Изучение апоптоза гепатоцитов крыс для оценки безопасности и эффективности применения биологически активных веществ

РезюмеИзучали величину апоптоза гепатоцитов у крыс, находившихся в течение 2 нед на сбалансированном полноценном полусинтетическом рационе с включением экстракта зеленого чая, эпигаллокатехингаллата (ЭГКГ), кверцетина, кофеина (соответственно 1-4-я опытные группы). Содержание ЭГКГ, кверцетина и кофеина в рационах крыс 2-4-й опытных групп соответствовало их содержанию в 1-й группе, а также в тонизирующих напитках. Установлено, что применение в рационах крыс экстракта зеленого чая и его компонентов не оказывает повреждающего действия на гепатоциты крыс. Использование рационов с включением экстракта зеленого чая, кверцетина и кофеина обеспечивает четкую тенденцию к стабилизации цитоплазматической мембраны гепатоцитов по сравнению с показателем в контроле (крысы, получавшие тот же рацион, но без включения указанных выше биологически активных веществ).

Ключевые слова:апоптоз гепатоцитов, экстракт зеленого чая, эпигаллокатехингаллат, кверцетин, кофеин

Апоптоз - высокорегулируемая форма запрограмированной гибели клеток, характеризующаяся определенными морфологическими и биохимическими признаками [2, 12]. Эта форма гибели клеток определяется генетически контролируемой программой, регулирующей продолжительность жизни неповрежденной клетки. Благодаря апоптозу из многоклеточного организма удаляются без повреждения микроокружения клетки, отжившие свой век. Апоптоз обеспечивает тканевый гомеостаз, регулирует объем тканей и образование новых клеток. Различные патологические процессы, активирующие проапоптозные механизмы, заканчиваются гибелью клеток и деструкцией ткани. С этой точки зрения, злокачественная трансформация, возникающая в ряде случаев в организме, может быть объяснена недостаточностью апоптоза и сохранением за счет этого клеток с онкогенными мутациями.

Установлено, что в норме апоптоз гепатоцитов, наблюдающийся в паренхиме печени, чаще возникает в гепатоцитах, окружающих центральную вену, причем первые два слоя печеночных клеток содержат 80% апоптозных тел у человека и 95% у крыс [16]. Такая локализация апоптоза гепатоцитов может рассматриваться как подтверждение известной концепции "текущей печени" [14], в соответствии с которой гепатоциты мигрируют от перипортальной зоны, где они образуются путем деления (митоза), к перицентральной, где подлежат уничтожению. Таким образом апоптоз принимает участие в процессе физиологического обновления гепатоцитов [9]. Следует отметить, что апоптозу принадлежит ведущая роль в развитии ряда патологических изменений, развивающихся, в частности, при остром и хроническом вирусном гепатите [1, 7], алкогольных поражениях [6, 15], аутоиммунном гепатите [25] и других заболеваниях печени.

Механизмы реализации апоптоза чрезвычайно сложны и в определенной мере индивидуальны для конкретного типа клеток. Результаты исследований в этой области нашли свое отражение в ряде монографий и оригинальных статей [3, 4, 8, 13, 22].

Апоптоз инициируют многие факторы. К ним относят различные патогенные и токсические вещества, оксидативный стресс, оксид азота, нарушения метаболизма, повреждения ДНК, устранение факторов роста и активацию специфических рецепторов, иммунологически опосредованные воздействия [5, 21]. На основе знаний о программированной гибели клеток используется широкий ряд препаратов для регуляции этого процесса в разных типах клеток. В качестве препаратов и соединений, ингибирующих апоптоз, прежде всего рассматриваются природные, синтетические и эндогенные антиоксиданты и ферменты антиоксидантной защиты (биофлавоноиды, витамин Е, Mn-супероксиддисмутазы, глутатион, глутатионпероксидаза и др.) [10, 20]. Биофлавоноиды отличаются высокой биологической активностью, обусловленной наличием антиоксидантных свойств, проявляющихся антирадикальным действием, антилипопероксидным, антикислородным, хелатированием металлов [18]. Антиоксидантная активность катехинов проявляется и в защите от окисления липопротеидов низкой плотности [23]. Наличие ингибирующего влияния катехинов на активацию факторов транскрипции NF-kB и активатор-протеин АР-1 обусловливает их онкопротекторное действие [17, 20, 24]. Установлено, что эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ) является самым сильным антиоксидантом из известных антиоксидантов растительного происхождения [26].

