Влияние наночастиц диоксида титана на белковый профиль микросом печени крыс

РезюмеС использованием методов протеомики изучено влияние поступления в желудочно-кишечный тракт наночастиц (НЧ) диоксида титана в кристаллической форме анатазы на состав белков микросом печени крыс. Животные получали водную дисперсию НЧ в дозе от 0,1 до 10 мг/кг массы тела внутрижелудочно через зонд ежедневно на протяжении 28 дней. Микросомальную фракцию выделяли из печени методом дифференциального центрифугирования. Состав белков микросом анализировали методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Идентификацию белковых пятен осуществляли с использованием MALDI-TOF масс-спектрального анализа. Установлено, что под воздействием НЧ диоксида титана независимо от использованных доз во всех группах животных на электрофореграммах появлялись 53 новых белковых пятна и исчезали 19 белковых пятен по сравнению с контролем. Дополнительно в группах животных, получавших высокие дозы НЧ, отмечено появление 25 новых белковых пятен при исчезновении 3 белковых пятен по сравнению с контрольной группой и с животными, получавшими низкую дозу НЧ. Масс-спектральный анализ позволил выявить среди белков, экспрессируемых под воздействием НЧ в микросомах печени животных, ряд форм полипептидов, присутствующих в международной базе данных. Один из идентифицированных доминантных пиков был представлен изоформой Мu 2 фермента глутатионS-трансферазы (М=41,55 кД; pI=8,0). Сделан вывод о перспективности использования методов протеомики при оценке воздействия искусственных НЧ на биосинтетические процессы в организме.

Ключевые слова:диоксид титана, наночастицы, крысы, токсичность, двумерный электрофорез

Вопр. питания. - 2012. - № 2. - С. 18-22.

При производстве пищевых продуктов могут использоваться вещества, содержащие наночастицы (НЧ) различных химических элементов, в том числе диоксид титана (TiО2). Известно, что обычный диоксид титана с частичами микронного размера длительное время применяется в качестве разрешенной пищевой добавки Е171 (красителя) [11], а также, кроме изготовления упаковочного материала, он используется при производстве косметических средств и медицинских препаратов. Вопрос о безопасности применения для этих целей наноразмерной дисперсии TiO2 изучен недостаточно.

Согласно данным ряда работ, НЧ TiO2 оказывают повреждающее воздействие в культуре как малигнизированных [7], так и неизмененных [9] клеток. Механизм цитотоксического действия НЧ TiO2 связывают с процессами образования реактивных форм кислорода, оказывающих повреждающее действие на ДНК и запускающих процессы митохондриального апоптоза [7]. Токсичность НЧ TiO2 для лабораторных животных выявлена при поступлении этого вещества в организм через респираторный [5] и желудочно-кишечный [2, 4] тракт. Ввиду высокой адсорбционной способности данного вида НЧ они могут усиливать проникновение в клетки традиционных химических токсикантов, таких как ДДТ [10].

При оценке возможных токсических воздействий НЧ на организм большое значение имеют подходы, позволяющие установить эффект в отношении экспрессии генов и синтеза белков. В частности, это метод двумерного (2D) электрофореза, который используется как один из компонентов системы протеомного анализа. Так, в работе [6], выполненной на лейкемических клетках человека, с использованием этого метода было показано изменение до 37 белковых фракций (пятен) под действием препарата многостенных углеродных нанотрубок. Идентификация белков методом массспектрометрии показала наличие белков теплового шока b1, нейтральной α-глюкозидазы АВ и белка системы репарации ДНК Msh2. При воздействии НЧ диоксида кремния на клетки НаСаТ выявлено до 16 белков, изменяющихся в протеомном профиле, включая стресс-ассоциированные белки, ферменты энергетического обмена, факторы апоптоза и продукты экспрессии онкогенов [13]. В то же время не выявлено существенных изменений в протеоме клеток под воздействием НЧ гидроксилапатита [12].

Задачей настоящего исследования стало изучение возможных изменений протеомного профиля микросом гепатоцитов крыс, получающих внутрижелудочно НЧ TiO2 в кристаллической модификации анатазы (далее - анатаза).

