Характеристика пероральной токсичности фуллерена С60 для крыс в 92-дневном эксперименте

РезюмеИзучали токсичность фуллерена С60 при его ежедневном внутрижелудочном введении крысам-самцам Вистар в дозе 0,1; 1 и 10 мг/кг в течение 92 дней. Определяли интегральные, биохимические, физиологические, гематологические, иммунологические показатели, характеризующие состояние организма животных, а также биораспределение фуллерена С60 по органам и тканям крыс. Большинство полученных результатов свидетельствовало об отсутствии влияния фуллерена С60 на животных, получавших его во всем диапазоне изученных доз. Некоторые из изученных показателей, не связанных с действием используемых компонентов раствора носителя, демонстрировали дозозависимые отклонения: обнаружено повышение активности CYP2B1 на 21-35% при дозах 1 и 10 мг/кг, а также снижение содержания мочевой кислоты и повышение содержания мочевины при дозе 10 мг/кг. Тем не менее эти изменения оставались в пределах физиологической нормы. Нужно отметить достоверное (p=0,02) увеличение величины всасывания антигенных белков в желудочно-кишечном тракте животных, получавших фуллерен С60 в дозе 10 мг/кг, что следует рассматривать как признак явного действия фуллерена С60 в указанной дозе на стенку кишечника.

Ключевые слова:фуллерен, наночастицы, крысы, токсичность

Вопр. питания. - 2012. - № 5. - С. 20-27.

Фуллерен С60 - новая аллотропная форма углерода - имеет большие перспективы в технике, медицине и пищевой промышленности. Он способен подавлять свободнорадикальные процессы в темноте, что объясняется наличием антиоксидантной [1, 8, 11, 16], гено- [1], радио- [1] и гепатопротекторной (при алкогольной интоксикации) активности [16]. Сообщается [9], что продолжительность жизни крыс, получавших многократно в течение 7 мес фуллерен С60 в оливковом масле (в дозе 1,7 мг/кг массы тела), увеличилась на 90% по сравнению с таковой у животных контрольной группы. Однако использование фуллеренсодержащей продукции сдерживается в связи с недостатком сведений о его токсикологической характеристике (в частности о максимально допустимых безопасных дозах при длительном приеме).

Согласно результатам ряда исследований, фуллерен С60 характеризуется, по-видимому, низкой токсичностью для млекопитающих (лабораторные крысы и мыши) при эпикутанном [12, 13], интратрахеальном [10, 16] и внутрибрюшинном [11] путях применения. Пероральное введение крысам водных дисперсий фуллерена (стабилизированных поверхностно-активными веществами) в дозе 1-10 мг/кг на протяжении 28 дней не приводило к ухудшению состояния здоровья животных и вызывало относительно незначительные изменения в показателях массы печени, содержания цитохрома Р450 и активности глутатионредуктазы [7]. Однако имеющиеся в настоящее время данные не позволяют сделать обоснованное заключение о безопасности перорального приема фуллерена С60 более длительное время.

Задачей настоящего исследования была характеристика токсичности фуллерена С60 для лабораторных крыс в условиях 3-месячного перорального поступления в диапазоне доз от 0,1 до 10 мг/кг. С учетом низкой растворимости фуллерена С60 в воде в качестве формы его введения была выбрана коллоидная дисперсия, стабилизированная крахмалом и пищевой добавкой Твин-80 (Е433).

Материал и методы

Дизайн эксперимента разработан в соответствии с МУ 1.2.2520-09 [3]. Исследование проведено на 75 крысах - самцах Вистар с исходной массой тела 100±5 г (M±m), полученных из питомника РАМН "Столбовая". Крыс содержали группами по 3 животных в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната, в кондиционированном помещении (23-25 °С) со световым циклом 12 ч. На протяжении всего эксперимента крысы получали сбалансированный полусинтетический казеиновый рацион [3]. Доступ животных к корму и питьевой воде не ограничивали.

