Изучение воздействия наночастиц оксида алюминия, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс

РезюмеВодные дисперсии наночастиц (НЧ) оксида алюминия вводили внутрижелудочно через зонд растущим крысам-самцам Вистар ежедневно на протяжении 28 дней в дозе 1 или 100 мг/кг. Изучали массу тела животных, относительную массу их внутренних органов, степень всасывания макромолекул белка в желудочно-кишечном тракте, показатель окислительного повреждения ДНК, уровень небелковых тиолов, состояние системы I и II фазы детоксикации ксенобиотиков, стабильность лизосомальных мембран печени, биохимические и гематологические показатели крови, состояние системы антиоксидантной защиты, апоптоз гепатоцитов печени. Проведенные эксперименты не выявили значительного токсического действия НЧ оксида алюминия на крыс при 28-дневном внутрижелудочном их введении как в низкой, так и в высокой дозе. В числе эффектов, возможно, связанных с воздействием НЧ на животных, было снижение относительной массы печени и легких, уровня небелковых тиолов печени, изменение активности изоформы CYP1A1 цитохрома Р450 печени и глутатионредуктазы эритроцитов, повышение уровня диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот в плазме крови. Указанные сдвиги биохимических показателей были небольшими по абсолютной величине, укладывались в естественные вариации биологической нормы или не демонстрировали определенной зависимости от дозы вводимых НЧ. Вместе с тем с учетом большой значимости данного наноматериала как потенциального загрязнителя окружающей среды и пищевых продуктов, исследования его возможной токсичности должны быть продолжены в условиях введения низких доз (1 мг/кг и менее) на протяжении длительного времени.

Ключевые слова:оксид алюминия, наночастицы, крысы, токсичность

Вопр. питания. - 2012. - № 6. - С. 54-60.

Наночастицы (НЧ) оксида алюминия (Al2O3: корунт, бемит) широко используются в современной ременной обрабатывающей промышленности в качестве абразивной добавки, а также выступают в роли катализатора в ряде процессов органического синтеза в чистом виде и в форме, модифицированной ионами переходных металлов (Pt, Pd и др.). Как признается Организацией экономического сотрудничества и развития (OECD), вследствие больших объемов производства данного наноматериала и незамкнутого характера многих технологических циклов, в котором он используется, наноструктурированный Al2O3 может быть значимым загрязнителем окружающей среды [11]. Поскольку эти НЧ нерастворимы в воде и практически не способны к биологической деградации, они могут накапливаться в составе компонентов природных экосистем [18], в сельскохозяйственной продукции, в том числе в пищевых продуктах.

НЧ Al2O3 легко поглощаются различными клеточными культурами [7, 16], оказывая при этом цитотоксическое действие [7, 9, 16] и обладая способностью к каталитической генерации свободных радикалов [8, 20]. Кроме того, установлено вредное действие водных дисперсий НЧ Al2O3 на дафний [12], пресноводных улиток [14], почвенных нематод [6], насекомых [17] и рыб [13]. В то же время имеющиеся данные о возможном токсическом действии НЧ Al2O3 на организм теплокровных животных [10, 15] распространяются только на ингаляционный путь их поступления, что не позволяет комплексно оценить риск воздействия этих наноматериалов на здоровье человека. Целью настоящей работы явилась оценка воздействия НЧ Al2O3 на организм крыс в условиях многократного введения в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), что является моделью поступления данного наноматериала с пищевыми продуктами.

Материал и методы

В работе был использован стандартизованный препарат НЧ оксида алюминия производства фирмы Sigma-Aldrich (Германия). Средний размер частиц, имеющих форму эллипсоидов, согласно исследованиям, проведенным с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), составлял 6,3±3,3 (M±sd) и 5,0±2,6 нм (соответственно большая и малая оси), а по данным атомносиловой микроскопии диаметр частиц равнялся 16,4±10,0 нм, причем при исследовании методом ТЭМ НЧ были частично агрегированы в рыхлые кластеры. В качестве макродисперсного аналога наноматериала использовали окись алюминия "Нейтральную для хроматографии", производства фирмы Lachema о.р. Вrno (Чехия).

