New sources of organic form zinc

AbstractThe Сomparative analysis of the efficiency of the enzymatic hydrolysis of the mussels meat has been carried out, using enzymatic preparations with proteolytic action called «Protozim», «Flavoenzyme» and «Pancreatine». Complexes of fermentolyzates of the mussels meat with zink have been obtained by the reaction of chelating. Prepared fermentolyzates and their complexes with zink have been determined by physicochemical methods. Composition of amino acids has been determined in fermentolyzates and in their complexes with zink has been characterized the content of zink. The valuation of molecular – mass distribution of peptide fractions of fermentolyzates and their complexes with zink has been given.

Keywords:zink, mussels meat, enzymatic preparation, protein hydrolizates, complexes with essential microelements

Практическая реализация концепции здорового питания, как известно, предполагает промышленный выпуск различных видов пищевых продуктов, прежде всего функционального и диетического назначения. К перспективным источникам пищевого сырья высокой биологической ценности, используемого для производства этих пищевых продуктов, могут быть отнесены гидробионты, которые (в частности кислотные гидролизаты мяса мидий [1, 8]) эффективно используются во многих странах мира (в том числе и в нашей) для приготовления лечебных и профилактических продуктов питания. Однако они обладают недостаточно удовлетворительными органолептическими свойствами, что препятствует их широкому использованию для производства пищевых продуктов массового потребления. К тому же происходящее в процессе кислотного гидролиза полное или частичное разрушение некоторых незаменимых аминокислот (в первую очередь триптофана) также значительно снижает исходно высокую биологическую ценность белка мяса мидий.

НИИ питания РАМН и Всероссийским НИИ рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО) начаты исследования, направленные на получение гидролизатов мяса мидий путем ферментолиза с использованием различных коммерческих ферментных препаратов "Флавоэнзим" (Novozymes, Дания), коллагеназы из гепатопанкреаса краба ("Биопрогресс", Россия), Corolase L (Германия) и "Протозим" (Украина). Сочетанное применение ферментолиза и мембранных технологий позволило получить водорастворимые гидролизаты, в состав которых входят пептидные фракции различной молекулярной массы, пригодные как для использования в качестве компонентов различных пищевых продуктов, так и для комплексирования с эссенциальными микроэлементами [2, 3, 7]. Нами проведена сравнительная оценка молекулярно-массового распределения, аминокислотного состава и комплексирования с цинком 2 водорастворимых гидролизатов мяса мидий, полученных с использованием 1- и 2-стадийной схем ферментолиза.

Материал и методы

В качестве исходного пищевого сырья для получения ферментолизата было использовано сырое мороженое мясо мидии (КНР), которое размораживали, сливали талую воду, а затем гомогенизировали в измельчителе тканей (Waring commercial blender 800S, США, при 22000 об/мин) в течение 15 мин с добавлением дистиллированной воды (1/3 часть от массы мяса). Полученный гомогенат высушивали лиофилизацией (лиофильная сушка "ЛС-500", Россия).

В работе были использованы вышеуказанные ферментные препараты "Флавоэнзим", "Панкреатин" и "Протозим". "Флавоэнзим" является комплексным ферментным препаратом, продуцируемым специально отобранным штаммом Asp. oryzae (оптимальный диапазон pH=5,0-7,0, оптимум температуры - 50 °С); активность препарата - не менее 500 ЕД/г. "Панкреатин" - ферментный препарат, обладающий протеолитической (не менее 158 ЕД/г) и амилолитической активностью; его выделяют из панкреатической железы крупного рогатого скота. "Протозим" - сухой комплексный ферментный препарат протеолитического действия, полученный путем направленной ферментации селекционного штамма Bacillus subtilis; оптимальная активность его достигается при pH=6,5 и температуре 45-50 °С (протеолитическая активность равна 490 ЕД/г).

В ходе настоящей работы мы определяли общую и протеолитическую активность ферментов по методу [11], принимая за единицу протеолитической активности такое количество ферментного препарата, в г, которое вызывало повышение оптической плотности раствора при длине волны 280 нм на 0,01 опт. ед. за счет не осаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов расщепления гемоглобина.

Гидролиз мяса мидий проводили по 1- и 2-стадийной схемам. Для 1-стадийного гидролиза использовали 5% водный раствор лиофильно высушенного мяса мидий. Добавляя ферментный препарат "Протозим", протеолиз вели в течение 22 ч при соотношении фермент : лиофильно высушенный гомогенат мяса мидий 1:20 (г/г), при температуре 50 °С без подведения pH реакционной среды, чтобы минимизировать содержание неорганических солей в конечном продукте. 2-стадийная схема гидролиза включала последовательное использование ферментных препаратов "Флавоэнзим" и "Панкреатин". В ходе ферментолиза также применяли 5% водный раствор лиофильно высушенного гомогената мяса мидий, в который сначала вносили "Флавоэнзим" в соотношении фермент: лиофильно высушенный гомогенат мяса мидий 1:20 (г/г). Гидролиз вели в течение 22 ч при температуре 50 °С без подведения pH. Во время II стадии гидролиза pH контролировали добавлением раствора щелочи (1 н NaOH) и поддерживали в интервале pH 7,3-7,6; гидролиз вели 4 ч при соотношении "Панкреатин" : лиофильно высушенный гомогенат мяса мидий 1:50 (г/г).

