p.

11. Thrane U., Adler A., Clasen P. E., Galvano F. et al. // Int. J. Food Microbiol. - 2004. - Vol. 95. - P. 257-266.

12. Torp M., Nirenberg H.I. // Int. J. Food Microbiol. - 2004. - Vol. 95. - P. 247-256.

13. Tutelyan V.A., Zakharova L.P., Sedova I.B. et al. Food Additives and Contaminants: Part B: Surveillance, Accepted author version posted online: 21 Jan. 2013.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»