Изучение влияния флавоноидов и других биологически активных веществ на апоптоз гепатоцитов осуществляется преимущественно в условиях индукции апоптоза in vivo или в культурах опухолевых клеток. Целью настоящего исследования стало изучение неиндуцированного апоптоза гепатоцитов крыс в качестве информативного маркера для оценки безопасности и модулирующего действия биологически активных веществ. В работе использовали экстракт зеленого чая - источник полифенолов, в частности катехинов [11], а также отдельные компоненты, входящие в его состав.

Материал и методы

Исследование влияния экстракта зеленого чая, ЭГКГ, кверцетина и кофеина на апоптоз гепатоцитов проводили в 5 группах крыс-самцов Вистар (по 6 животных в каждой) с исходной массой тела 179±3 г. Крысы контрольной группы получали полусинтетический полноценный рацион, содержащий казеин, кукурузный крахмал, растительное масло+лярд (1:1), витаминную и солевую смеси, микроцеллюлозу. Крысы 1-й опытной группы получали тот же рацион с включением экстракта зеленого чая ("Nestle India Ltd.", Индия) в количестве 375 мг/кг; 2-й группы - ЭГКГ ("DSM", Швейцария) в количестве 105 мг/кг; 3-й - кверцетин ("Sichuan Xieli Pharmaceutical Co. Ltd", КНР) в количестве 17,3 мг/кг; 4-й - кофеин ("Panreac", Испания) в количестве 39 мг/кг. Содержание ЭГКГ, кверцетина и кофеина в рационах крыс 2-4-й опытных групп соответствовало содержанию этих биологически активных веществ в рационе крыс 1-й опытной группы (экстракт зеленого чая). Используемые в работе дозировки биологически активных веществ соответствуют таковым в тонизирующих напитках (3,6 г/л экстракта зеленого чая). Длительность эксперимента составила 2 нед. Применяли принцип кормления животных вволю при свободном доступе к воде. Ежедневно контролировали состояние животных, поедаемость корма, прирост массы тела. По завершении эксперимента животных под эфирным наркозом декапитировали и подвергали патолого-анатомическому вскрытию.

Суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани ("Becton Dickenson and Company", США). Однократно отмывали клетки забуференным фосфатами 0,15 М раствором хлорида натрия, рН 7,2-7,4 (PBS) и готовили пробу с концентрацией клеток 1Ч106 см3. Гепатоциты окрашивали конъюгированным с флюорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) ("Beckman Coulter Int.", США) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) ("Beckman Coulter Int.", США) с последующей детекцией на проточном цитофлюориметре FC500 ("Beckman Coulter Int.", США). Иссеченные кусочки печени и клеточную суспензию в процессе работы хранили на льду. Результаты представлены в виде процентного соотношения живых клеток и гепатоцитов, находящихся на разных стадиях апоптоза на 10 000 просчитанных объектов в каждом образце.

Таблица 1. Масса тела и относительная масса печени крыс контрольной и опытных (1-4-я) групп (M±m)

Таблица 2. Неиндуцированный апоптоз гепатоцитов крыс контрольной и опытных групп (M±m), %

Все данные подвергали компьютерному анализу по программе SPSS Statistics Base 17.0. Сравнение между группами проводили по критерию Стьюдента. Различия между группами считались достоверными при р≤0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание крыс в течение 2 нед на контрольном полусинтетическом рационе, а также рационах, включающих экстракт зеленого чая и входящих в его состав биологически активных компонентов, не привело к статистически достоверным различиям массы тела и относительной массы печени животных. Результаты представлены в табл. 1.

При проведении работы мы учитывали принцип метода изучения степени апоптоза гепатоцитов, который основан на свойстве аннексина V связываться с фосфатидилсерином клеточной мембраны и способности 7-AAD встраиваться между цитозином и гуанином двухцепочечной ДНК клеток с нарушенной целостностью мембраны [19]. На ранних стадиях апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, но происходят конверсия мембранных фосфолипидов и появление фосфатидилсерина на поверхности клетки. Аннексин V с высокой аффинностью связывается с фосфатидилсерином и идентифицирует ранний апоптоз. Поздняя фаза апоптоза сопровождается не только утратой асимметрии фосфолипидов мембраны, но и нарушением целостности мембраны, фрагментацией ДНК и резким возрастанием мембранной проницаемости для катионных красителей. Комбинированная окраска аннексином V-FITC и 7-ААD позволяет идентифицировать неапоптозные клетки (при сочетании аннексин-Vнегативные/7-ААD-негативные), ранние проапоптотические изменения (при сочетании: аннексин-Vпозитивные/7-ААD-негативные) и поздние варианты клеточной гибели (7-ААD-позитивные клетки).

