Влияние поливитаминной недостаточности на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени крыс

РезюмеАктивность ферментов метаболизма ксенобиотиков изучали в печени крыс самцов Вистар, получавших в течение 4 нед полусинтетический рацион, адекватный по содержанию витаминов (контроль), или рационы, содержащие 50 и 20% от количества витаминов в контроле. Полученные результаты показали, что умеренный дефицит витаминов (50%) вызывает небольшое возрастание (по сравнению с контролем) активности ЭРОД - на 13%, МРОД - на 34% (р<0,05), 4-нитрофенолгидроксилазы - на 16%, 6β-тестостеронгидроксилазы - на 17%, UDP-глюкуронозилтрансферазы - на 26% (р<0,05) и хинонредуктазы - на 55% (р<0,05). Глубокий дефицит витаминов (20%) приводил к снижению в печени активности МРОД до 78% от контрольного уровня (р<0,05), 4-нитрофенолгидроксилазы - до 74% (р<0,05), гемоксигеназы-1 - до 83% (р<0,05) и хинонредуктазы - до 60% (р<0,05). При этом активность UDP-глюкуронозилтрансферазы была выше контроля на 22%, а активность ЭРОД, ПРОД, 6β-тестостеронгидроксилазы и общая активность глутатионтрансферазы не отличались от таковой в контроле. Обнаружено, что при глубоком полигиповитаминозе экспрессия мРНК CYP1A1 и AhR существенно не изменяется, в то время как экспрессия мРНК CYP1A2 и CYP3A1 снижается соответственно до 62 и 79%.

Ключевые слова:ферменты метаболизма ксенобиотиков, экспрессия генов ферментов метаболизма ксенобиотиков, поливитаминная недостаточность

Вопр. питания. - 2012. - № 2. - С. 28-33.

Ферменты метаболизма ксенобиотиков (ФМК) представляют основную линию защиты клетки от повреждающего действия многочисленных токсических факторов окружающей среды и окислительного стресса, что определяет актуальность изучения механизмов регуляции их активности.

ФМК I фазы включают суперсемейство цитохромов Р450, среди которых наиболее изучены цитохромы подсемейства 1А (CYP1A1 и CYP1A2) - их основная функция - биотрансформация ксенобиотиков и небольшого числа лекарственных средств, а также цитохромы подсемейства CYP3A, отвечающие за метаболизм более чем 50% используемых лекарственных средств. ФМК II фазы (ключевые среди них - UDP-глюкуронозилтрансферазы (UGT) и глутатионтрансферазы) обеспечивают инактивацию и выведение продуктов окисления эндогенных и чужеродных соединений. Большинство из них обладают и антиоксидантной активностью - глутатионтрансферазы, хинонредуктаза, гемоксигеназа-1.

Накапливаются экспериментальные данные, позволяющие рассматривать витамины (преимущественно жирорастворимые) как важный алиментарный фактор, участвующий в регуляции активности ФМК. Так, дефицит витамина Е в рационе приводит к уменьшению общего содержания цитохрома Р450 и снижению пентоксирезоруфиндеалкилазной (ПРОД) активности CYP2B1/2 и активности глутатионтрансферазы в печени крыс [9]. Дополнительное включение в рацион витамина Е стимулирует экспрессию генов CYP2B и CYP3A у крыс [19] и Cyp3a11 и глутатионтрансферазы - у мышей [18].

Недостаточность витамина А в эксперименте на крысах оказывала существенное влияние на активность ФМК и баланс между активностью ферментов I и II фазы [12, 15]. При длительном (в течение 10 нед) дефиците витамина А в печени крыс уменьшалось общее содержание цитохрома Р450 и снижалась активность CYP1A1, CYP2B1 и UDP-глюкуронозилтрансферазы, но возрастала активность глутатионтрансферазы. С использованием различных подходов было убедительно доказано [23], что ретиноиды индуцируют активность и экспрессию мРНК CYP3A в клетках печени и тонкой кишки.

Есть основания полагать, что влияние витаминов Е и А на активность ФМК связано с их участием в регуляции рецептор-опосредованных сигнальных путей.

