Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе

РезюмеПредставлены результаты исследований гематологических показателей крыс-самцов Вистар в возрасте 1, 2, 3, 4 и 6 мес, находившихся на полноценном сбалансированном полусинтетическом рационе. Исследования проведены на гематологическом анализаторе Coulter AC TTM 5 diff OV (Beckman Coulter, США) по программе, разработанной для исследования крови крыс. В соответствии с результатами исследований установлено, что у животных 2-6 мес статистически достоверно повышены содержание эритроцитов, концентрация гемоглобина (Hb) и гематокрит по сравнению с крысами в возрасте 1 мес. При этом отмечено снижение среднего объема эритроцита и среднего содержания Hb в эритроците. Общее содержание лейкоцитов у крыс 2-4 мес достоверно выше, чем у крыс в возрасте 1 и 6 мес. Количество нейтрофилов и эозинофилов ко 2-му месяцу жизни понижается, а далее отмечен рост этих показателей с максимальными значениями у 6-месячных животных. Количество лимфоцитов наиболее высокое у крыс 2-3-месячного возраста, минимальное - у животных 6 мес. С увеличением возраста животных уменьшается содержание моноцитов. Содержание тромбоцитов и относительный объем тромбоцитов в крови крыс в возрасте 6 мес статистически достоверно превышают таковые у 1-месячных животных. Средний объем тромбоцита - стабильный показатель; с возрастом не изменяется.

Ключевые слова:гематологические показатели, физиологические нормы, полусинтетический полноценный рацион, гематологический анализатор

Вопр. питания. - 2013. - № 2. - С. 10-16.

Отправной точкой любых экспериментальных исследований по изучению воздействия на организм различных внешних и внутренних факторов (начиная от стресса, влияния химических веществ и кончая наличием в рационе дефицита или избытка макро- и микронутриентов) [5-7, 12] является правильный подбор соответствующих контрольных и опытных животных (чаще всего крыс), идентичных по возрасту и линии происхождения. При этом в большинстве исследований контрольных животных обследуют с помощью различных методов - физиологических, биохимических, цитологических, гематологических и др., однако часто даже не указывается рацион, на котором они содержатся, и далеко в не полном объеме приводятся методы исследования. Особенно это относится к гематологическим методам, которые, будучи важными для диагностики, в известной мере отражают физиологическое состояние организма. Следует добавить, что во многих работах не указывается возраст контрольных и подопытных животных (чаще приводятся только сроки исследования), вследствие чего отсутствует информация по возрастной ранжированности гематологических и других изучаемых показателей [2, 4, 15, 21], а это может сказаться на интерпретации полученных результатов. Поэтому при проведении экспериментов in vivo необходимо сравнивать не только показатели обследования контрольных и подопытных животных, но и знать, не выходят ли эти показатели, особенно гематологического плана, за рамки возрастных норм для животных, взятых в опыт [12, 17].

Нормальные величины отдельных гематологических показателей (клинический анализ крови), характерные для лабораторных животных, в том числе для белых крыс, приводятся в работах многих отечественных и зарубежных исследователей [3, 11, 13, 17, 18, 20, 22-24] (табл. 1). Однако данные о нормах по всему спектру гематологических показателей для крыс Вистар, которые наиболее широко используются в экспериментальных работах, практически отсутствуют. Нет в литературе и данных о величине гематологических показателей с учетом возраста крыс указанной линии. Вместе с тем при постановке экспериментов по выявлению влияния на организм различных факторов необходимо учитывать возраст животного (возрастную эволюцию), качественное своеобразие каждой стадии онтогенеза, а также сезонную изменчивость состава крови [8, 11].

Обычно у крыс выделяют 2 критических возрастных периода - период новорожденности и период между 9-17-и сутками, когда происходит переход красного костного мозга на новый уровень функционирования с падением количества ретикулоцитов и увеличением числа эритроцитов. К 4-й неделе жизни, когда крысы переходят на самостоятельное питание, они полностью готовы к полноценному иммунному ответу [12]. Согласно опубликованным данным [3, 12], у новорожденных крысят содержание эритроцитов (в 1 мл крови) в среднем составляет 2,5-2,5 млн, лейкоцитов - 3200 в 1 мл крови; с возрастом эти показатели увеличиваются. Лейкоцитарная формула у новорожденных крысят представлена преимущественно миелоцитами, метамиелоцитами, гранулоцитами (нейтрофилами, базофилами, эозинофилами), а также лимфоцитами (в среднем 25%). Некоторые авторы [1, 10-12] отмечают, что белая кровь у лабораторных животных, в том числе у белых крыс, очень лабильна. Причем у 2 здоровых крыс одного и того же возраста и даже у одного и того же животного количество отдельных видов лейкоцитов может значительно колебаться.