Результаты исследования апоптоза гепатоцитов крыс представлены в табл. 2.

Как следует из представленных данных, у животных всех опытных групп относительное содержание в гейте гепатоцитов клеток, не находящихся в стадии апоптоза, статистически достоверно не отличалось от показателя в контроле. В то же время у крыс 1, 3 и 4-й групп обнаружена (по сравнению с контрольными животными) отчетливая тенденция к снижению относительного числа гепатоцитов, у которых наблюдается потеря мембранной асимметрии, что, как известно, характерно для состояния раннего апоптоза. Напротив, у крыс 2-й опытной группы, получавших с рационом ЭГКГ, относительное число гепатоцитов, находящихся в состоянии раннего апоптоза, статистически достоверно превышало показатель у крыс 1-й группы, но не отличалось от такового в контроле.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований установлено следующее:

1) исследованные параметры состояния апоптоза у крыс, потреблявших рацион с включением экстракта зеленого чая, ЭГКГ, кверцетина и кофеина, не отличались от таковых у крыс контрольной группы;

2) применение в рационах крыс экстракта зеленого чая и его компонентов не оказывает повреждающего действия на гепатоциты крыс;

3) применение экспериментальных рационов с включением экстракта зеленого чая, кверцетина и кофеина обеспечивает четкую тенденцию к стабилизации цитоплазматической мембраны гепатоцитов по сравнению с показателем в контрольной группе.

Литература

1. Абдурахманов Д.Т., Коган Е.А., Демура С.М. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2005. - Т. 15, № 2. - С. 42-46.

2. Аруин Л.И. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1998. - № 2. -С. 6-12.

3. Варга О.Ю., Рябков В.А. // Экология человека. - 2006. - № 7. - С. 28-32.

4. Владимирская Е.Б. // Гематология и трансфузиология. - 2002. - Т. 47, № 2. - С. 35-40. 5. Давыдов В.Г., Бойчук С.В., Шаймарданов Р.Ш. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2006. - Т. 16, № 5. - С. 11-19.

6. Зейц Г. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2001. - № 4. - С. 62-65.

7. Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., Бондаренко О.Ю. и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2002. - Т. 12, № 6. - С. 38-43.

8. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). - М.: Медицина, 2001. - 192 с.

9. Пятницкий Н.Н., Жминченко В.М., Сугоняева Н.П. и др. // Бюл. экспер. биол. - 1977. - Т. 83, № 2. - С. 214-216.

10. Стбиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В. и др. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях. - Екатеринбург, 2008. - С. 5-14.

11. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 4. - С. 4-20.

12. Ярилин А.А. // Иммунология. - 1996. - № 6. - С. 10-23.

13. Adams J.M. // Genes Dev. - 2003. - Vol. 17. - P. 2481-2495.

14. Arber N., Zajicek G., Aruiel I. // Liver. - 1988. - Vol. 8. - P. 8 0 - 8 7.

15. Baroni G.S., Marucci L.B., Benedetti A. et al. // J. Hepatol. - 1994. - Vol. 20. - P. 508-513.

16. Benedetti A., Jezugel A.M., Oriandi F. // J. Hepatol. - 1988. - Vol. 7. - P. 319-324.

17. Beits L.A., Bayer D.K., Moss A.L. et al. // Anticancer Agents Med. Chem. - 2006. - Vol. 6, N 5. - P. 389-406.

18. Bombardelli T., Morazzoni P. // Chim. Oggi. - 1993. - Vol. 11. - P. 2 5 - 2 8 .

19. Darzynkiewicz Z., Bedner E., Smolewski P. // Semin. Hematol. - 2001. - Vol. 38, N 2. - P. 179-193.

20. Dou Q.P. // Nutr. Cancer. - 2009. - Vol. 61, N 6. - P. 8 2 7- 8 3 5 .

21. Feldman G. // J. Hepatol. - 1997. - Vol. 22. - P. 1-11.

22. Iton K. // Rheumatology. - 2004. - Vol. 43. - P. 277-285.

23. Luo V., Kannar K., Waldquist M.C. et al. // Lancet. - 1997. - Vol. 349. - P. 3360-3361.

24. Mackenzie G.G., Carrasquedo F., Delfino J.M. et al. // FASEB J. - 2004. - Vol. 18. - P. 167-169.

25. Schattenberg J.M., Galle P.R., Schuchmann M. // Liver Int. - 2006. - Vol. 26, N 8. - P. 904-911.

26. Webb T. // J. Natl. Cancer Inst. - 2000. - Vol. 92. - P. 10 3 8 -10 5 9 .