Влияние наночастиц диоксида титана на показатели иммунной системы у крыс

РезюмеИзучено возможное влияние наночастиц (НЧ) диоксида титана TiO2 (рутила) на показатели иммунитета крыс. Эксперимент проведен на 40 крысах - самцах Вистар, разделенных на 4 группы. Ежедневно крысы 1-й и 2-й групп получали внутрижелудочно через зонд деионизованную воду, 3-й и 4-й групп - водную дисперсию НЧ в дозе 100 мг на 1 кг массы тела. На 1-й, 3-й и 5-й дни эксперимента крыс 2-й и 4-й групп внутрибрюшинно иммунизировали 100 мкг овальбумином куриного яйца (ОВА). На 21-й день вводили дополнительно еще 10 мкг ОВА. В ходе исследования оцененивали концентрацию специфических IgG-антител, цитокинов - интерлейкинов (ИЛ) -6 и -10, фактора некроза опухоли α (ФНО-α), экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a, фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов, апоптоз лимфоцитов, гематологические показатели крови. В результате проведенных исследований было установлено, что внутрижелудочное введение животным НЧ рутила приводит к достоверному усилению у них гуморального иммунного ответа на модельный пищевой антиген (р<0,05). При анализе лейкоцитарной формулы выявлено достоверное снижение уровня незрелых клеток при воздействии НЧ на фоне иммунизации. Установлено, что прием НЧ приводит к достоверному снижению относительного числа В-лимфоцитов у иммунизированных животных, а также к достоверному увеличению фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови. Индекс стимуляции фагоцитоза достоверно повышается при приеме НЧ по сравнению с контролем (неиммунизированные животные). Влияние НЧ рутила на уровень продукции цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-α), гематологические показатели крови, апоптоз не выявлено как у интактных, так и у иммунизированных животных. Таким образом, показано, что введение НЧ рутила в желудок влияет на некоторые показатели специфического и неспецифического иммунитета как иммунизированных, так и интактных крыс.

Ключевые слова:наночастицы, диоксид титана, токсичность, иммунный ответ

Вопр. питания. - 2012. - № 6. - С. 47-53.

Искусственные наночастицы (НЧ) и наноматериалы, объемы производства и использования которых быстро возрастают, должны рассматриваться как принципиально новый фактор окружающей среды с потенциально возможным неблагоприятным воздействием на здоровье человека [7, 8, 12, 27]. В составе пищевых продуктов могут присутствовать наноматериалы, в частности НЧ диоксида титана (TiO2) в результате случайной контаминации ими продовольственного сырья, воды и воздуха производственных помещений или вследствие миграции НЧ из упаковочных материалов, а также преднамеренного добавления в продукты, например, в качестве пищевых добавок [3, 6, 12, 15, 18, 31]. Учет рисков, связанных с экспонированием человека НЧ через пищевые продукты, требует выявления и характеристики всех возможных отдаленных неблагоприятных воздействий наноматериалов на организм при поступлении их через желудочно-кишечный тракт. Одной из возможных мишеней воздействия НЧ при этом может быть иммунная система, поскольку в лимфоидной ткани кишки сосредоточена значительная часть иммунокомпетентных клеток организма [29]. В случае проникновения НЧ из просвета кишечника в кровь [20] нельзя исключать и системного иммунотоксического действия этих частиц [24].

Влияние НЧ TiO2 на систему иммунитета исследовалось в различных модельных системах, а также в условиях in vivo. Так, выявлены [17, 19, 26, 33] признаки наступления апоптоза, увеличение продукции интерлейкинов (ИЛ) при воздействии указанных НЧ на различные линии клеток. В ряде статей [16, 21, 22, 25, 28, 30] сообщается об изменении продукции различных цитокинов, иммуноглобулинов, нарушениях в Т- и В-клеточном звеньях иммунитета при введении НЧ животным парентеральным или ингаляционным путем.