В экспериментах на клеточных культурах установлено, что витамины Е и А способны активировать транскрипционные факторы PXR (прегнановый Х-рецептор) и CAR (конститутивный андростановый рецептор), регулирующие экспрессию генов CYP3A, CYP2B1 и ряда изоформ UGT и глутатионтрансферазы [10, 21]. Особого внимания заслуживают данные о способности витамина Е индуцировать in vitro экспрессию гена фактора Nrf2, главного регулятора активности большинства антиоксидантных ферментов и ФМК II фазы на транскрипционном уровне [11, 14].

Согласно данным [2], недостаток витаминов группы В у взрослого населения РФ в последние годы встречается значительно чаще, чем других витаминов. В эксперименте дефицит витамина В1 приводил к парадоксальной реакции ФМК - в печени крыс обнаруживали возрастание активности CYP2E1 (анилингидроксилазы), CYP3A (этилморфин-N-деметилазы) и глутатионтрансферазы [22, 24]. В то же время, согласно более ранним сообщениям [4], недостаточность витамина В1 вызывала у крыс уменьшение общего содержания цитохрома Р450 в печени и снижение скорости гидроксилирования аминопирина (CYP2B1/2), этилморфина (CYP3A) и анилина (CYP2E1).

Результаты мониторинга обеспеченности витаминами населения РФ за период с 1987 по 2009 г. показали, что имеющаяся недостаточность витаминов носит характер полигиповитаминоза [2]. С учетом сказанного целью настоящей работы было изучение влияния поливитаминной недостаточности на активность ФМК в печени крыс. Работа проводилась совместно с лабораторией витаминов и минеральных веществ ФГБУ "НИИ питания" РАМН (заведующая лабораторией - доктор биологических наук В.М. Коденцова).

Материал и методы

Исследования проводили на 3 группах крыс самцов Вистар (по 8-9 животных в каждой) с исходной массой тела 70-80 г. Животные получали полусинтетический рацион, содержащий 20% казеина, 66,4% кукурузного крахмала, 9% жира (подсолнечное масло + лярд, 1:1), 3,5% солевой смеси. В рацион крыс контрольной группы добавляли 0,1% смеси водорастворимых витаминов и викасола, 0,9% смеси жирорастворимых витаминов (D,L-α-токоферола ацетата, холекальциферола и пальмитата ретинола) в подсолнечном масле [1]. Дефицит витаминов у крыс опытных групп вызывали уменьшением в 2 или 5 раз количества добавляемых в корм витаминных смесей. Животным 1-й опытной группы в корм добавляли смесь витаминов в количестве 50% от их уровня в рационе контрольной группы, животным 2-й опытной группы - 20% от контроля. Корм крысы получали ad libitum - в среднем 16,5 г сухой смеси в сут [1]. Длительность эксперимента составила 4 нед. Наблюдение за состоянием животных и поедаемостью корма проводили ежедневно, массу тела определяли еженедельно.

За 20 ч до окончания эксперимента крыс лишали корма. В микросомах, выделенных из печени, определяли активность ФМК I фазы - этоксирезоруфиндеалкилазную (ЭРОД) активность CYP1A1, метоксирезоруфиндеалкилазную (МРОД) активность CYP1A2, пентоксирезоруфиндеалкилазную (ПРОД) активность CYP2B1/2, 4-нитрофенолгидроксилазную активность CYP2E1 и 6β-тестостеронгидроксилазную (6β-ТГ) активность CYP3A [8, 20]. Кроме того, определяли активность ключевых ферментов II фазы: в микросомах - UDP-глюкуронозилтрансферазы с п-нитрофенилом в качестве субстрата-маркера UGT1А6 [7] и гемоксигеназы-1 [16], в цитозоле - общую активность глутатионтрансферазы с субстратом 1-хлор2,4-динитробензолом [13] и хинонредуктазы [5].