Как известно, полноценная работа системы кровообращения во многом зависит от функционального состояния и общего содержания в крови лейкоцитов [1, 10-12]. В раннем онтогенезе и до наступления половой зрелости животных количество лейкоцитов неуклонно растет, а затем изменяется мало [12]. У молодых крыс лабильность лейкоцитарной формулы сопровождается выраженным лимфоцитарным профилем [11, 12]. С возрастом количество лимфоцитов понижается [11, 19], а нейтрофилов возрастает. У старых животных (по-видимому, в связи с ослаблением функциональной активности тимуса) происходят изменения клеточного состава крови с уменьшением до минимума содержания лимфоцитов и, наоборот, увеличением до максимальных значений количества нейтрофилов [11, 19]. Развитие у старых животных эозинофилии, очевидно, связано с возрастным нарушением гормонального статуса [1, 10, 14, 15].

Увеличение возраста животных не влияет на уровень гемоглобина (Hb) в плазме крови. Однако средняя концентрация Hb по сравнению с таковой у молодых животных уменьшается [14, 15], а количество эритроцитов, напротив, возрастает, что в позднем онтогенезе является следствием компенсаторного усиления эритропоэза (объем эритроцитов уменьшается, а их количество увеличивается). При этом у старых животных повышается степень гемолиза эритроцитов, что, вероятно, связано с усилением влияния механизмов свободнорадикального окисления [14]. К сказанному следует добавить, что в последнее время совершенствуются технологии лабораторного анализа, в том числе с использованием автоматического анализатора крови, что позволяет не только расширить круг изучаемых количественных гематологических показателей, но и избежать индивидуальной интерпретации полученных данных.

Исходя из вышесказанного целями нашего исследования были изучение с помощью автоматического анализа гематологического профиля крыс Вистар различного возраста (1, 3, 4, 6, 7 мес), находящихся на сбалансированном полусинтетическом рационе, и определение границ физиологической нормы показателей этого профиля с учетом возраста животных. Отметим, что в соответствии с цитируемой литературой, аналогичные исследования ранее не осуществлялись.

Таблица 1. Гематологические показатели у экспериментальных животных (крыс) по данным литературы

Материал и методы

Эксперименты проводили в несколько этапов на крысах-самцах Вистар (по 3-7 животных в клетке, в зависимости от возраста). Возраст животных на момент окончания эксперимента составлял 1 мес (40 крыс), 2 мес (63 крысы), 3 мес (41 крыса), 4 мес (34 крысы) и 6-7 мес (62 крысы). Животные в течение всего эксперимента получали сбалансированный полусинтетический рацион, содержащий (в физиологических нормах для крыс) казеин, кукурузный крахмал, а также растительное масло и лярд в соотношении 1:1, витаминную, солевую смеси, пищевые волокна [9, 16, 18]. Применяли принцип кормления животных вволю при свободном доступе к воде. Ежедневно контролировали состояние животных, поедаемость корма, прирост массы тела. После завершения экспериментов животных в указанные выше сроки умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом, отбирали для исследования кровь в пробирки с ЭДТА-КЗ, проводили патологоанатомическое вскрытие.

Гематологические показатели крови определяли на гематологическом автоматическом анализаторе Coulter АC TTM 5 diff OV с использованием реактивов производства Beckman Coulter (США). Определяли общее количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание Hb, гематокрит, среднее содержание в эритроците Hb, подсчитывали лейкоцитарную формулу, средний объем эритроцита, тромбоцита, тромбокрита.

Результаты исследований представлены в виде средних величин и стандартной ошибки (М±m), а также минимальных и максимальных значений (табл. 2). Статистическая обработка выполнена с использованием программ IBM SPSS Statistics Version 20, критериев Стьюдента и Манна-Уитни. Уровень значимости считали достоверным при p≤0,05.

Таблица 2. Гематологические показатели у крыс в возрастных категориях 1-6 мес

Результаты и обсуждение

Результаты гематологических исследований, проведенных у крыс Вистар разного возраста, представлены в табл. 2, из которой видно, что с увеличением возраста животных изменяется большинство гематологических показателей. Так, в процессе онтогенеза выявлено статистически значимое повышение в крови содержания эритроцитов, концентрации Hb и гематокрита: у 2-, 3-, 4- и 6-месячных крыс эти показатели выше, чем у животных в возрасте 1 мес. При этом отмечено статистически достоверное снижение среднего объема эритроцита и среднего содержания Hb в эритроците. Наиболее высокое число эритроцитов при уменьшении их объема отмечено у 6-месячных животных, что, возможно, связано с активизацией компенсаторных механизмов эритропоэза в ответ на усиление процессов свободнорадикального окисления [14]. Средняя концентрация Hb возрастает ко 2-му месяцу жизни животных и в дальнейшем практически не меняется. Необходимо отметить, что разброс по перечисленным показателям был незначительным (рис. 1).

Общее содержание лейкоцитов в крови 2- и 3-месячных крыс достоверно выше, чем у 1-месячных животных. У 6-месячных крыс коли-чество лейкоцитов хотя и меньше, чем у крыс 2, 3 и 4 мес жизни, но статистически достоверно выше, чем у 1-месячных.