Животные были разделены на 5 групп по 15 крыс в каждой. Животным 1-й группы (контроль) на протяжении всего эксперимента (92 дня) ежедневно вводили внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные 2-й группы (сравнения) в течение такого же времени ежедневно внутрижелудочно получали 1 мл раствора носителя (на 100 г массы тела) который состоял из деионизованной воды, 2% пищевого крахмала и 0,5% Твина-80 (производство "Sigma-Aldrich", США). Расчетная энергетическая ценность носителя с учетом возможности частичной ферментации его углеводного компонента в толстой кишке не превышала 0,2% от энергетической ценности дневного рациона животных.

Крысы 3, 4 и 5-й опытных групп получали ежедневно внутрижелудочно фуллерен С60 в виде раствора (дисперсии), приготовленного на указанном выше носителе: крысы 3-й группы получали фуллерен С60 в дозе 0,1 мг/кг; 4-й группы - в дозе 1,0 мг/кг массы тела; 5-й группы - в дозе 10 мг/кг. Объем вводимого раствора фуллерена С60 для животных 3, 4, 5-й групп равнялся 1 мл раствора на каждые 100 г массы тела животного.

В эксперименте был использован препарат фуллерена С60 производства ЗАО "Фуллерен-Центр" (Нижний Новгород, Россия). Качественный и количественный анализ, проведенный, согласно [2], методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), показал, что чистота используемого нами образца фуллерена С60 составляет не менее 99,8%. Фуллерен С60, используемый в наших экспериментах, предварительно тщательно растирали в ступке, добавляли дисперсионную среду, перемешивали на вортексе при 3000 об./мин 10 мин и обрабатывали в течение 3 мин на погружном ультразвуковом процессоре, при мощности импульса 80 Вт и частоте 20 кГц.

В ходе введения препарат постоянно перемешивали с помощью магнитной мешалки.

За 3 ч до окончания эксперимента 9 животным из каждой группы внутрижелудочно через зонд вводили по 2 г/кг массы лиофилизированный белок куриного яйца в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. Затем этих крыс умерщвляли путем глубокого обескровливания под эфирной анестезией. Остальных животных после окончания эксперимента (через 3 мес опыта) умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции отбирали (МУ 1.2.2745-10 [4]) кровь и внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие, селезенку, надпочечники, семенники, тимус, головной мозг, внутрибрюшинную жировую клетчатку). С помощью методов, указанных в работах [6, 7], исследовали интегральные (состояние шерстяного покрова крыс, массу их тела, относительную массу внутренних органов), биохимические: в печени - содержание микросомальных цитохрома Р450, b5, активность ферментов Р450 метоксирезоруфин-О-деметилазы - CYP 1A2 и пентоксирезоруфин-О-деалкилазы - CYP 1В2, глутатионтрансферазы, UDP-глюкуронозилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы, арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, лизосомальных гидролаз - арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, небелковых тиолов, главным образом восстановленного глутатиона. В моче определяли интенсивность окислительного повреждения ДНК по величине экскреции 8-оксо-2-дезоксигуанозина; в плазме крови - содержание общего белка, альбумина, глюкозы, креатинина, мочевой кислоты, мочевины, активность ферментов аланинаминотрасферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АС), щелочной фосфатазы, показателей интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), - содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), малонового альдегида, активность глютатионредуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы в эритроцитах, гематологических (число лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, концентрация в крови гемоглобина, объем эритроцита, содержание гемоглобина в 1 эритроците), иммунологические (в крови содержание цитокинов-интерлейкинов (ИЛ) -6, -10, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), лимфоцитов CD45RA+, CD161a+, процент лимфоцитов CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4 и CD8, интенсивность процесса апоптоза гепатоцитов с определением общего числа клеток, находящихся в состоянии апоптоза, в том числе раннего и позднего). У животных, которые получали куриный белок, кроме вышеперечисленных показателей, с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного метода [15] определяли в сыворотке крови антигенный овальбумин.

Кроме отмеченных исследований, в органах и тканях крыс с помощью ВЭЖХ системы "Agilent 1200" с колонкой "ZORBAX C18" (размером 4,6Ч150 мм, заполнена С18 фазой с размером гранул 5 мкм) проводили количественное определение фуллерена С60. Методика пробоподготовки и анализа была подробно изложена ранее [7].

