Лактофлора толстой кишки крыс при алиментарном полигиповитаминозе и измененном жировом составе рациона

РезюмеВ опытах на крысах-самцах Вистар (с исходной массой тела 97-121 г) изучено влияние витаминной обеспеченности и состава жирового компонента рациона на состояние популяций лактофлоры кишечника. Установлено, что 28-дневное содержание животных на рационе с неизмененным жировым составом и 5-кратном по сравнению с животными контрольной группы дефицитом витаминов в корме при полном исключении из рациона витамина Е не отражается на количестве лактобактерий в содержимом слепой кишки. У крыс, находящихся в течение 28 дней на указанном витаминодефицитном рационе, в котором подсолнечное масло в равном количестве (на сухой вес рациона) замещено на льняное масло (при сохранении пропорции 1:1 с жиром животного происхождения - лярдом) отмечается статистически достоверное повышение количества лактобактерий по сравнению как с таковым у животных контрольной группы (9,78±0,08 против 8,82±0,33 lg КОЕ/г, р=0,018), так и у животных, находящихся на рационе с дефицитом витаминов (9,03±0,18 lg КОЕ/г, р=0,006). Восполнение дефицита витаминов в последующие 14 сут путем увеличения количества витаминной смеси до 70 и 200% от содержания в рационе животных контрольной группы не повлияло на количество лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс вне зависимости от дозы витаминов и состава жирового компонента.

Ключевые слова:алиментарный полигиповитаминоз, полиненасыщенные жирные кислоты семейства ω-3, льняное масло, слепая кишка, лактобактерии, крысы

Вопр. питания. - 2013. - № 2. - С. 66-69.

Микрофлора кишечника, как известно, является мощным фактором, влияющим на естественную неспецифическую резистентность организма и состояние метаболических процессов в нем. Большую роль в этом играют облигатные резидентные популяции нормальной микрофлоры пищеварительного тракта - бифидо- и лактобактерии. Однако механизм влияния лактофлоры желудочнокишечного тракта (ЖКТ) на модуляцию иммунитета, толерантность к пищевым и микробным антигенам, метаболизм макро- и микронутриентов до конца не изучены [1, 2, 8, 10], поэтому при коррекции пищевых рационов важно знать реакцию резидентной лактофлоры кишечника на поступающие в организм с пищей нутриенты и биологически активные вещества. Целью настоящей работы было исследование влияния витаминной обеспеченности и состава жирового компонента рациона крыс на состояние популяций лактофлоры толстой кишки.

Материал и методы

Указанные эксперименты проводили на крысах-самцах массой тела 97-121 г, полученных из питомника НЦБМТ РАМН "Столбовая".

Животные после 5-дневного нахождения на рационе вивария были разделены на контрольную и 2 опытные группы. Животные контрольной группы (12 крыс) получали в течение всего эксперимента (в течение 42 дней) полноценный полусинтетический рацион. Рацион содержал 20% казеина по ГОСТ 536672009 (содержание белка 82-84%), 64% кукурузного крахмала, 9% жира (смесь подсолнечного масла и лярда 1:1), 3,5% солевой смеси, 1% смеси витаминов, 0,3% L-цистеина, 0,25% холина битартрата, 2% микрокристаллической целлюлозы.

Животные 1-й и 2-й опытных групп (по 18 крыс в каждой группе) получали в течение 28 дней рацион, дефицитный по содержанию всех витаминов. Дефицит витаминов в рационе вызывали уменьшением количества добавляемой в корм витаминной смеси в 5 раз. Это достигали тем, что в корм животных указанных опытных групп добавляли смесь витаминов лишь в количестве 20% от их содержания в полноценном рационе крыс контрольной группы. Одновременно из корма животных указанных опытных групп исключали D,L-α-токоферола ацетат [2, 3]. Рацион крыс 2-й опытной группы был не только дефицитным по содержанию витаминов, но и модифицированным по жировому составу. Модификация жирового компонента рациона заключалась в замене подсолнечного масла на льняное в равном количестве на сухой вес рациона при сохранении его пропорции 1:1 с жиром животного происхождения (лярд).