Эксперимент был проведен на 75 крысах - самцах линии Вистар с исходной массой 125±5 г, полученных из питомника филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Пущино, Московской области). Животные были разделены на 5 групп: контрольную (1-я группа) и 4 опытные (2-5-я группы) по 15 крыс в каждой. Животных содержали по 3-4 особи в пластмассовых клетках и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом согласно МУ 1.2.2520-09 [4]. Доступ к корму и питьевой воде для животных не ограничивали. Крысам ежедневно на протяжении 28 дней внутрижелудочно (через зонд) вводили НЧ Al2O3 в дозе 1 мг/кг массы тела (2-я опытная группа) или 100 мг/кг (3-я опытная группа) или окись алюминия "Нейтральную для хроматографии" в тех же дозах - 1 и 100 мг/кг (соответственно 4-я и 5-я группы) (табл. 1). Непосредственно перед введением водные суспензии используемых препаратов оксида алюминия для устранения агрегации обрабатывали ультразвуком (в течение 5 мин при 44 кГц и 40 Вт). Контрольные животные получали ежедневно внутрижелудочно деионизованную воду в количестве 10 мл на 1 кг массы тела.

Таблица 1. Тестируемые материалы и дозы

На протяжении всего эксперимента у животных всех групп изучали интегральные показатели (внешний вид, поведение, двигательную активность, состояние шерстяного покрова, поедаемость корма, еженедельную прибавку массы тела); абсолютный и относительный прирост массы тела определяли, взвешивая крыс на электронных весах с точностью ±0,5 г. На 24-й день по 5 животных из каждой группы помещали в обменные клетки, где в течение суток собирали мочу; при этом животные не получали рацион, но имели неограниченный доступ к воде. В отобранной моче определяли содержание продукта окислительной деструкции ДНК: 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (8-oxo-dG) [3].

В конце эксперимента, на 29-е сутки опыта, животные всех групп были разделены на 2 подгруппы. В 1-ю подгруппу входили 45 крыс (по 9 животных из каждой группы), во 2-ю подгруппу - 30 крыс (по 6 животных из каждой группы). У животных 1-й подгруппы изучали величину всасывания антигенного белка овальбумина (ОВА) в ЖКТ. Для этого на 29-й день эксперимента (за 3 ч до умерщвления животных путем обескровливания из нижней полой вены под эфирным наркозом) крысам 1-й подгруппы вводили внутрижелудочно через зонд лиофилизованный белок куриного яйца в дозе 2 г/кг в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. На секции отбирали кровь, а также брали внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие, селезенку, слепую кишку, надпочечники, семенники, тимус, головной мозг) в последовательности, указанной в МУ 1.2.2745-10 [5]. Затем на электронных весах с точностью ±0,01 г определяли абсолютную массу внутренних органов и рассчитывали их относительную массу (ОМ), в % от массы тела. В сыворотке собранной крови с помощью методов, используемых в работах [1-3], изучали гематологические показатели (концентрацию в крови гемоглобина, общее количество эритроцитов, объем эритроцита, гематокрит, среднюю концентрацию гемоглобина в одном эритроците, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах; число лейкоцитов, относительное содержание лимфоцитов, моноцитов, базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, тромбокрит), содержание цитокинов - интерлейкинов (ИЛ-10 и ИЛ-6), а также фактора некроза опухоли α (ФНО-α) в сыворотке крови; интенсивность процесса апоптоза гепатоцитов оценивали методом проточной цитофлюориметрии с красителями аннексин-5-FITC и 7-аминоактиномицин D. Концентрацию антигенного ОВА в сыворотке крови крыс определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного метода [19].

