Значение некоторых потенциально патогенных микроорганизмов в возникновении пищевых токсикоинфекций. Сообщение 2. Оценка роли токсигенных штаммов Bacillus cereus

РезюмеОбобщены данные о номенклатуре, классификации и таксономии споровых аэробных бактерий группы Bacillus cereus. Приведены основные особенности 2 типов заболеваний, вызываемых ими, и статистические сведения о вспышках пищевых заболеваний. Дана подробная характеристика свойств эметического токсина цереулида. Проведен анализ существующих методов исследования пищевых продуктов на наличие B. cereus и продуцируемых ими токсинов, а также данных о применении различных моделей на основе клеточных культур для изучения цитотоксического действия и энтеротоксигенных свойств B. cereus. Результаты собственных исследований позволили заключить, что некоторые виды продуктов, в первую очередь изготовленные из молочного и растительного сырья, могут служить источником попадания в организм человека токсигенных B. cereus. Показано, что при отсутствии конкурирующей вегетативной микрофлоры повышается степень риска накопления токсинов, продуцируемых наиболее устойчивыми популяциями, в том числе спорообразующими токсигенными B. cereus. Апробированы и предложены для практического внедрения сухие питательные среды на основе сбалансированного состава ростовых и селективных компонентов, красителей и буферных смесей. Разработанные среды были использованы для выделения и идентификации B. cereus при проведении микробиологического контроля названных выше групп пищевых продуктов.

Ключевые слова:пищевые продукты, B. cereus, пищевое отравление, токсин

Вопр. питания. - 2012. - № 3. - С. 24-29.

В последние годы внимание исследователей все чаще привлекают пищевые отравления, вызванные B. cereus. Эти микроорганизмы относятся к группе аэробных споровых бактерий рода Bacillus, широкое распространение которых в окружающей среде является причиной их частого обнаружения в пищевых продуктах и клинических материалах. Пока не были разработаны критерии идентификации бактерий рода Bacillus, применялись и другие названия B. cereus: B. pseudoanthracis, B. anthracoides, B. subtilis. Поскольку морфологически B. cereus очень похожи на B. anthracis (высокопатогенный микроорганизм), некоторые авторы [7] с 1952 г. даже стали считать, что B. anthracis является патогенной разновидностью B. cereus.

В свете современных данных о характеристиках и таксономии рода Bacillus [8, 14] 6 морфологически близких видов (толстые - более 0,9 мкм - короткие палочки, формирующие центральные или терминальные эллипсоидные и цилиндрические споры) выделены в группу B. cereus (табл. 1).

В настоящее время со всей очевидностью установлено [6, 8], что B. cereus является распространенным этиологическим агентом 2 различающихся по клиническому течению типов пищевых отравлений (табл. 2). Для одного из них характерен синдром диарейного типа, включающий диарею, спазмы и боли в абдоминальной области спустя 8-16 ч после употребления контаминированной B. cereus пищи (мясные и овощные блюда, пасты, рыба и изделия из нее, молоко и молочные продукты, кондитерские изделия). В большинстве случаев при таких отравлениях удавалось обнаружить B. cereus в количестве 106-108 КОЕ/г продукта.

Другая нозологическая форма была названа синдромом рвотного типа (эметический синдром). В 1974 г. Mortimer и McCann [13] сообщили о нескольких вспышках желудочно-кишечных заболеваний, вызванных употреблением рисовых продуктов, обсемененных B. cereus. Отравление характеризуется очень коротким инкубационным периодом (1-6 ч), клиническая картина напоминает стафилококковые отравления: острое начало с тошнотой и рвотой, продолжительность заболевания менее 24 ч; диареи при этих отравлениях не наблюдалось. Количество микроорганизмов в вареном рисе и в фекалиях заболевших составляло 106-109 КОЕ/г. Предполагается, что условия хранения проваренного риса способствовали быстрому размножению микроорганизмов [19].

Интерес к B. cereus как этиологическому агенту других заболеваний с локализацией патологического процесса вне желудочно-кишечного тракта возник относительно недавно. Распознаванию патогенного потенциала B. cereus мешала тенденция рассматривать аэробные спорообразующие бактерии, найденные в клинических материалах, как лабораторные контаминанты. Среди наиболее тяжелых клинических проявлений инфекций, вызываемых B. cereus, в первую очередь отмечают пневмонии [5]. Характерной особенностью при этих заболеваниях является некротическое повреждение легочной паренхимы, в половине случаев заболевание приводило к летальному исходу. Отмечена способность B. cereus вызывать развитие остро протекающих деструктивных офтальмитов [20]. Наибольший удельный вес среди заболеваний с локализацией патологии вне желудочно-кишечного тракта приходится на инфекции послеоперационных или травматических ран [21].

Токсические свойства B. cereus обусловлены способностью микроорганизмов продуцировать ряд экстрацеллюлярных токсинов [3], из них в настоящее время наибольшее значение придается эметическому токсину цереулиду (табл. 3).