Статистический анализ данных выполняли с использованием компьютерной программы SPSS 17.0, согласно критерию ANOVA (в целях оценки однородности распределения показателей в группах и факторного анализа), тесту Стьюдента и непараметрическому тесту Манна-Уитни. Различия между группами животных признавали достоверными при p0,05.

Результаты и обсуждение

На протяжении всего 3-месячного эксперимента у животных всех опытных групп был нормальный внешний вид, без каких-либо изменений в состоянии шерстяного покрова и поведения; летальность среди животных отсутствовала. Как следует из рис. 1, крысы контрольной и всех опытных групп прибавляли в массе тела одинаково. В конце эксперимента средняя масса животных в 1-5-й группах составила соответственно 510±10; 535±18; 522±17; 523±25 и 535±11 г (распределение однородно, согласно ANOVA p>0,05; все различия были недостоверны - p>0,05). Относительная масса внутренних органов крыс всех опытных групп находилась в пределах интервала нормальных значений и достоверно не отличалась от контроля (табл. 1). Таким образом, 3-месячное внутрижелудочное введение фуллерена С60 во всех применявшихся дозах не выявило признаков токсического действия по изученным показателям.

Анализ содержания С60 во внутренних органах животных 3-5-й групп, получавших этот наноматериал в различных дозах, показал, что при ежедневном его поступлении в организм животных он не был обнаружен в большинстве исследованных органов (печени, почках, головном мозге, селезенке и жировой ткани).

Введение фуллерена С60 животным не оказывало влияния на уровень содержания в печени цитохромов Р450 и b5, а также на активность UDP-глюкуронозилтрансферазы (табл. 2). В то же время активность глутатион-S-трансферазы была повышена на 26-28% у животных 4-й группы по сравнению с животными 1-й и 2-й групп. При более высокой дозе фуллерена С60 (5-я группа) данный эффект не выявлялся. Активность изоформы Р450 CYP 1A2 была также одинаковойу животных опытных и контрольной групп. Можно предположить нестойкое воздействие фуллерена С60 на этот фермент, что было показано нами ранее [7] при 28-дневном введении фуллерена С60. Однако активность изоформы Р450 CYP 2B1 была достоверно повышена у животных 4-й и 5-й групп (по сравнению с животными 1-й и 2-й). При этом повышение составляло только 21-35% по абсолютной величине и свидетельствовало о физиологической активации системы детоксикации в условиях длительного поступления фуллерена С60 в организм, что, по-видимому, нельзя рассматривать как признак токсического действия.

Анализ неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз печени крыс (арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, β-глюкуронидазы) не выявил различий между группами животных, получавших фуллерен С60, и контрольными. Таким образом, длительное пероральное введение фуллерена C60, по-видимому, не влияет на стабильность лизосомальных мембран печени.

Таблица 1. Относительная масса внутренних органов крыс (в %) 1-5-й групп на 92-й день эксперимента (M±m)

Таблица 2. Показатели активности ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков у крыс групп 1-5-й на 92-й день эксперимента (M±m)

Показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния системы антиоксидантной защиты, определенные в эритроцитах и плазме крови животных (табл. 3), свидетельствуют об отсутствии каких-либо неблагоприятных эффектов при введении животным фуллерена C60.

Содержание диеновых конъюгатов ПНЖК достоверно не различается у животных разных групп, а уровень МДА у животных, получавших высокие дозы фуллерена С60 (4-я и 5-я группы), даже имеет тенденцию к снижению по сравнению с контролем. Однако данный эффект, по-видимому, неспецифичен для фуллерена С60, так как он проявляется и у животных 2-й группы, получавших носитель (факторный анализ по наличию носителя дает значение p<0,05 в тесте ANOVA). Это же, скорее всего, происходит и при повышении активности глутатионредуктазы у крыс, получавших фуллерен С60 и носитель (2-я группа животных). Следует отметить, что возрастание активности этого фермента под действием фуллерена С60 было выявлено нами ранее [7] у животных, получавших препарат в течение 28 дней. Что же касается других ферментов антиоксидантной защиты (глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы), то их активность в условиях введения фуллерена С60 не претерпевает каких-либо изменений.