У крыс Вистар разного возраста, находящихся на полноценном сбалансированном полусинтетическом рационе, выявлены следующие изменения лейкоцитарной формулы: общее количество нейтрофилов и эозинофилов ко 2-му месяцу жизни животных снижается, а в дальнейшем увеличивается, достигая максимальных значений к 6-месячному возрасту. С возрастом количество лимфоцитов у животных вначале увеличивается, достигая максимального значения к 2-3 мес жизни, а затем (к 6-месячному возрасту) снижается, оставаясь все же больше, чем у крыс 1-месячного возраста. Количество моноцитов с увеличением возраста животных значимо уменьшается (см. табл. 2). Количество базофильных лейкоцитов с возрастом животных также снижается: у 1-месячных крыс оно значительно выше, чем в остальных возрастных группах. С возрастом у животных обнаружена тенденция к увеличению тромбоцитарных показателей: у 6-месячных крыс содержание в крови тромбоцитов и их относительный объем достоверно выше, чем в возрасте 1 мес (см. табл. 2). Однако средний объем тромбоцитов с возрастом животных не изменяется, оставаясь стабильным во все сроки исследования.

Таким образом, на основании проведенных исследований нами создана база данных и определены границы физиологической нормы большинства показателей гематологического профиля у наиболее часто используемых в экспериментах крыс-самцов Вистар разного возраста (1-6 мес), получавших полноценный сбалансированный полусинтетический рацион.

Рис. 1. Динамика возрастных изменений показателей, характеризующих состояние эритроцитов крыс: а - содержание эритроцитов; б - средний объем эритроцитов; в - концентрация Hb в крови; г - среднее содержание Hb в эритроците

Рис. 2. Динамика лейкоцитарной формулы крыс по возрастным категориям

Литература

1. Агаджанян Н.А., Федорова М.Л. // Экология человека. - 2001. - № 4. - С. 66-68.

2. Ариджанова И .Э. // Вестн. ОГУ. - 2009. - № 1. - С. 73-76.

3. Гамбарян П.П., Дукельская Н.М. Крыса. - М.: Советская наука, 1955. - 256 с.

4. Егорова М.О., Цветаева Н.В., Сухачева Е.А. Практические рекомендации по лабораторной диагностике наиболее распространенных форм анемий. Метод. пособие. - М.: Ариен, 2012. - 48 с.

5. Клиническая интерпретация лабораторных исследований (ред. А.Б. Белевитина, С.Г. Щербак). - СПб.: ЭЛБИ, 2006. - 398 с.

6. Козинец Г .И. Анализы крови и мочи. Клиническое значение. - М.: Практическая медицина, 2011. - 160 с.

7. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник (ред. В.В. Меньшикова). - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

8. Любин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологии. - Ульяновск: ГСХА, 2005. - 52 с.

9. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения. Методические указания - 2.3.2.306-07. - М.: Роспотребнадзор, 2008. - 30 с.

10. Моисеенко Н.А., Репина Е.Н., Кетова М.С. Количество, спектр и адгезия лейкоцитов крови крыс при иммобилизационном стрессе на фоне действия экдистероидсодержащей субстанции Серпистен URL.//http. Rusnauka. Cоm./13 NPT 2008/ Biologia/3 1972. doc.htm.

11. Никитин В.Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. - М.: Гос. издательство Сельскохозяйственной литературы, 1949. - 50 с.

12. Новожилов А.В. Динамика реологических и гематологических показателей крови у незрело- и зрелорождающихся животных в постнатальном патогенезе: Автореф. дис. - канд. мед. наук. - СПб., 2009. - 18 с.

13. Сидорчук А.А., Глушков А.А. Инфекционные болезни лабораторных животных. - М.: Лань, 2009. - 128 с.

14. Теплый Д.Д. Особенности морфофизиологических показателей эритроцитов белых крыс на этапах онтогенеза в норме и при оксидативнос стрессе: Автореф. дис. - канд. биол. наук. - Астрахань, 2011. - 21 с.

15. Теплый Д.Д., Нестеров Ю.В. // Естественные науки. - 2011. - Т. 34, № 14. - С. 138-143.

16. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания. - 1.2.2520. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 35 с.

17. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О. и др. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (Современные представления и методические подходы, основные параметры и константы). - М.: Медицина, 1978. - 176 с.

18. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. - С. 30-38.

19. Узенбаева Л.Б.. Виноградова И.А., Голубева А.Г. и др. // Успехи геронтол. - 2006. - Вып. 19. - С. 79-84.

20. Шатурина Л.П., Еремина И.Ю., Злотникова О.В. Естественная резистентность. Лабораторный практикум. - Красноярск, 2006. http//www.kgau.ru/distance/resources/saturina/

21. Шмидт Ю.Д. Влияние антистрессового препарата "Аминовит" на морфологию надпочечных желез и морфоцитологические показатели крови телят при транспортном стрессе: Автореф. дис. - канд. биол. наук. - Новосибирск, 2003. - 13 с.

22. Krinke G.J., Bullock G.R., Bunton T. The Laboratory Rat (Handbook of Experimental Animals). - San-Diego: Academic Press, 2000. - 756 p.

23. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data. - Wistar rat. - Amsterdam: Holland: Elsevier/North-Holland Biochemical Press, 1981. - P. 358.

24. Suckow M.A., Weibroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington: Elsevier; Academic Press, 2006. - 912 p.