Статистические данные о вспышках пищевых отравлений, вызываемых споровыми аэробами группы B. cereus, представлены достаточно широко, однако они весьма противоречивы и во многом различаются, что связано с очень короткой продолжительностью течения заболеваний (менее 24 ч) и региональными особенностями частоты их регистрации. Тип заболеваний, вызываемых B. cereus, в разных странах существенно варьирует: например, в Японии эметический тип встречается в 10 раз чаще, чем диарейный [17, 18], в то же время в Европе и Северной Америке последний выявляется наиболее часто [11, 16]. Это в значительной степени связано с особенностями питания населения различных стран, хотя известна большая вспышка отравления эметического типа при употреблении молока, контаминированного B. cereus, в Японии [17]. Данные о частоте вспышек заболеваний, ассоциированных с B. cereus в структуре других пищевых отравлений, колеблются от 1 до 47%, а число случаев заболеваний - от 0,7 до 33%. Наиболее часто вспышки заболеваний регистрируются в Ирландии, Нидерландах и Норвегии (табл. 4).

Таблица 1. Критерии дифференциации видов микроорганизмов в составе группы B. сereus

Таблица 2. Характеристики 2 типов заболеваний, вызываемых B. cereus [7]

Таблица 3. Свойства эметического токсина [4, 9]

Таблица 4. Сведения о вспышках пищевых отравлений, вызванных B. cereus [8]

При расследовании вспышек пищевых отравлений и контроле продуктов на наличие микроорганизмов группы B. cereus традиционно применяются бактериологические методы посева на селективные агаровые среды и кровяной агар. Ведущими дифференциально-диагностическими признаками при этом являются лецитиназная активность, ферментация маннита и способность формировать окрашенные колонии, характерные для используемого в составе питательного субстрата красителя. Выявление токсинов B. cereus в продуктах и клиническом материале проводят серологическими методами или с помощью цитотоксических тестов на культурах клеток. Иммунологические методы недостаточно специфичны, поскольку позволяют выявлять только ряд энтеротоксинов B. cereus; в связи с тем, что многие из них представляют собой низкомолекулярные соединения, создание тест-систем трудоемко и неэффективно [3]. ПЦРанализ также не считается эффективным вследствие того, что гены, кодирующие экспрессию токсинов, стабильно присутствуют в хромосоме B. cereus, независимо от токсигенности штаммов. Для выявления токсинов наиболее приемлемо сочетание иммунологических коммерческих наборов с использованием культур эпителиальных клеток (Нер-2). Имеются сведения о клеточных моделях для воспроизведения цитотоксического действия B. cereus на линиях HEp-2 и Int-407 [15]. Энтеротоксигенные свойства B. cereus определяют также с использованием McCoy-клеток, в которых энтеротоксины вызывают прогрессирующую деструкцию клеточных монослоев [10]. В литературе практически отсутствуют данные об использовании доступных моделей животных для изучения токсичности B. cereus. Наличие диарогенного токсина и токсигенность штаммов наиболее часто определяют на изолированной петле кишечника кролика [12].

Нормирование спорообразующих микроорганизмов в растительных пищевых продуктах (муке, крупах, зерновых), вырабатываемых с применением жестких технологических приемов (тепловая сушка, экструдирование), обусловлено риском развития в них токсинообразующих штаммов B. cereus при отсутствии конкурирующих микроорганизмов, неустойчивых к применяемой термообработке.

В соответствии с действующими в Российской Федерации и странах Таможенного союза микробиологическими нормативами бактерии В. сеreus нормируются в продуктах для питания детей раннего возраста, в первую очередь в детских сухих молочных смесях и кашах, где их допустимое количество составляет 100−200 КОЕ в 1 г сухого продукта, что соответствует уровню бактерий (не более 10−20 КОЕ/г) в готовой к употреблению смеси (каше) после восстановления или термообработки. Действующие документы регламентируют отсутствие B. cereus в 0,1 г пищевых концентратов или наличие этих бактерий (в крупяных смесях экструзионной технологии) на уровне не более 10 КОЕ/г.

Собственные исследования по данной проблеме включали выявление бактерий группы B. cereus в сухом обезжиренном молоке, продуктах для питания детей раннего возраста, биологически активных добавках, пищевых концентратах и пастеризованных мясных консервах.

На этапе методической проработки эксперимента были предложены рецептуры сухих питательных сред для обнаружения B. cereus в количестве, соответствующем требованиям ГОСТ 10444.8-88 "Продукты пищевые. Метод определения Bacillus cereus" и МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, диетического, лечебного питания и их компонентов". Для промышленного изготовления был рекомендован оптимизированный способ производства питательной основы сухих сред и подобран сбалансированный состав ростовых и селективных компонентов, красителей и буферных смесей [1, 2]. В результате проведенных исследований были апробированы и предложены для практического внедрения следующие сухие питательные среды:

- солевой полимиксиновый агар с 2,3,5-трифенилтетразолиум хлоридом;

- среда Донована с хлоридом лития и полимиксином.

