Влияние пробиотического кисломолочного продукта на микробиоту толстой кишки, гематологические показатели и клеточный иммунитет крыс

РезюмеВ эксперименте на крысах Вистар изучено воздействие пробиотического кисломолочного продукта на общее состояние, микробиоту кишечника, гематологические показатели и иммунный статус животных. Установлено, что поступление в пищеварительный тракт в течение 3 нед штаммов Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B-379M, Lactobacillus acidophilus NK1 и Streptococcus thermophilus (в составе кисломолочного продукта) в суммарном количестве 2,1107 КОЕ/см3 оказывает положительное влияние на состояние микробиоты толстой кишки животных. Отмечено существенное повышение популяционных уровней бифидобактерий - резидентных представителей микробиоты толстой кишки, а также ферментативно активных энтеробактерий, установлена выраженная тенденция к повышению содержания лактобацилл. Положительные изменения в балансе микробиоты толстой кишки привели к уменьшению численности условно-патогенной транзиторной флоры с факторами патогенности. Мониторинг массы тела подопытных животных показал, что введение в рацион кисломолочного продукта с пробиотическими штаммами микроорганизмов благоприятно действует на усваивание корма. Пробиотические свойства продукта также обладают стимулирующим влиянием на иммунный статус крыс. Выявлено улучшение показателей клеточного иммунитета, выражающееся в повышении относительного количества Т-хелперов и иммунорегуляторного индекса, а также гематологических показателей (повышение средней концентрации гемоглобина в эритроците).

Ключевые слова:пробиотический кисломолочный продукт, микробиота толстой кишки, клеточный иммунитет

Вопр. питания. - 2012. - № 3. - С. 18-23.

В качестве пробиотических культур при производстве обогащенных кисломолочных продуктов используются различные штаммы бифидобактерий и молочнокислых бактерий, в основном являющихся представителями нормальной кишечной микробиоты человека. Однако присутствие в продукте видов микроорганизмов, относимых к пробиотическим, не гарантирует пробиотических свойств продукта. Одно из требований, выдвигаемых Всемирной организацией гастроэнтерологов к таким продуктам, гласит: "Заключение о пробиотическом эффекте определенных штаммов не должно автоматически переноситься на законченный коммерческий продукт" [13].

Достоверную оценку эффективности пробиотического продукта как в микроэкологическом аспекте, так и по воздействию на макроорганизм в целом обеспечивают клинические исследования у людей [1, 4-6, 8, 9, 11]. Как правило, таким исследованиям предшествуют доклинические эксперименты на лабораторных животных, позволяющие оценить переносимость продукта и направленность эффекта [2, 3, 7, 12, 14].

Целью настоящей работы была оценка пробиотического воздействия кисломолочного продукта, содержащего штаммы бифидобактерий и лактобацилл, признанных потенциально пробиотическими. Основными критериями оценки являлись состояние микробиоты толстой кишки, иммунологического статуса, гематологических показателей, а также мониторинг общего состояния здоровья животных на протяжении эксперимента. Изучение гематологических показателей и иммунного статуса целесообразно для подтверждения пробиотического действия изучаемых штаммов, так как известно, что одним из его аспектов является активация неспецифической резистентности макроорганизма [1, 9].

Материал и методы

В эксперименте были использованы крысы самцы Вистар с исходной массой тела 73-98 г. Крысы были распределены на 2 группы - по 10 животных в каждой. В течение 3 нед животные получали полноценный стандартный рацион вивария, воду - ad libitum. Животным опытной (1-й) группы индивидуально ежедневно per os вводили кисломолочный продукт, содержащий пробиотические штаммы бифидобактерий и лактобацилл (Lactobacillus acidophilus NK1, Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B-379M), а также Streptococcus thermophilus.

Образцы пробиотического продукта были изготовлены на опытно-экспериментальном заводе ГНУ ВНИМИ РАСХН (Москва). Во всех представленных образцах продукта Bifidobacterium находились в количестве 1,0Ч106 КОЕ/см3; Lactobacillus - 1,0Ч107 КОЕ/см3; Streptococcus thermophilus - 2,0Ч107 КОЕ/см3. Суммарное содержание молочнокислых и пробиотических бактерий составляло 3,0Ч107 КОЕ/см3 продукта. Объем вводимой порции составлял 1,5−2,0% от массы тела, что соответствовало суточному потреблению кисломолочных продуктов человеком. Животные группы сравнения (2-я группа) получали стерильное обезжиренное молоко в том же объеме.

В процессе исследования проводили мониторинг состояния животных (поедаемость корма, поведение, состояние шерстного покрова, наличие или отсутствие диареи). Массу тела контролировали с использованием электронных технических весов еженедельно и перед забоем. По окончании эксперимента животных умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом, отбирали кровь для иммунологических и гематологических исследований, выделяли слепую кишку и асептически отбирали ее содержимое для исследования микробиоты.