Экспрессию мРНК CYP1A1, CYP1A2, CYP3A и транскрипционного фактора AhR оценивали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для выделения мРНК использовали TRI-реагент ("Sigma", США) согласно протоколу, рекомендуемому фирмойпроизводителем. Концентрацию тотальной РНК определяли, измеряя оптическую плотность при длине волны 260 нм. Для получения кДНК проводили реакцию ОТ с синтетическими гексануклеотидами, для чего использовали 4 мкг тотальной РНК. Реакцию проводили при 37 °С в течение 1 ч, выдерживали 10 с при 94 °С для инактивации фермента. Полученную кДНК использовали для ПЦР. В реакции ОТ в качестве контроля использовали воду вместо РНК. Реакцию ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: денатурация при 94 °С в течение 1 мин; отжиг праймеров при 60 °С, 10 с (60 °С, 30 с для гена CYP1A2, 62 °С, 10 с для гена CYP1A1); синтез продукта при 72 °С, 10 с; выдержка - 3 мин после прохождения циклов при 72 °С. Количество циклов варьировали в пределах 22-30 в зависимости от изучаемого гена. В качестве контроля использовали РНК вместо кДНК. В ОТ-ПЦР использовали следующие ферменты: обратную транскриптазу, M-MuLV и Taq-SE-ДНК-полимеразу ("Сибэнзим", Россия). Гексануклеотиды и праймеры были синтезированы фирмой "Литех" (Россия). Реакцию ОТ и реакции амплификации проводили на приборе "Терцик" (Россия). Последовательности используемых праймеров и размеры образующихся амплифицированных фрагментов указаны в таб. 1.

Продукты ОТ-ПЦР разделяли стандартным электрофоретическим методом при напряжении 180 В в 2,5% агарозном геле, электрофореграммы денсиметрировали. При анализе гелей использовали программу Quantity One, версия 4.5.

Для определения влияния дефицита витаминов на резистентность к ПОЛ микросом печени ex vivo в выделенных микросомах определяли скорость индуцированного NADPH-Fe2+ ПОЛ [3].

Антиоксидантный статус крыс оценивали по общей антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови и фракции цитозоля печени, используя тестсистему FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) [6].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.

Таблица 1. Используемые праймеры и размеры образующихся амплифицированных фрагментов

Результаты и обсуждение

Содержание крыс в течение 4 нед на рационе с пониженным на 50% содержанием витаминов приводило к развитию у них умеренного дефицита витаминов, при котором не обнаруживали изменений уровня витаминов в плазме крови, и отмечалась тенденция к снижению их содержания в печени [1]. Как видно из данных, представленных в табл. 2 и 3, в печени крыс с умеренным дефицитом витаминов (1-я опытная группа) активность ряда ФМК умеренно возрастала (по сравнению с контролем): ЭРОД - на 13%, МРОД - на 34% (р<0,05), 4-нитрофенолгидроксилазы - на 16%, 6β-ТГ - на 17%, UDP-глюкуронозилтрансферазы - на 26% (р<0,05), активность хинонредуктазы - на 55% (р<0,05). В этих условиях активность ПРОД, глутатионтрансферазы и гемоксигеназы-1 не отличалась от уровня в контрольной группе.

У крыс, получавших рацион с содержанием витаминов в 5 раз меньше, чем в контрольной группе, был установлен глубокий дефицит водо- и жирорастворимых витаминов [1]. Состояние полигиповитаминоза у крыс 2-й группы приводило к существенному и статистически достоверному (р<0,05) снижению в печени активности МРОД (78% от контрольного уровня), 4-нитрофенолгидроксилазы (74% от контроля), гемоксигеназы-1 (83% от контроля) и хинонредуктазы (60% от контрольного уровня) (табл. 2 и 3). Активность UDP-глюкуронозилтрансферазы независимо от степени витаминной недостаточности оставалась выше контрольного уровня (на 22%). Активность остальных изученных ферментов - ЭРОД, ПРОД, 6β-ТГ, глутатионтрансферазы - не отличалась от таковой в контрольной группе.