В частности, показано [23], что при введении этого наноматериала крысам интратрахеально происходят повреждения мембраны и ультраструктуры макрофагов, а также увеличение или снижение фагоцитарной активности при воздействии соответственно низких или больших доз НЧ TiO2. В альвеолярных лейкоцитах авторы наблюдали дозозависимое возрастание синтеза оксида азота и продукции фактора некроза опухолей α (ФНО-α). Однако в литературе практически отсутствуют данные о возможном иммунотоксическом действии НЧ TiO2 при пероральном их поступлении. В связи с этим целью настоящей работы явилась оценка воздействия НЧ TiO2 на систему иммунитета при многократном внутрижелудочном их введении интактным и иммунизированным пищевым антигеном крысам.

Материал и методы

В исследовании применяли препарат НЧ TiO2 (рутильная форма) производства фирмы SigmaAldrich (США - Германия) (далее - рутил). По данным трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), препарат был представлен частично агрегированными палочковидными частицами размером в среднем 5Ч40 нм .

Эксперименты проведены на 40 крысах - самцах Вистар с исходной массой тела 100-120 г. Животные были разделены на 4 равные по численности группы и на протяжении всего эксперимента (28 дней) получали сбалансированный полусинтетический рацион в соответствии с методическими указаниями [4]. Крыс размещали в клетках по 3 особи; рацион и воду животные получали в режиме свободного неограниченного доступа. Водную дисперсию НЧ, после предварительной обработки ультразвуком (5 мин, 22 Вт, 44 кГц) вводили крысам 3-й и 4-й групп ежедневно внутрижелудочно через зонд в дозе 100 мг на 1 кг массы тела. Крысы 1-й и 2-й групп получали в тех же условиях носитель наноматериала - деионизованную воду. На 1-й, 3-й и 5-й дни опыта крыс 2-й и 4-й групп внутрибрюшинно иммунизировали по схеме [32]: 100 мкг 5-кратно перекристаллизованным овальбумином куриного яйца (ОВА), адсорбированным на 10 мг свежеосажденного гидроксида алюминия. На 21-й день вводили дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа. На 29-й день эксперимента крыс умерщвляли путем полного обескровливания, проводимого под эфирным наркозом. Из нижней полой вены брали кровь для исследования и готовили сыворотку.

Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивали по концентрации циркулирующих специфических IgG-антител с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (ИФА) на полистироле [1]. Ответ антител анализировали на основе уровня антител в сыворотке крови (мг/см3), десятичного логарифма концентрации и величины оптической плотности в реакции ИФА за вычетом фона (неспецифической сорбции) контрольного образца.

Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах периферической крови определяли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, производства фирмы Beckman Coulter, США). В работе использовали следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33) - экспрессируется на В-лимфоцитах, моноцитах, наивных Т-клетках; CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах; CD4 (клон ОХ-38) - экспрессируется на Т-лимфоцитах -хелперах; CD8 (клон ОХ-38) экспрессируется на цитотоксических Т-лимфоцитах, CD161а (клон 10/78) - экспрессируется на NK-клетках. Измерения проводили на проточном цитофлюориметре FC-500 производства фирмы Beckman Coulter, США.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови крыс использовали лейкоциты, выделенные по стандартной методике [5] из цельной периферической крови. Тестирование выполняли с помощью набора реагентов "Phagocytosis Assay Kit" (IgG FITC) производства фирмы Cayman Chemical Company (США) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Объектом фагоцитоза служат частицы латекса, опсонизированные IgG FITC. Анализ проб проводили на цитофлюориметре по программе "Cytomics CXP Software". При этом популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяли с помощью гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния. Результаты (процент клеток, инкорпорировавших частицы латекса) регистрировали на канале флюоресценции Fl1.

Апоптоз лимфоцитов периферической крови изучали методом цитофлюориметрии с использованием флюоресцентных зондов аннексина V-FITC и 7-аминоактиномицина D (7-AAD). Принцип анализа и методика подробно изложены в нашей предыдущей работе [11].

На гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (Beckman Coulter, США) с использованием стандартного набора реагентов (Beckman Coulter, Франция) в образце цельной крови определяли следующие параметры: количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, лейкоцитарную формулу, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцита, относительный объем тромбоцитов, наличие (в %) незрелых клеток.

Определение ИЛ-6 и -10, а также ФНО-α в сыворотке крови крыс проводили методом двухвалентного твердофазного биотинстрептовидинового иммуноферментного теста ("сэндвич"ИФА) с использованием коммерческих наборов "Bioscience" (Bender MedSystems GmbH, Австрия) [5]. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на автоматическом планшетном фотометре "ЭФОС 9305" (производства фирмы ОАО "МЗ Сапфир", Россия).

Достоверность (р) различий средних показателей в группах определяли с использованием двустороннего t-теста Стьюдента. О различии распределений показателей судили по величине непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05. Однородность распределения величины определяемого показателя для всех групп животных проверяли с помощью теста на остаточную дисперсию (критерий ANOVA) и факторного анализа на наличие иммунизации и НЧ рутила.

Результаты и обсуждение

В табл. 1 представлены результаты определения специфических IgG-антител крыс к ОВА. Как следует из полученных данных, у неиммунизированных животных (1-я и 3-я группы) антитела в сыворотке крови практически отсутствуют, тогда как у иммунизированных (2-я и 4-я группы) отмечается высокий гуморальный иммунный ответ (р<0,001; ANOVA). У животных 2-й группы (иммунизированные на фоне получения деионизованной воды) средний уровень антител в сыворотке крови был в 1,71 раза ниже, чем у животных 4-й группы, иммунизированных ОВА на фоне внутрижелудочного введения НЧ рутила (р<0,05; t-тест). Таким образом, внутрижелудочное введение НЧ рутила животным приводит к достоверному усилению у них гуморального иммунного ответа на модельный пищевой антиген, что может рассматриваться как признак усиления системной сенсибилизации организма этим белком, являющимся в условиях используемой экспериментальной модели аллергеном [32].

Как показали результаты определения ИЛ (цитокинов) в сыворотке крови, ИЛ-6 был выявлен только у 1 животного из 1-й группы и у 1 из 3-й группы. ФНО-α в пределах чувствительности метода не выявлен ни в одном случае. Таким образом, синтез этих цитокинов, свидетельствующих об интенсивности воспалительных процессов, в условиях данной экспериментальной модели практически не наблюдается. Средний уровень ИЛ-10 у животных 1-4-й групп составил соответственно (M±m) 63,87±8,44; 50,07±4,86; 57,13±7,42 и 54,23±3,70 пг/см3 (распределение однородное; р>0,05; ANOVA). Сравнение 1-й группы со 2-й и с 3-й группами, а также 2-й с 4-й показало, что уровень ИЛ-10 существенно не изменяется под влиянием как иммунизации, так и введения НЧ (р>0,05). Факторный анализ подтвердил отсутствие влияния на данный индикатор как иммунизации, так и введения НЧ (р>0,05, ANOVA). Таким образом, влияния НЧ рутила на содержание в сыворотке крови перечисленных цитокинов не выявлено ни у иммунизированных, ни у неиммунизированных животных.

Изучение гематологических показателей позволило установить, что как иммунизация ОВА, так и внутрижелудочное введение рутила не приводят к существенному изменению состояния эритроцитов. Данный результат применительно к неиммунизированным животным 1-й и 3-й групп, в принципе, совпадает с данными, полученными ранее на аналогичной модели [10].

Результаты анализа лейкоцитарной формулы (табл. 2) показывают, что основной клеточной популяцией при сенсибилизации крыс модельным пищевым антигеном являются базофилы, что типично для данного вида животных [32]. Введение НЧ рутила сказывается только на незначительном по абсолютной величине, но достоверном снижении численности незрелых клеток (бластов) на фоне иммунизации. Остальные показатели существенно не реагируют на иммунизацию животных белковым антигеном и введение им НЧ.