Материал и методы

В работе использовали препарат НЧ анатазы производства "Sigma-Aldrich" (Германия-США). Согласно данным исследований, проведенных методом электронной микроскопии на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, препарат состоял из частично агрегированных частиц округлой формы со средним размером 20-30 нм. Образец представлял собой легкий порошок белого цвета, негигроскопичный, склонный к пылеобразованию, при смешении с водой дающий стойкую суспензию молочнобелого цвета.

В основу дизайна эксперимента положены МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов" [3].

Исследование проведено на 24 белых крысах самцах Вистар с исходной массой тела 108±2 г (M±m), полученных из питомника РАМН "Столбовая".

Мастер-гель микросомальных белков печени крыс

Отмечено положение пятна изоформы Mu 2 глутатион-Sтрансферазы (молекулярная масса 41,55 кД; pI=8,0), появляющейся на электрофореграммах при дозе наночастиц диоксида титана 0,1 мг/кг массы тела и более.

Крыс содержали в клетках по 3 животных и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом [3]. Животные были разделены на 4 группы по 6 крыс. Крысам 1-й (контрольной) группы внутрижелудочно вводили деионизированную воду.

Животным 2-й, 3-й и 4-й опытных групп вводили НЧ анатазы в виде суспензии в дистиллированной воде с концентрацией соответственно 0,1; 1,0 и 10 мг/кг массы тела в день. За 12 ч до умерщвления (путем декапитации под мягким эфирным наркозом) у животных отбирали весь корм. Умерщвление животных осуществляли на 29-й день эксперимента. На вскрытии брали печень и подвергали ее гомогенизации для получения микросомальной фракции. Гомогенизацию печени проводили в 0,1 М ТрисНСl в буфере рН 7,4, охлажденном до 0 - +2 °С при соотношении массы и объема 1:4. Полученные гомогенаты печени фракционировали методом дифференциального центрифугирования c получением микросомальной и цитозольной фракций.

Белковый состав микросомальной фракции анализировали с помощью двумерного электрофореза. 1-е направление (изоэлектрофокусирование в амфолинах) осуществляли в стеклянных трубочках с 4% полиакриламидным гелем (ПААГ) в градиенте рН 3-10 до достижения потенциала 900 В. Во 2-м направлении разделение осуществляли в 12% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия [1]. Электрофорез проводили при последовательном токе 20 и 40 мА на одно стекло; окрашивали серебром с использованием наборов "Bio-Rad". Изображения протеомных карт получали с помощью денситометра GS-800.

Обработку изображений гелей проводили по программе PDQuest. Каждое пятно на изображении геля соответствовало отдельному белку с характерной для него молекулярной массой и изоэлектрической точкой. Все изображения гелей сравнивали между собой наложением. По результатам сравнения 24 электрофореграмм микросом печени крыс составлен мастер-гель, состоящий из 360 белковых пятен, из которых 9 пятен представляли собой стандарты молекулярных масс белков (см. рисунок). На мастер-гель наносили только те белковые пятна, которые выявлялись как минимум на 3 электрофореграммах, принадлежащих к одной из групп (с 1-й по 4-й).

Идентификацию пятен белков проводили с помощью масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов, экстрагированных из гелей, белков на времяпролетном масс-спектрометре с использованием технологии MALDI (лазерная десорбция-ионизация на матрице) [8]. Для анализа выбирали наиболее яркие белковые пятна, которые появлялись или исчезали при воздействии НЧ. Идентификацию белков выполняли с помощью программного обеспечения MASCOT (www.matrixscience.com); спектры анализируемых белков сравнивали с NCBInrбазой данных (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Таблица 1. Характеристики протеома микросом печени крыс 1-4-й групп

Результаты

В результате исследования установлено следующее: у животных 1-й группы в микросомальной фракции печени обнаружено 181 белковое пятно, 2-й группы - 210, 3-й группы - 238, 4-й - 236 белковых пятен (табл. 1). У животных всех экспериментальных групп (2-4-я) в микросомах печени суммарно выявлено 111 белковых пятен, которых не было в контрольной группе. При этом 53 пятна были характерными для всех экспериментальных групп животных независимо от дозы введенных в организм НЧ TiO2. У животных 2-й группы дополнительно определено 15 белковых пятен, выявляемых только у животных этой группы, в 3-й - 26, в 4-й - 17 белковых пятен. Указанные белки имели молекулярную массу в диапазоне от 16,34 до 111,36 кДа.