Содержания в печени крыс небелковых тиолов, представленных в основном восстановленным глутатионом, составило у животных 1-5-й групп соответственно 70,7±6,9; 61,9±4,1; 69,6±6,7; 53,4±4,5 и 64,4±7,8 мкмоль. Единственная тенденция, состоящая в некотором снижении этого показателя у животных в 4-й группе, оказалась недостоверной (p>0,05) при сравнении с 1-й и 2-й группами. Таким образом, фуллерен С60, по-видимому, при длительном приеме не влияет на этот важный показатель тканевого окислительно-восстановительного гомеостаза. С этим согласуется отсутствие существенных изменений интенсивности окислительного повреждения ДНК, оцениваемого по экскреции с 8-оксо-2-дезоксигуанозина у крыс 3-5-й групп по сравнению как с контролем (1-я группа), так и со 2-й группой.

Таблица 3. Показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния системы антиоксидантной защиты у крыс 1-5-й групп на 92-й день эксперимента (M±m)

Таблица 4. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс 1-5-й групп (M±m)

Анализ биохимических показателей сыворотки крови животных, приведенных в табл. 4, свидетельствует об отсутствии дозозависимых изменений у крыс, длительно получавших фуллерен С60. Активность АЛТ и АСТ у животных 3-й и 4-й групп остается в пределах колебаний, характерных для контрольных животных (1-я группа), а у крыс 5-й группы оказывается даже несколько ниже, чем в контроле. Это указывает на отсутствие токсического действия фуллерена С60 на организм. Небольшое и не являющееся дозозависимым повышение концентрации глюкозы в крови у животных 3-5-й групп по сравнению с таковым у животных 2-й группы, получавших носитель, находится тем не менее в пределах вариабельности нормы (1-я группа) и не свидетельствует об ухудшении толерантности к глюкозе под действием фуллерена С60. При наиболее высокой дозе (5-я группа животных) отмечены незначительные сдвиги в показателях азотистого обмена (рост уровня мочевины и снижение содержания мочевой кислоты) по сравнению с контролем, однако эти изменения невелики по абсолютной величине (около 20%) и не демонстрируют четкой зависимости от дозы вводимого фуллерена С60. Остальные приведенные в таблице показатели азотистого обмена и активность щелочной фосфатазы на фоне приема фуллерена С60 не претерпевают каких-либо изменений.

Гематологические показатели, характеризующие систему кроветворения (количество нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов, средний объем эритроцита, концентрация гемоглобина в крови и в отдельных эритроцитах) не отличались у животных 3-5-й групп, получавших различные дозы фуллерена, от показателей в контроле у животных, получавших носитель. Показатель гематокрита был достоверно (p<0,05), но незначительно по абсолютной величине (на 4%) повышен у животных 5-й группы по сравнению с контролем, но не с животными, получавшими носитель. Анализ лейкоцитарной формулы крови животных выявил достоверные изменения в уровне общих лейкоцитов (рост на 30% у животных 4-й группы по сравнению с животными 1-й; p<0,05), лимфоцитов (рост на 10-11% у животных 3-й группы по сравнению с 1-й и 2-й группами; p<0,05) и нейтрофилов (снижение на 11-16% у животных 3-5-й групп по сравнению с 1-й, p<0,05). Все эти изменения, однако, не демонстрировали зависимости от дозы фуллерена С60 и не были достоверными по сравнению с таковыми у животных 2-й группы, получавшими носитель, т.е., возможно, имели неспецифический характер.