Рост B. cereus на среде Донована

На поверхности этих сред B. cereus формируют характерные колонии, легко дифференцируемые от других сапрофитных представителей Bacillus spp. (см. рисунок). Разработанные среды использовали для выделения и идентификации B. cereus при проведении микробиологического контроля названных выше групп пищевых продуктов. Полученные результаты представлены в табл. 5.

Результаты анализа 465 образцов детских сухих молочных смесей и каш свидетельствуют о контаминации их спорообразующими аэробными микроорганизмами В. сеreus на уровне 120±45 КОЕ/г при сравнительно невысокой распространенности положительных проб (4%). Чаще эти микроорганизмы удавалось выявить в пробах сухого обезжиренного молока и биологически активных добавок к пище (соответственно 11,1 и 5,2% исследованных образцов).

В целом представленные данные позволяют заключить, что некоторые виды неконсервированных пищевых продуктов, в первую очередь изготовленные из молочного и растительного сырья, могут служить источником попадания в организм человека токсигенных B. cereus. Факторами, способствующими накоплению токсичных метаболитов, могут являться некоторые технологические параметры производства и хранения продукции, создающие благоприятные условия для прорастания спор B. cereus, особенно при отсутствии конкурирующей вегетативной микрофлоры (пастеризации при щадящих температурных режимах, хранении при нерегулируемой температуре, высокой влажности и др.).

Совместное вегетирование B. cereus c другими условно-патогенными и патогенными микроорганизмами в различных видах пищевой продукции регистрируется довольно часто, в том числе при вспышках отравлений. Эта проблема заслуживает особого внимания, поскольку закономерности формирования смешанных микробных ассоциаций в продуктах изучены недостаточно и требуют более детальной проработки в плане исследования взаимовлияния токсигенных штаммов B. cereus, S. aureus, E. coli и др., а также возможности их развития в различных пищевых продуктах.

Таблица 5. Выявление B. cereus в пищевых продуктах

Литература

1. Ефимочкина Н.Р., Миргородский Б.Г., Карликанова С.Н. и др. // Мол. пром-сть. - 2006. - № 3. - С. 36-38.

2. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Карликанова С.Н. и др. // Там же. - 1999. - № 3. - С. 14-15.

3. Флуер Ф.С. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2006. - № 2. - С. 105-110.

4. Agata N., Ohta M., Mori M. et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 1995. - Vol .129. - P. 17-20.

5. Bekemeyer W.B., Zimmerman G.A. // Am. Rev. Respir. Des. - 1985. - Vol. 131, N 3. - P. 466-469.

6. Bottone E.J. // Clin. Microbiol. Rev. - 2010. - Vol. 23, N 2. - P. 3 8 2 - 3 9 7.

7. Granum P.E. Bacillus cereus // Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. - Washington, DC: ASM Press, 2001. - P. 373-381.

8. Granum P.E. Bacillus cereus // Foodborne Pathogens. Microbiology and Molecular Biology. - Caister: Academic Press, 2005. - P. 409-419.

9. Haggblom M.M., Apetroaie C., Andersson M.A. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - Vol. 68. - P. 2479-2484 .

10. Jackson S.G. // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol. 31. - P. 972-974.

11. Kramer J.M., Gilbert R.J. Bacillus cereus and other Bacillus species // Foodborne Bacterial Pathogens. - N.Y.: Marcel Dekker, 1989. - P. 21-70.

12. Kotiranta A., Lounatmaa K., Haapasalo M. // Microbes Infect. - 2000. - Vol. 2. - P. 189-198.

13. Mortimer P.R., McCann G.F. // Lancet. - 1974. - Vol. 1, N 7865. - P. 10 4 3 -10 4 5 .

14. Mukhopadhyay S., Akmal A., Stewart A.C. et al. // Mol. Cell. Proteomics. - 2009. - N 8. - P. 1174-1191.

15. Rowan N.J., Caldow G., Gemmel C.G. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69. - P. 2372-2376.

16. Schmidt K. (ed.). WHO Surveillance Programme for control of foodborne infections and intoxications in Europe // Sixth Report - FAO/WHO Collaborating Centre for Research and Training in Food Hygiene and Zoonosis. - Berlin, 1995.

17. Shinagawa K. // Bull. Int. Dairy Fed. - 1993. - Vol. 287. - P. 4 2 - 4 9 .

18. Shiota M., Saitou K., Mizumoto H. et al. // Pediatrics. - 2010. - Vol. 125, N 4. - P. 951-955.

19. Terranova W., Blake P.A. // N. Engl. J. Med. - 1978. - Vol. 298, N 3. - P. 143-144.

20. Turnbull P.C.B., French T.A., Dawsett E.G. // Br. Med. J. - 1997. - Vol. 1, N 77. - P. 1628-1629.

21. Turnbull P.C.B., Kramer S.M. // J. Clin. Pathol. - 1983. - Vol. 36, N 10. - P. 1091-1096.