Животных 2-й подгруппы также умерщвляли на 29-й день эксперимента тем же способом, что и животных 1-й подгруппы. Отбирали кровь и на вскрытии - печень. На электронных весах определяли ее массу (с точностью ±0,1 г), а затем с помощью методов, указанных в работах [1-3], изучали биохимические показатели. В печени определяли содержание микросомальных цитохрома Р450, цитохрома b5, активность монооксигеназ, включая этоксирезоруфиндеалкилазу (CYP1A1), метоксирезоруфин-О-деметилазу (CYP1A2) и пентоксирезоруфин-О-деалкилазу (CYP1В2), глутатион-S-трансферазы, UDP-глюкуронозилтрансферазы, общих и неседиментируемых лизосомальных гидролаз (арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы), концентрацию небелковых тиолов, представленных в основном восстановленным глутатионом. В плазме крови изучали содержание общего белка, альбумина, глюкозы, креатинина, мочевой кислоты, мочевины, активность аланин- (АЛТ) и аспарагинаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы; показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) - содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), малонового диальдегида (МДА). В эритроцитах определяли активностьглютатионредуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы.

Статистическую обработку результатов проводили согласно критерию ANOVA и непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни. Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Таблица 2. Относительная масса внутренних органов у животных контрольной и опытных групп (М±m, %)

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента все животные контрольной и опытных групп росли равномерно, сохраняли нормальный внешний вид; случаев заболевания и летальных исходов не было. При этом у крыс опытных групп, получавших НЧ и их макродисперсный аналог в низкой дозе, относительная прибавка массы тела за 28 дней опыта была даже несколько больше (примерно на 15%, р<0,05), чем у крыс контрольной группы. На 29-й день эксперимента у животных всех опытных групп ОМ почек, селезенки, сердца, семенников тимуса была такой же, как в контрольной группе. Однако, как следует из данных табл. 2, ОМ печени и легких крыс, получавших низкую дозу НЧ (2-я опытная группа), была незначительно по абсолютной величине, но статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе. Для высокой дозы НЧ и их макродисперсного аналога (3-я и 5-я группы) подобные эффекты не отмечены.

Всасывание в кровь макромолекул ОВА через 3 ч после его внутрижелудочного введения у крыс всех опытных групп было несколько ниже, чем в контроле, однако различия оказались статистически недостоверными. Степень окислительного повреждения ДНК, оцениваемого по экскреции 8-oxo-dG, была несколько повышена у крыс, получавших низкую дозу НЧ Al2O3 (2-я группа), но различия оказались также статистически недостоверными. У животных, получавших низкую дозу НЧ, содержание небелковых тиолов в печени было достоверно понижено по сравнению с таковым в контрольной группе. У крыс остальных опытных групп данный показатель хотя и несколько отличался от уровня в контроле, но отличие было явно недостоверным (рис. 1).

В табл. 3 приведены результаты определения у крыс стандартных биохимических показателей сыворотки крови, которые оставались в пределах физиологической нормы. Уровень глюкозы незначительно по абсолютной величине и статистически недостоверно (р=0,065) снижался только в группе животных, получавших НЧ Al2O3 в низкой дозе (по сравнению с контрольной группой). Введение указанных выше НЧ в большей дозе (3-я группа) не привело к росту активности АЛТ и АСТ. Более того, у животных этой опытной группы отмечено достоверное снижение активности АСТ по сравнению с показателем в контроле. Показатели азотистого обмена (общий белок, альбумин, креатинин, мочевая кислота) в группах крыс, получавших НЧ Al2O3, достоверно не отличались от значений в контроле. При этом уровень мочевой кислоты у животных, получавших НЧ Al2O3 в высокой дозе, был достоверно ниже, чем у получавших макродисперсный аналог. Некоторое общее снижение активности щелочной фосфатазы у крыс всех опытных групп по сравнению с контролем связано, по-видимому, с воздействием Al2O3 независимо от степени его дисперсности (р<0,05, ANOVA). Таким образом, биохимические показатели крови не выявили токсического действия НЧ Al2O3 на организм животных в диапазоне изучаемых доз.