Видовой состав и уровни основных популяций микробиоты кишечника крыс определяли путем количественных посевов содержимого толстой кишки на селективные и дифференциальнодиагностические среды для выделения следующих групп микроорганизмов: бифидобактерий, лактобацилл, энтеробактерий, стафилококков, стрептококков, энтерококков [7].

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови выявляли методом прямого иммунофлюоресцентного окрашивания клеток крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флюоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, Beckman Coulter, США) и лизирующего (фиксирующего) набора реагентов "ImmunoPrep" (Beckman Coulter, США). В работе использованы следующие антитела: CD45RA (клон ОХ-33) - экспрессируется на В-лимфоцитах; CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах; CD4 (клон ОХ-38) - экспрессируется на Т-лимфоцитах-хелперах; CD8 (клон ОХ-38) - экспрессируется на цитотоксических Т-лимфоцитах; CD161а (клон 10/78) - экспрессируется на NK-клетках. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлюориметре FC-500 (Beckman Coulter, США). Популяцию лимфоцитов выделяли с помощью гетерогенного гейтирования (по параметрам бокового светорассеивания и экспрессии CD45-FITC).

Гематологические показатели крови (содержание эритроцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула) определяли на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (Beckman Coulter, США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ SPSS 11,5 для Windows. Математическая обработка данных эксперимента включала расчет средних значений со стандартными ошибками (М±m). Достоверность различий показателей между группами определяли в соответствии с t-критерием Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Животные опытной группы получали потенциально пробиотические штаммы Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B-379M - в количестве 1,0Ч106 КОЕ см3 в сутки; Lactobacillus acidophilus NK1 - 1,0Ч107 КОЕ см3 в сутки. Средние суммарные уровни пробиотических микроорганизмов в изучаемом продукте составляли 1,1Ч107 КОЕ/см3.

Наблюдения за животными в течение эксперимента свидетельствовали об отсутствии отклонений в состоянии здоровья и поведении крыс. Мониторинг массы тела подопытных животных показал, что введение в рацион исследуемого кисломолочного продукта положительно влияло на усвоение корма. У всех крыс отмечен прирост массы тела к концу эксперимента на 72-122% (табл. 1), однако достоверного отличия от прироста массы тела у животных группы сравнения не обнаружено (p>0,05).

Результаты изучения основных популяций микробиоты толстой кишки крыс представлены в табл. 2. В общей численности анаэробного и аэробного компонентов микробиоты различий между группами не отмечено, однако в опытной группе содержание бифидобактерий было достоверно выше, чем в группе сравнения.

Сравнительный анализ популяционных уровней лактобацилл, играющих важную роль в кишечной микробиоте крыс (в частности в подавленииусловно-патогенных цитратположительных энтеробактерий и кокковых форм), показал повышение среднего содержания лактобацилл на порядок у животных, получавших исследуемый кисломолочный продукт с потенциально пробиотическими микроорганизмами. Аналогичные данные получены и в отношении энтерококков.

Как следует из полученных результатов, введение опытного продукта существенно повлияло на уровни энтеробактерий с нормальной ферментативной активностью, активных антагонистов в отношении бактерий, обладающих факторами патогенности. Результаты изучения транзиторных популяций микрофлоры толстой кишки крыс представлены в табл. 3. Существенного воздействия используемого нами опытного кисломолочного продукта на среднее содержание популяций условно-патогенных представителей микробиоты не обнаружено, однако отмечено значительное различие частоты встречаемости гемолитических стрептококков: в опытной группе - 60%, в группе сравнения - 90%, и цитратассимилирующих энтеробактерий - соответственно 30 и 80%.

Таблица 1. Масса тела крыс (в г) в разные сроки эксперимента

Таблица 2. Содержание основных популяций микробиоты толстой кишки крыс после включения в рацион исследуемого кисломолочного продукта (в КОЕ, см3)

Таблица 3. Содержание условно-патогенных популяций микробиоты толстой кишки крыс после включения в их рацион исследуемого кисломолочного продукта (в КОЕ, см3)

Таким образом, в результате микроэкологических исследований установлено положительное влияние продукта, содержащего пробиотические штаммы бифидобактерий и лактобацилл, на состояние микробиоты толстой кишки. Статистически достоверное превышение среднего содержания бифидобактерий и энтеробактерий с нормальной ферментативной активностью, а также выраженная тенденция к повышению среднего уровня лактобацилл в сочетании со значительно более низкой численностью условно-патогенной транзиторной флоры у животных, получавших продукт с пробиотическими микроорганизмами, подтвердило ингибирующее воздействие резидентных групп микроорганизмов и представителей сопутствующей микрофлоры на бактерии с факторами патогенности, что согласуется с данными других авторов [1, 4, 9].