Таблица 2. Активность цитохромов Р450 в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов (M±m)

Таблица 3. Активность ФМК II фазы в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов (M±m)

При определении экспрессии генов отдельных изоформ цитохрома Р450 было установлено, что в печени крыс с умеренным дефицитом витаминов (1-я опытная группа) имеются лишь тенденция к увеличению экспрессии мРНК CYP1A1 и несущественное уменьшение экспрессии мРНК CYP1A2, CYP3A1 и AhR (см. рисунок). При глубоком дефиците витаминов (2-я опытная группа) экспрессия мРНК CYP1A1 и мРНК AhR в печени крыс не отличалась от контрольного уровня, в то время как экспрессия мРНК CYP1A2 и CYP3A1 была понижена, соответственно, до 62 и 79% от уровня в контроле.

Не обнаружено существенного влияния разной обеспеченности рационов витаминами на устойчивость микросом, выделенных из печени крыс, к NADPH-Fe2+-индуцированному ПОЛ. Скорость ПОЛ, оцениваемая по образованию МДА, составила для крыс контрольной, 1-й и 2-й опытных групп соответственно 10,3±0,9; 11,9±0,8 и 8,1±0,7 нмоль/мг белка за 10 мин.

Определение АОА как одного из интегральных показателей антиоксидантного статуса выявило небольшое, статистически достоверное снижение у крыс 1-й и 2-й опытных групп АОА плазмы крови соответственно на 10 и 12% и АОА фракции цитозоля печени - на 8 и 7%, соответственно (табл. 4).

Таким образом, проведенные исследования показали, что в разной степени пониженное содержание витаминов в рационе крыс и развитие разной глубины полигиповитаминоза оказывают различное по характеру влияние на активность ФМК. При умеренном полигиповитаминозе активность изученных ФМК не отличалась от контрольного уровня (ПРОД, глутатионтрансфераза, гемоксигеназа-1) или умеренно возрастала (МРОД, 4-нитрофенолгидрокслаза, UDP-глюкуронозилтрансфераза, хинонредуктаза). Результаты изучения экспрессии мРНК CYP1A1 и CYP1A2 свидетельствуют о том, что возрастание их активности не связано с изменением экспрессии их генов или гена AhR - главного и, может быть, единственного регулятора активности CYP1A1 и CYP1A2 на уровне транскрипции.

Относительный уровень мРНК CYP1A1 (а), CYP1A2 (б), CYP3A1 (в) и AhR (г) в печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов

К - контрольная группа.

Таблица 4. Антиоксидантная активность плазмы крови и печени крыс, получавших рационы с разным содержанием витаминов (M±m)

Более глубокая форма полигиповитаминоза у крыс, в отличие от умеренной, сопровождалась снижением активности МРОД (CYP1A2), 4-нитрофенолгидроксилазы (CYP2E1), гемоксигеназы-1 и хинонредуктазы. При этом снижение активности МРОД (78% от контрольного уровня) коррелировало с подавлением экспрессии мРНК CYP1A2 (62% от контроля), но не зависело от изменения экспрессии гена AhR (96% от контроля). Обращает на себя внимание снижение экспрессии CYP3A1 (79% от контроля), хотя не обнаружено изменений его 6β-ТГ-активности. Важно отметить, что CYP3A4 (гомолог CYP3A1 у крыс) и CYP1A2 входят в число основных цитохромов Р450, осуществляющих метаболизм лекарственных средств, и изменение их активности может приводить к изменению фармакокинетики и конечного эффекта лекарственных средств [17].

Как уже отмечалось, в экспериментах in vitro витамин Е индуцировал экспрессию гена транскрипционного фактора Nrf2 и генов регулируемых им ферментов [11, 14]. Это позволяет предположить, что уменьшение почти вдвое содержания витамина Е в печени крыс с глубоким полигиповитаминозом [1] может быть одной из причин снижения у них Nrf2-регулируемой активности гемоксигеназы-1 и хинонредуктазы.