Результаты оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови животных 1-4-й групп с использованием метода проточной цитофлюориметрии в системе AnV-FITC/7-AAD показали, что ни иммунизация ОВА, ни введение НЧ рутила существенным образом не влияют на рассматриваемые показатели.

Таблица 1. Показатели интенсивности гуморального иммунного ответа (уровень специфических IgG-антител к овальбумину) у животных 1-4-й групп (M±m)

Таблица 2. Показатели лейкоцитов у крыс 1-4-й групп, иммунизированных овальбумином и получающих наночастицы диоксида титана (M±m)

В табл. 3 количественно охарактеризованы основные субпопуляции лимфоцитов периферической крови крыс исследуемых групп. Как следует из представленных данных, иммунизация ОВА оказывает стимулирующее воздействие на уровень Т-хелперов (CD3+CD4+) при соответствующем снижении относительного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), что приводит к повышению иммунорегуляторного индекса (р<0,05; ANOVA). Внутрижелудочное введение НЧ у иммунизированных и неиммунизированных животных существенно не влияет на указанные субпопуляции лимфоцитов (р>0,05; ANOVA). Из результатов сравнения показателей у животных 2-й и 4-й групп видно, что прием НЧ приводит к достоверному снижению относительного числа В-лимфоцитов у иммунизированных животных. Это, по-видимому, обусловлено более активной дифференцировкой В-лимфоцитов в плазматические клетки, являющиеся, как известно, продуцентами IgG-антител к ОВА.

Как следует из данных табл. 4, показатель фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов периферической крови достоверно не связан с факторами иммунизации пищевым антигеном и введения НЧ рутила при раздельном их использовании (р>0,05; ANOVA). Однако при сравнении животных 2-й и 4-й групп установлено, что введение животным НЧ рутила на фоне иммунизации приводит к достоверному увеличению данного показателя. Индекс стимуляции (ИС) фагоцитоза достоверно выше у иммунизированных животных, получавших НЧ рутила, чем у неиммунизированных, получавших воду. Факторный анализ показывает, что ИС является чувствительным индикатором воздействия на крыс как при иммунизации, так и при введении НЧ (р<0,05; ANOVA). Таким образом, фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов также может рассматриваться как одна из мишеней воздействия НЧ рутила как у иммунизированных, так и у неиммунизированных животных.

Полученные данные свидетельствуют о том, что внутрижелудочное введение НЧ рутила стимулирующе влияет как на показатели специфического звена иммунитета (продукция IgG-антител к ОВА), так и на неспецифическую резистентность организма (фагоцитоз). Как было показано в недавних исследованиях [2], выполненных с использованием метода радиоактивных индикаторов, НЧ рутила при однократном внутрижелудочном введении крысам в высокой дозе незначительно всасываются в кровь из кишечника и выявляются во внутренних органах (печени) только в следовых количествах. По данным ТЭМ, при внутрикишечном введении крысам НЧ рутила только единичные его частицы проникают в энтероциты слизистой оболочки стенки кишки [9]. В то же время при многократном внутрижелудочном введении НЧ рутила крысам (что соответствует модели, примененной в настоящей работе) можно выявить очень небольшое накопление диоксида титана в печени [9]. В совокупности эти данные не позволяют исключить возможность воздействия НЧ рутила на некоторые популяции иммунных клеток, что может проявляться, в частности, в адъювантном эффекте (усиление гуморального иммунного ответа на пищевой аллерген). Следствием этого может быть, в частности, усиление аллергической сенсибилизации. Другой возможный механизм воздействия НЧ рутила на функцию иммунной системы организма может состоять в опосредованном влиянии этих частиц на состав микроорганизмов кишечного содержимого, обладающих, как известно, чрезвычайно высоким иммунорегуляторным потенциалом [14]. На возможность реализации такого механизма указывают выявленные ранее эффекты подавления функциональной активности нормальной кишечной бифидофлоры НЧ рутила, вводимых внутрижелудочно [13]. Чтобы установить, какой из возможных механизмов иммунотропного действия НЧ диоксида титана реализуется в действительности, необходимы дополнительные исследования.

Работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы".