Результаты иммунологических исследований представлены в табл. 4. Как видно из табл. 4, у животных 1-й группы обнаружено статистически достоверное превышение относительного количества Т-хелперов и иммунорегуляторного индекса. Таким образом, использование в эксперименте исследуемого кисломолочного продукта, приготовленного на основе бифидобактерий и лактобацилл, оказало стимулирующее влияние на клеточный иммунитет.

Результаты гематологических исследований параметров крови представлены в табл. 5, 6. Данные табл. 5 характеризуют состояние эритроцитов у экспериментальных животных. Видно, что исследованные гематологические показатели находились в пределах физиологической нормы для крыс [13, 15]. У животных опытной группы обнаружено статистически достоверное повышение средней концентрации гемоглобина в эритроците. Представленные в табл. 8 данные, характеризующие состояние лейкоцитов у крыс, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверной разницы показателей в 1-й и во 2-й группах.

Таблица 4. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови крыс опытной группы и группы сравнения (М±m, p)

Таблица 5. Средние гематологические показатели, характеризующие состояние эритроцитов крыс

Таблица 6. Средние гематологические показатели, характеризующие состояние лейкоцитов у крыс

Таким образом, проведенные исследования показали, что потребление в течение 21 дня кисломолочного продукта с пробиотическими штаммами Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B379M в смеси с Lactobacillus acidophilus NK1 и Streptococcus thermophilus (при содержании в суточной порции 1,0Ч106 КОЕ живых бифидобактерий и 1,0Ч107 КОЕ живых лактобацилл) положительно влияет на состояние микробиоты толстой кишки, клеточный иммунитет и гематологические показатели животных. Применение молекулярно-генетических методов подтвердило ведущую функциональную роль бифидобактерий в сложном многовидовом сообществе микроорганизмов, которым является микробиота кишечника. При этом доказана высокая степень генетической адаптации этих бактерий к толстой кишке - экологической нише бифидобактерий в макроорганизме [1, 15].

Достоверное превышение популяционных уровней бифидобактерий, ферментативно активных энтеробактерий и лактобацилл (микроорганизмов, обладающих антагонизмом в отношении условно-патогенным микроорганизмов) на фоне выявленного нами низкого потенциала патогенности свидетельствует о пробиотических свойствах исследованного кисломолочного продукта. Последние подтверждены стимулирующим влиянием на клеточный иммунитет и повышением средней концентрации гемоглобина в эритроците.

Данная работа выполнена в рамках государственного контракта № 02.522.12.2009 "Разработка технологий универсального быстропереориентируемого производства заквасок прямого внесения для биотехнологической промышленности" Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2007-2012 гг.".

Литература

1. Амерханова А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности: Автореф. дис. - д-ра биол. наук. - М., 2009. - 42 с.

2. Байгарин Е.К., Жминченко В.М., Зилова И.С. и др. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 3. - С. 33-37.

3. Батищева С.Ю., Поздняков А.Л., Кузнецова Г.Г. и др. // Там же. - 2002. - Т. 72, № 4. - С. 44-46.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин: Автореф. дис. - д-ра биол. наук. - М., 1982. - 48 с.

5. Кафарская Л.И., Инжеваткина С.М., Володин Н.Н. и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2005. - Т. 3, № 1. - С. 72-95.

6. Конь И.Я. // Леч. врач. - 2007. - № 1. - С. 21-25.

7. Кузнецова Г.Г., Трушина Э.Н., Мустафина О.К. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 31-37.

8. Теплов В.И. Функциональные продукты питания. - М.: А-Приор, 2008. - 240 с.

9. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г. Батищева С.Ю. и др. Функциональная эффективность различных кисломолочных и пробиотических продуктов // Материалы междунар. конф. "Пробиотики, пребиотики и синбиотики и функциональные вопросы питания. Современное состояние и перспективы". - М., 2004. - С. 11-12.

10. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Медицина, 1998. -288 с.

11. Callaway T.R., Edrington T.S., Anderson R.C. et al. // Anim. Health Res. Rev. - 2008. - Vol. 9, N 2. - P. 217-225.

12. Lewi P. J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. - Amsterdam: Elsevier, 1981. - 381 p.

13. Probiotics and prebiotics. Practice Guideline World Gastroenterology Organisation. May 2008. - P. 127 / http://www.worldgastroenterology.org/probiotics-prebiotics.html.

14. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. - Burlington, USA: Elsevier Academic Press, 2006. - 912 p.

15. Venture M., Canchaya C., Fitzgerald G.F. et al. // J. Antonie Van Leeuwenhoek. - 2007. - Vol. 91. - P. 351-372.