В то же время, несмотря на значительное снижение уровня витамина Е, являющегося главным липофильным антиоксидантом клетки, от которого в значительной мере зависят стабильность и чувствительность мембран к ПОЛ, нами не обнаружено снижения резистентности микросомальных мембран к индуцированному ПОЛ. Кроме того, независимо от резкого уменьшения содержания витаминов-антиоксидантов в печени крыс 2-й опытной группы [1], у них не наблюдали выраженных проявлений окислительного стресса. Это позволяет предположить, что обнаруженное у крыс с глубоким полигиповитаминозом снижение активности ФМК (большинство из которых - мембраносвязанные ферменты) не является результатом изменения свойств микросомальных мембран или усиления процессов ПОЛ, а связано с нарушением регуляции синтеза ферментов.

В заключение следует отметить, что впервые получены экспериментальные данные о влиянии поливитаминной недостаточности на активность ФМК, показавшие, что непродолжительный, но глубокий полигиповитаминоз у крыс приводит к снижению активности и(или) экспрессии генов отдельных ФМК, играющих важную роль в процессах детоксикации, метаболизма лекарственных средств и антиоксидантной защиты.

Литература

1. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Бекетова Н.А. и др. // Вопр. питания. - 2011. - № 4. - С. 56-61.

2. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Спиричев В.Б. // Вопр. питания. - 2010. - № 3. - С. 68-72.

3. Кравченко Л.В., Морозов С.В., Тутельян В.А. // Бюл. экспер. биол. - 2003. - № 12. - С. 648-652.

4. Сушко Л.И., Лукиенко П.И. // Фармакол. и токсикол. - 1981. - № 1. - С. 102-104.

5. Benson A., Hunkeler M. J., Talalay P. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1980. - Vol. 77. - P. 5216-5220.

6. Benzie I.F.F., Strain J.J. // Anal. Biochem. - 1996. - Vol. 239. - P. 7 0 - 7 6 .

7. Burchell B., Weatherill P. // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 77. - P. 169-177.

8. Burke M.D., Mayer R.T. // Chem. Biol. Interact. - 1983. - Vol. 45. - Р. 243-258.

9. Chen H.W., Lii C.K., Sung W.C. et al. // Nutr. Cancer. - 1998. - Vol. 31. - P. 178-183.

10. Chen S., Wang K., Wan Y.J. // Biochem. Pharmacol. - 2010. - Vol. 79. - P. 270-276.

11. Feng Z., Liu Z., Li X. et al. // J. Nutr. Biochem. - 2010. - Vol. 21. - P. 1222-1231.

12. Gupta P.H., Mehta S., Mehta S.K. // Biochem. Int. - 1989. - Vol. 19. - P. 123-133.

13. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249. - P. 7140-7150.

14. Hsieh T.C., Elangovan S., Wu J.M. // Anticancer Res. - 2010. - Vol. 30. - P. 4169-4176.

15. Martini R., Butler A.M., Jiang X.M., Murray M. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1995. - Vol. 273. - P. 427-434.

16. McNally S.J., Ross J.A., Garden O.J., Wigmore S.J. // Anal. Biochem. - 2004. - Vol. 332. - P. 398-400.

17. Michalets E.L. // Pharmacotherapy. - 1998. - Vol. 18. - P. 8 4 -112 .

18. Mustacich D.J., Gohil K., Bruno R.S. et al. // J. Nutr. Biochem. - 2009. - Vol. 20. - P. 469-476.

19. Mustacich D.J., Leonard S.W., Devereaux M.W. et al. // Free Radic. Biol. Med. - 2006. - Vol. 41. - P. 1069-1078.

20. Nakajima M., Nakamura S., Tokudome S. et al. // Drug Metab. Dispos. - 1999. - Vol. 27. - Р. 1381-1391.

21. Rьhl R., Sczech R., Landes N. et al. // Eur. J. Nutr. - 2004. - Vol. 43. - P. 336-343.

22. Wade A.E., Evans J.S., Holmes D., Baker M.T. // Drug Nutr. Interact. - 1983. - Vol. 2. - P. 117-130.

23. Wang K., Chen S., Xie W., Wan Y.J. // Biochem. Pharmacol. - 2008. - Vol. 75. - P. 2204-2213.

24. Yoo J.S., Park H.S., Ning S.M. et al. // Biochem. Pharmacol. - 1990. - Vol. 39. - P. 519-525.