Таблица 3. Показатели клеточного звена иммунитета (субпопуляции лимфоцитов, %) у крыс 1-4-й групп, иммунизированных овальбумином и получающих наночастицы диоксида титана (M±m)

Таблица 4. Фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов у животных 1-4-й групп (M±m)

Литература

1. Боровик Т.Э., Гмошинский И.В., Рославцева Е.А. и др. // Педиатрия. - 1998. - № 5. - С. 50-56.

2. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Распопов Р.В. и др. // Мед. радиол. и радиационная безопасность. - 2012. - Т. 57, № 3. - С. 5-12.

3. Верников В.М., Арианова Е.А., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 2. - С. 4-17.

4. МУ 1.2.2520-09. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

5. МУ 1.2. 2635-10. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 123 с.

6. Невзорова В.В., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 4. - С. 54-60.

7. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.

8. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. - С. 4-8.

9. Онищенко Г.Е., Ерохина М.В., Абрамчук С.С. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2012. - Т. 154, № 8. - С. 231-237.

10. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

11. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

12. Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Тутельян В.А. // Гиг. и сан. - 2009. - № 5. - С. 7-11.

13. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

14. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. - М. : ГРАНТЪ, 1998. - 287 с.

15. Chaudhry Q., Scotter M., Blackburn J. et al. // Food Addit. Contam. - 2008. - Vol. 25, N 3. - P. 241-258.

16. Duan Y., Liu J., Ma L. et al. // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31, N 5. - P. 894-899.

17. Gonсalves D.M., Chiasson S., Girard D. // Toxicol. In Vitro. - 2010. - Vol. 24, N 3. - P. 1002-1008.

18. Hassellоv M., Readman J.W., Ranville J.F., Tiede K. // Ecotoxicology. - 2008. - Vol. 17, N 5. - P. 344-361.

19. Hussain S., Thomassen L.C., Ferecatu I. et al. // Part. Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 10. - P. 1-17.

20. Jani P., Halbert G.W., Langridge J., Florence A.T. // Pharm. Pharmacol. - 1990. - Vol. 42. - P. 821-826.

21. Kim I.S., Baek M., Choi S.J. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 10, N 5. - P. 3453-3458.

22. Larsen S.T., Roursgaard M., Jensen K.A., Nielsen G.D. // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. - 2010. - Vol. 106, N 2. - P. 114-117.

23. Liu R., Zhang X., Pu Y. et al. // J. Nanosci. Nanotechnol. - 2010. - Vol. 8, N 10. - P. 5161-5169.

24. Lomer M.C., Thompson R.P., Powell J.J. // Proc. Nutr. Soc. - 2002. - Vol. 61, N 1. - P. 123-130.

25. Moon C., Park H.J., Choi Y.H. et al. // J. Toxicol. Environ. Health A. - 2010. - Vol. 73, N 5. - P. 396-409.

26. Morishige T., Yoshioka Y., Tanabe A. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. - Vol. 392, N 2. - P. 160-165.

27. Oberdцrster G., Maynard A., Donaldson K. et al. // Part. Fibre Toxicol. - 2005. - Vol. 2, N 1. - P. 8-43.

28. Rossi E.M., Pylkkдnen L., Koivisto A.J. et al. // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, N 2. - P. 422-433.

29. Salminen S., Bouley C., Boutron M.C. et al. // Br. J. Nutr. - 1998. - Vol. 80, suppl. S1. - P. S147-S171.

30. Shin J.A., Lee E.J., Seo S.M. et al. // Neuroscience. - 2010. - Vol. 165, N 2. - P. 445-454.

31. Sigubayashi K., Todo H., Kimura E. // J. Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 33, N 3. - P. 293-298.

32. Stokes С.R., Miller В.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity // Food Allergy and Intolerance. - London: Bailliere Tindall, 1987. - P. 286-300.

33. Wilhelmi V., Fischer U., van Berlo D. et al. // Toxicol. In Vitro. - 2012. - Vol. 2, N 26. - P. 323-334.