Рис. 1. Динамика прироста массы тела крыс 1-5-й групп на протяжении 92 дней эксперимента

Рис. 2. Всасывание антигенного ОВА в кровь животных 1-5-й групп, p=0,02 (t-тест Стьюдента)

Таким образом, какого-либо токсического действия фуллерена С60 на кровь животных опытных групп фактически не выявлено. С этим согласуется отсутствие изменений в количестве субпопуляций лимфоцитов (CD45RA+ и CD161a+, доли CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4/CD8). Единственным выявленным эффектом было снижение доли Т-лимфоцитов (CD3+) с 49,55±3,03% у животных 1-й группы до 40,13±2,90% в 5-й (p<0,05). Однако эти изменения были, возможно, неспецифическими, так как не выявлялись при сравнении 5-й и 2-й групп (p>0,05). Уровни цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-а в сыворотке крови животных 3-5-й групп достоверно не отличались от таковых у контрольных животных. Эти данные в совокупности показывают, что длительный прием фуллерена С60 не сопровождается выраженным неблагоприятным воздействием на иммунный статус животных.

Длительный прием фуллерена С60 не оказывал также какого-либо влияния на апоптоз гепатоцитов, по данным исследования методом проточной цитофлюориметрии с применением красителей аннексин5-FITC и 7-аминоактиномицин D [6]. Токсического действия фуллерена С60 на печень также не установлено ни при одной из его изученных доз.

Что касается величины всасывания в желудочно-кишечном тракте антигенного овальбумина куриного яйца (ОВА), которую определяли по его концентрации в сыворотке крови, то она была достоверно выше в 5-й группе, чем во 2-й (рис. 2). Остальные различия оказались недостоверны. Таким образом, фуллерен С60 способен, по-видимому, оказывать определенное влияние на степень всасываемости в кишечнике макромолекул белка только при наибольшей из изученных нами доз (10 мг/кг). В ранее проведенном исследовании [7] введение фуллерена С60 в такой дозе на протяжении 4 нед не оказывало влияния на данный показатель.

Таким образом, в результате 92-дневного ежедневного внутрижелудочного введения фуллерена С60 выявлены следующие эффекты, которые являются дозозависимыми и не могут быть связаны с неспецифическим действием применяемого носителя: 1) повышение проницаемости кишечной стенки для макромолекул белка при дозе 10 мг/кг; 2) повышение активности CYP 2B1 при дозах 1 и 10 мг/кг массы тела; 3) снижение концентрации мочевой кислоты и повышение уровня мочевины при дозе 10 мг/кг. При этом только первый из перечисленных эффектов может быть однозначно интерпретирован как неблагоприятный, а не обусловленный физиологической адаптацией организма.

Литература

1. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии (на пути к наномедицине). - СПб.: Росток, 2006. - 336 с.

2. Методические рекомендации МР 1.2. 2641-10. Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 103 с.

3. Методические указания МУ 1.2.2520-09. Токсикологогигиеническая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

4. Методические указания МУ 1.2.2745-10. Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 41 с.

5. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

6. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

7. Шипелин В.А., Арианова Е.А., Трушина Э.Н. // Гиг. и сан. - 2012. - № 2. - С. 90-94.

8. Andrievsky G.V., Bruskov V.I., Tykhomyrov A.A. et al. // Free Radic. Biol. Med. - 2009. - Vol. 47, N 6. - P. 786-793.

9. Baati T., Bourasset F., Gharbi N. et al. // Biomaterials. - 2012. - Vol. 33, N 19. - P. 4936-4946.

10. Baker G.L., Gupta A., Clark M.L. et al. // Toxicol. Sci. - 2008. - Vol. 101, N 1. - P. 122-131.

11. Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M. et al. // Nano Lett. - 2005. - Vol. 5. - P. 2578-2585.

12. Moriguchi Т., Yano K., Hokari S. et al. // Full. Sci. Technol. - 1999. - Vol. 7. - P. 195-202.

13. Nelson M.A., Domann F.E., Bowden G.T. et al. // Toxicol. Ind. Health. - 1993. - Vol. 9, N 4. - P. 623-630.

14. Sayes C.M., Reed K.L., Warheit D.B. // Toxicol. Sci. - 2007. - Vol. 97, N 1. - P. 163-180.

15. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. // Clin. Allergy. - 1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.

16. Tykhomyrov A.A., Nedzvetsky V.S, Klochkov V.K. et al. // Toxicology. - 2008. - Vol. 246, N 2-3. - P. 158-165.