По истечении 28 дней эксперимента крысы обеих опытных групп были разделены на 2 подгруппы (по 9 животных в каждой) и составили соответственно 3, 4, 5 и 6-ю опытные группы. Животные этих групп в течение 14 дней получали рацион с восполненным уровнем витаминов в пределах от 20 до 70% (3-я и 5-я группы) и 200% (4-я и 6-я группы) от содержания в витаминной смеси рациона животных контрольной группы.

Корм (средневзвешенное количество 15 г/сут) и воду животные всех групп получали ad libitum. Еженедельно у всех животных как контрольной, так и опытных групп путем взвешивания определяли массу тела.

За 20 ч до окончания эксперимента (на 28-й день при витаминном дефиците и на 42-й день при восполнении витаминов в рационе) животных лишали корма. Затем крыс умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом. Сразу после вскрытия у животных отбирали печень, определяли ее абсолютную и относительную массу, и с помощью общепринятых флюоресцирующих методов проводили определение содержания в органе витаминов А, Е, В1 и В2 [1-4].

Одновременно у 6 животных из каждой группы лигировали слепую кишку и на секции отбирали ее для проведения в дальнейшем микробиологических исследований. Для этого содержание толстой кишки (ceacum) асептически извлекали, количественно разводили регенерированным фосфатнотиогликолевым буфером (калия дигидрофосфат - 4,5 г, натрия гидрофосфат - 6,0 г, агар-агар - 1,0 г, тиогликолевая кислота - 0,4 см3 на 1000 см3 воды дистиллированной) и засевали на плотную среду МРС (агар для лактобактерий по де Мену, Рогозе и Шарпу) для выделения и подсчета лактобактерий. Посевы инкубировали в течение 3 сут в термостате в атмосфере СО2 при 37 °С. По окончании культивирования проводили учет и микроскопию препаратов из всех типов выросших колоний. Изоляты, состоящие из бесспоровых грамположительных палочек, проверяли на отсутствие каталазы и по этим первичным признакам относили к роду Lactobacillus. Количество микроорганизмов выражали в десятичном логарифме (lg) колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сырой массы содержимого кишки. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета Статистика (версия 6.0). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Как было показано в проведенных ранее исследованиях [1-4], масса тела, масса печени, а также средняя скорость прироста массы тела животных всех опытных групп достоверно не отличались от показателей у животных контрольной группы, тогда как содержание витаминов А, Е, В1 и В2 в печени было достоверно сниженно, что свидетельствовало о развитии у животных опытных групп сочетанного дефицита витаминов.

Данные подсчета количества лактобактерий в кишечнике у крыс, получавших дефицитные по содержанию витаминов корма с различным составом жирового компонента в течение 4 нед, представлены в табл. 1, из которой видно, что дефицит витаминов не отразился на количестве лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс. К концу 4 недели у животных 2-й опытной группы, потреблявших корм с льняным маслом в качестве основного источника полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) на фоне дефицита в рационе всех витаминов, обнаружено статистически достоверное превышение количества лактобактерий в кишечнике по сравнению с показателем у крыс контрольной группы, потреблявших полноценный базовый рацион, и у крыс 1-й опытной группы, получавших стандартный жировой компонент на основе подсолнечного масла. Их количество возросло до оптимальных значений физиологической нормы [6].

Таким образом, использование льняного масла оказало положительное влияние на состояние одной из ведущих резидентных популяций микробиоты кишечника у экспериментальных животных. Важно отметить, что у контрольных крыс, получавших в качестве базового жирового компонента диеты подсолнечное масло, количество лактобактерий приближалось к такой величине только к концу эксперимента на 42-й день наблюдения (табл. 2). Данные табл. 2 характеризуют численность лактофлоры у крыс, получавших в течение 28 дней рацион с глубоким дефицитом всех витаминов, а затем находящихся в течение 2 нед на рационах с восполнением витаминов до уровней 70 и 200% от содержания в стандартном рационе для крыс. Как видно из данных табл. 2, статистически достоверных различий изучаемых показателей между крысами контрольной и 3-6-й опытными группами не выявлено, несмотря на то что жировой компонент рациона у одних подопытных животных был обычным, у других - модифицированным.