Введение крысам 2-й и 3-й групп НЧ Al2O3 не изменяло у них общее содержание цитохромов P-450 и b-5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков в микросомах печени по сравнению с показателями в контрольной группе (табл. 4). При сравнении данных, полученных у животных 2-й группы, с данными, выявленными у крыс 4-й группы, отмечено, что активность изоформ CYP1A1 и CYP2B1 у животных, получавших НЧ в низкой дозе, оказывается достоверно выше, чем у получавших макродисперсный аналог. В целом введение НЧ является фактором, значимо влияющим на активность CYP1A1 (р<0,05, ANOVA), однако наблюдаемые изменения не выходят за пределы физиологической нормы. Таким образом, введение НЧ Al2O3 не вызывает каких-либо существенных нарушений в функционировании микросомальной системы детоксикации ксенобиотиков в печени.

Анализ неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз в печени животных позволил установить, что данный показатель не изменяется под воздействием НЧ у крыс 2-й и 3-й групп по сравнению с контролем. При этом отмечена меньшая неседиментируемая активность j3-глюкуронидазы в 3-й группе, чем в 5-й (соответственно 6,41±0,31 и 7,70±0,28%; р<0,05). Таким образом, внутрижелудочное введение НЧ Al2O3 не приводит к снижению стабильности мембран лизосом печени.

Показатели, характеризующие состояние ПОЛ и системы антиоксидантной защиты, у животных опытных групп изменяются неоднозначно (табл. 5). Так, уровень диеновых конъюгатов достоверно повышен у крыс, получающих НЧ Al2O3, по сравнению с животными остальных групп (р<0,05, ANOVA). С другой стороны, содержание МДА несколько понижено у крыс 3-й группы по сравнению с 5-й (крысы, получавшие макродисперсный аналог наноматериала). Из ферментов антиоксидантной защиты следует выделить глутатионредуктазу, активность которой понижена у животных 3-й группы, получавших НЧ Al2O3 в высокой дозе.

Уровень цитокина ИЛ-10 в сыворотке крови животных 2-й и 3-й групп (соответственно 38,4±10,6 и 56,4±12,7 пг/мл) достоверно не отличался от уровня в контрольной группе (50,5±17,4 пг/мл) и в 4-й и 5-й группах (крысы, получавшие макроскопический аналог наноматериала в тех же дозах). Цитокин ИЛ-6 в пределах чувствительности метода выявлен у 1 из 10 животных 2-й группы, у 1 из 9 3-й группы, у 3 из 9 4-й группы, у 4 из 10 5-й группы и ни разу в контрольной группе. Все различия между группами по критерию Манна-Уитни оказались недостоверными. ФНО-a не был выявлен ни разу, что указывает на отсутствие у всех животных выраженных воспалительных процессов. Таким образом, какого-либо влияния НЧ Al2O3 на синтез изученных цитокинов не обнаружено.

Рис. 1. Содержание небелковых тиолов в печени крыс

В пересчете на восстановленный глутатион, мкмоль/печень (M±m). Численность групп - по 6 животных.

* - р<0,05, по сравнению с 1-й группой.

Таблица 3. Биохимические показатели сыворотки крови у животных контрольной и опытных групп (M±m)

Концентрация гемоглобина, общее количество эритроцитов и величина гематокрита у животных всех опытных групп не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе (табл. 6). В то же время средний объем эритроцитов и содержание гемоглобина в эритроците были достоверно ниже у животных 2-й группы, чем 4-й, причем различия с животными контрольной группы были недостоверными. Средняя концентрация гемоглобина в эритроците у животных всех опытных групп была ниже, чем в контрольной. Факторный анализ указывал на то, что Al2O3 независимо от степени его дисперсности оказывает влияние на этот показатель. Таким образом, выраженных нарушений в состоянии эритроцитов у крыс, получавших НЧ Al2O3, не обнаружено; отклонения отдельных показателей были невелики по абсолютной величине и не зависели от дозы вводимого наноматериала.