В ходе исследования протеомного профиля микросом печени крыс не только появлялись новые белковые пятна, но и исчезали присутствующие в микросомах печени животных контрольной группы. Так, введение НЧ TiO2 сопровождалось суммарным исчезновением 23 белковых пятен, которые были идентифицированы в контроле. Из них 19 белковых пятен не выявляются при введении животным всех исследуемых доз TiO2; 2 белковых пятна не выявлялись только у животных 2-й группы и еще 2 - у животных 4-й группы. Указанные белки имели молекулярную массу в диапазоне от 14,0 до 132,77 кДа.

Таким образом, у животных всех экспериментальных групп независимо от используемых доз НЧ TiO2 были выявлены 53 новых белковых пятна и исчезли 19 (по сравнению с контрольной группой). При введении НЧ TiO2 в высоких дозах у животных 3-й и 4-й групп дополнительно появились 25 белковых пятен, отсутствовавшие в контроле у животных 2-й группы, а также исчезли 3 белковых пятна, присутствующие в микросомах печени животных 1-й и 2-й групп. Согласно полученным данным (табл. 2), при введении НЧ TiO2 наблюдается экспрессия большого числа новых белков, отсутствовавших в значимых количествах в микросомах гепатоцитов животных, которым не вводили НЧ TiO2.

Масс-спектрометрическая идентификация белков, экспрессируемых под действием НЧ анатазы в микросомах гепатоцитов, позволила выявить ряд белков, присутствующих в базе данных, однако их биологическую функцию на основе данных, полученных нами в настоящем эксперименте, установить невозможно. Исключением был один доминантный белковый пик, экспрессируемый под воздействием НЧ в микросомах печени животных 2-4-й групп. Было установлено, что он представлен изоформой Мu 2 фермента глутатион-S-трансферазы (см. рисунок), причем молекулярная масса этого белка составила 41,55 кД, изоэлектрическая точка рI=8,0.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что пероральное введение крысам на протяжении 28 дней НЧ TiO2 в концентрации от 0,1 до 10,0 мг/кг массы тела в день влияет на экспрессию белков микросом печени крыс, что выражается в появлении большого числа новых белков по сравнению с контролем. Это особенно выражено при введении НЧ TiO2 в высоких концентрациях. Полученные данные указывают на перспективность использования метода двумерного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией для оценки эффектов, в том числе токсикологических, оказываемых искусственными НЧ на организм. При этом необходимо идентифицировать вновь экспрессируемые функционально значимые белки, биосинтез которых является мишенью воздействия НЧ при их поступлении в организм.

Настоящая работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 гг.".

Таблица 2. Характеристика протеома микросом печени крыс 1-4-й групп

Литература

1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). - М.: Наука, 1981. - 288 с.

2. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

3. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания МУ 1.2.2520-09. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - 36 с.

4. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

5. Chen H.W., Su S.F., Chien C.T. et al. // FASEB J. - 2006. - Vol. 20, N 13. - P. 2393-2395.

6. Haniu H., Matsuda Y., Takeuchi K. et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2010. - Vol. 242, N 3. - P. 256-262.

7. Jin C., Tang Y., Yang F.G. et al. // Biol. Trace Elem. Res. - 2011. - Vol. 141, N 1-3. - P. 3-15.

8. Karpova M.A., Moshkovskii S.A., Toropygin I.Y., Archakov A.I. // J. Proteomics. - 2010. - Vol. 73, N 3. - P. 537-551.

9. Koeneman B.A., Zhang Y., Westerhoff P. // Cell Biol. Toxicol. - 2010. - Vol. 26, N 3. - P. 225-238.

10. Shi Y., Zhang J.H., Jiang M. et al. // Environ. Mol. Mutagen. - 2010. - Vol. 51, N 3. - P. 192-204.

11. Titanium dioxide. FAO JECFA Monographs 10. - Rome: FAO JECFA, 2010. - 6 p. (http://www.fao.org/ag/agn/jecfa-additives/specs/monograph7/additive-466-m7.pdf).

12. Xu J.L., Khor K.A., Sui J.J. et al. Protein expression profiles in osteoblasts in response to differentially shaped hydroxyapatite nanoparticles // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30, N 29. - P. 5385-5391.

13. Yang X., Liu J., He H. et al. // Part Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-12.