Таблица 1. Количество лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс, получавших в течение 28 сут дефицитные по витаминам корма с различным составом жирового компонента

Таблица 2. Количество лактобактерий в содержимом слепой кишки крыс, получавших в течение 14 дней рационы с восполненными уровнями витаминов на фоне различных по составу жировых компонентов корма

Оценивая влияние рационов с различной степенью обеспеченности витаминами на состояние лактофлоры, следует отметить, что, несмотря на небольшое количество животных в опытных группах, у крыс, получавших рацион с льняным маслом, содержание указанных микробов было близко к оптимальному при обеих дозах восполнения (на 70% и 200%) количества витаминов в рационе (после искусственно создаваемого их дефицита). При содержании крыс 5-й и 6-й опытных групп на рационе с льняным маслом (см. табл. 2) количество лактобактерий в кишечном содержимом сохранялось практически на таком же высоком уровне, который был зафиксирован перед началом восполнения витаминов в рационе (медиана 9,4-9,3 lg KOE/г).

Как известно, жиры не принадлежат к эссенциально необходимым для роста микробов субстанциям, высшие жирные кислоты также не атакуются микроорганизмами [7, 11]. В то же время льняное масло относится к пищевым продуктам, обладающим выраженным желчегонным эффектом. В этом масле содержится в 1,5 раза больше стеринов, чем в подсолнечном. Для их всасывания организму требуется больше желчных кислот. Усиление их выработки и, соответственно, обратного всасывания способствует росту процессов энтерогепатической циркуляции, в которых активное участие принимает кишечная микрофлора. Доказано, что состав и профиль биотрансформации желчных кислот в кишечнике определяются ферментативными воздействиями обитающих там лактобактерий [5]. Поэтому повышение численности лактобактерий в содержимом кишечника, в частности в толстой кишке, крыс, находящихся на рационе с льняным маслом, логично объяснить тем, что при этом рационе наблюдается больший, чем на рационе с обычным жировым составом, выброс желчи, а следовательно, и повышение концентрации желчных кислот в химусе. Все это влечет активизацию в кишечнике микрофлоры, участвующей в энтерогепатической циркуляции.

К этому следует добавить, что эффект воздействия на кишечную микрофлору ω-3 ПНЖК, наличие которых отличает льняное масло от подсолнечного, малоизучен. Предполагается, что жирные кислоты этого семейства могут обусловливать позитивные сдвиги в анаэробной микрофлоре за счет способности влиять на липидный обмен в качестве регулятора окислительно-восстановительного потенциала в просвете кишечника [9]. Имеются данные о влиянии в опытах in vitro эйкозапентаеновой кислоты в микрограммовых количествах в среде на скорость роста и накопление количества бифидобактерий. Через 24 ч количество бифидобактерий возрастало на порядок по сравнению с контролем. Однако конкретных данных о влиянии ПНЖК на рост лактобактерий в литературе не найдено. Все это требует проведения целенаправленных исследований, подтверждающих такой же механизм действия.

Литература

1. Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 3. - С. 51-60.

2. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 2. - С. 51-56.

3. Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Коденцова В.М. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 6. - С. 41-46.

4. Коденцова В.М., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А. // Вопр. питания. - 2012. - Т. 81, № 4. - С. 72-77.

5. Луценко Л.П. Гепатоэнтеральная рециркуляция холестерина // Бюл. СО РАМН. - 2006. - Т. 32. - С. 12-18.

6. Mаннапова Р.Т., Файзулиннин И.М. Влияние прополиса в составе культур бифидобактерий и лактобацил на организм лабораторных животных // http://www.vetportal. ru/post180. html.

7. Рапопорт С.М. Медицинская биохимия. - М.: Медицина, 1966. - 892 с.

8. Шевелева С.А., Батищева С.Ю., Кузнецова Г.Г. и др. // Вопр. питания. - 2911. - № 2. - С. 51-56.

9. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. - М.: Грант, 2001. - 288 с.

10. Leber S., Vanderleyden J., De Keersmaecker S. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2008. - Vol. 72, N. 4. - P. 728-764.

11. Starka J. Die Ernahrung der Mikrojuganismen - Ref. Verlag . in confer. "Physiologie und Biochemie der Mikroorganismen". - Stuttgart, 1968. - S. 291-322.