Изучение лейкоцитарной формулы крови (общее содержание лейкоцитов, лимфоциты, моноциты, базофилы, эозинофилы, нейтрофилы, незрелые гранулоциты) не выявило каких-либо влияний на эти показатели со стороны НЧ Al2O3. Количество тромбоцитов в крови животных всех опытных групп соответствовало показателю в контроле, хотя и отмечалось достоверное снижение количества тромбоцитов у животных 3-й и 5-й групп (соответственно 619±23 и 622±21 млрд/л) по сравнению с контролем (718±31млрд/л). Рассматриваемый эффект, таким образом, не может быть отнесен к действию НЧ, а, по-видимому, обусловлен введением оксида алюминия независимо от степени его дисперсности.

Таблица 4. Содержание цитохромов Р450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков (M±m) у животных контрольной и опытных групп

Таблица 5. Состояние ПОЛ и системы антиоксидантной защиты у животных контрольной и опытной групп (М±m)

Исследование показателей апоптоза гепатоцитов (доля живых клеток; доля клеток, находящихся встадиях раннего и позднего апоптоза; сумма клеток в апоптозе; число мертвых клеток) не выявило различий между животными опытных и контрольной групп.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что использованные нами дозы НЧ оксида алюминия (1 и 100 мкг на 1 кг массы тела животных) при ежедневном внутрижелудочном их введении в течение 28 дней лабораторным крысам не вызывают у них существенных изменений изученных дозозависимых показателей.

Характеристика наночастиц оксида алюминия методом электронной микроскопии проведена на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (заместитель заведующего кафедрой доктор физико-математических наук, профессор К.В. Шайтан), в рамках выполнения работ по государственному контракту № 01.648.12.3022 от 11.11.2008 Министерства образования и науки РФ

Таблица 6. Показатели, характеризующие состояние эритроцитов, у животных контрольной и опытных групп (М±m)

Литература

1. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

2. Распопов Р.В., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 36-41.

3. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

4. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 35 с.

5. МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных". - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 41 с..

6. Coleman J.G., Johnson D.R., Stanley J.K. et al. // Environ. Toxicol. Chem. - 2010. - Vol. 29, N 7. - P. 1575-1580.

7. Di Virgilio A.L., Reigosa M., de Mele M.F. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2010. - Vol. 92, N 1. - P. 80-86.

8. Dong E., Wang Y., Yang S.T., Yuan Y. et al. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2011. - Vol. 11, N 9. - P. 7848-7856.

9. Kim I.S., Baek M., Choi S.J. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 5. - P. 3453-3458.

10. Li M., Czymmek K.J., Huang C.P. // J. Hazard. Mater. - 2011. - Vol. 187, N 1-3. - P. 502-508.

11. List of manufactured nanomaterials and list of endpoints for phase one of the OECD testing programme // Series on the safety of manufactured nanomaterials, N 6, OECD, 2008. - 13 p.

12. Lu S., Duffin R., Poland C. et al. // Environ. Health Perspect. - 2009. - Vol. 117, N 2. - P. 241-247.

13. McLeish J.A., Chico T.J., Taylor H.B. et al. // Thromb. Haemost. - 2010. - Vol. 103, N 4. - P. 797-807.

14. Musee N., Oberholster P.J., Sikhwivhilu L. et al. // Chemosphere. - 2010. - Vol. 81, N 10. - P. 1196-1203.

15. Pauluhn J. // Toxicol. Sci. - 2009. - Vol. 109, N 1. - P. 15 2 -16 7.

16. Radziun E., Dudkiewicz-Wilczynska J., Ksiaek I. et al. // Toxicol. In Vitro. - 2011. - Vol. 25, N 8. - P. 1694-1700.

17. Stadler T., Buteler M., Weaver D.K. // Pest. Manag. Sci. - 2010. - Vol. 66, N 6. - P. 577-579.

18. Stanley J.K., Coleman J.G., Weiss C.A.Jr. et al. // Environ. Toxicol. Chem. - 2010. - Vol. 29, N 2. - P. 422-429.

19. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

20. Zhang Q.L., Li M.Q., Ji J.W. et al. // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. - 2011. - Vol. 24, suppl. 1. - P. 23S-29S.