Полученные ферментолизаты мяса мидий осветляли центрифугированием на центрифуге "J6B BECKMAN" при 4000 об/мин в течение 30 мин при 25 °С, в результате чего получали водорастворимые ферментолизаты мяса мидий (ВФММ1 и ВФММ2) и осадки. Комплексы ВФММ с цинком получали по схеме, включающей совместную инкубацию водного раствора хлорида цинка (ZnCl2, безводный) с ВФММ в соотношении белок в составе ВФММ: ZnCl2 - 10:1 по массе. Инкубацию проводили в течение 1 ч при pH 7,0-7,1 и температуре 25 °С при постоянном перемешивании магнитной мешалкой, после чего реакционную смесь осветляли центрифугированием (3000 об/мин в течение 1 ч). Супернатант подвергали нанофильтрации на установке "Владисарт" (Россия) с диаметром пор нанофильтрационного патрона от 500 до 1000 Д и отмывали дистиллированной водой в режиме диафильтрации от несвязавшихся ионов, свободных аминокислот и короткоцепочечных пептидов. Полученный раствор подвергали лиофильной сушке.

В гомогенате мяса мидий, их гидролизатах, полученных путем ферментативного гидролиза, а также в осадках (после предварительной минерализации проб) методом Кьельдаля определяли содержание общего азота, используя для этого автоматический анализатор (модель 2300, производства фирмы "Kjeltec Foss", Швеция).

Содержание белка оценивали, используя коэффициент пересчета, равный 6,25. Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе полученных при проведении 1- или 2-стадийного гидролиза ВФММ и в их комплексах с цинком оценивали методом эксклюзионной хроматографии среднего давления на колонке "Superose 12" (1,6-50 см) ("Pharmacia", Швеция) по методике, описанной в работе [9]. Количественное содержание пептидных фракций в анализируемых ферментолизатах мяса мидий оценивали путем интегрирования полученных хроматограмм весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки [5]. Аминокислотный состав лиофильно высушенного гомогената мяса мидий и ВФММ выявляли на автоматическом аминокислотном анализаторе фирмы "Хитачи" с компьютерной обработкой данных по программе "МультиХром" для Windows с предварительным полным гидролизом белков 6 н HCl по стандартной методике. Триптофан количественно определяли методом щелочного гидролиза [6]. Содержание цинка в его комплексах с ВФММ определяли с использованием метода атомноабсорбционной спектроскопии с предварительной минерализацией проб на спектрофотометре ("Hitachi 180-80", Япония) с зеймановской поляризацией [10].

Результаты и обсуждение

Масса ВФММ1 и ВФММ2, полученных соответственно при проведении 1- или 2-стадийного ферментативного гидролиза, составила в 1-м случае 62,5%, во 2-м - 81,5% от массы исходного сырья. В то же время удельное содержание белка в лиофильно высушенном гомогенате мяса мидий было в пределах 67,4±0,3%, в лиофильно высушенном образце ВФММ1 слегка повышенным (73,2±0,3%), а в лиофильно высушенном образце ВФММ2 несколько пониженным (63,7±0,3%). Результаты определения молекулярно-массового распределения пептидов в составе ВФММ1 и ВФММ2 (водорастворимых конечных продуктов ферментативного гидролиза) приведены в табл. 1, из которой видно, что в составе ВФММ2 содержание высокомолекулярных фракций с массой более 21 кД было понижено, а с молекулярной массой менее 2,4 кД - повышено по сравнению с ВФММ1.

Как и следовало ожидать, протеолиз и переход части подвергшегося расщеплению белка мяса мидий в водорастворимое состояние привел к тому, что аминокислотный состав и аминокислотный скор ВФММ1 и ВФММ2 были различны. Это подтверждается данными табл. 2, характеризующими аминокислотный состав водорастворимых ферментолизатов мяса мидий, полученных по 1- и 2-стадийной схемам, а также по их аминокислотныму скору относительно шкалы ФАО/ВОЗ (1985). Аминокислотный состав ВФММ1 был лимитирован в основном по валину (скор 61,6%) и триптофану (скор 70,0%), а в ВФММ 2 - по сумме серосодержащих аминокислот (скор 73,2%), а также по валину (скор 74,5%) и триптофану (скор 79,1%) и (хотя и менее значительно) - по сумме ароматических аминокислот (скор 96,2%).

Таблица 1. Молекулярно-массовое распределение пептидов в составе водорастворимых гидролизатов мяса мидий, полученных по 1- и 2-стадийным схемам

В табл. 3 представлены результаты, характеризующие распределение по молекулярным массам пептидных фракций в составе комплексов цинка с водорастворимыми гидролизатами мяса мидий ВФММ1 и ВФММ2 до и после их нанофильтрационной обработки (НФ). Видно, что в составе полученных комплексов преобладают пептидные фракции с молекулярной массой < 11 кД. При этом после НФ в комплексах снизилось процентное содержание относительно низкомолекулярных фракций с молекулярной массой < 6 кД. Использование НФ позволило удалить из реакционной смеси не связавшиеся с пептидами катионы металлов, а также (частично) короткие пептиды и свободные аминокислоты, что улучшило органолептические характеристики, в частности, снизило горечь получаемого продукта. Содержание цинка в его комплексах с ВФММ1 и ВФММ2 составило соответственно 32,3 и 38,7 мг/г.

Таким образом, сравнительная характеристика полученных водорастворимых гидролизатов мяса мидий и их комплексов с цинком свидетельствует о перспективности использовании методического подхода, включающего сочетание ферментолиза и мембранной НФ. В проведенном исследовании 2-стадийная схема ферментолиза по сравнению с 1-стадийной обеспечивала более полное протекание процесса и соответствовала более высокому выходу конечного продукта. Однако это преимущество нивелируется большим содержанием белка в ВФММ1, чем в ВФММ2. 1-стадийная схема гидролиза с использованием одного ферментативного препарата без поддержания по ходу ферментолиза рН реакционной смеси титрованием щелочью существенно более технологична и экономически выгодна в плане возможного масштабирования. Применение мембранной нанофильтрации позволяет получать приемлемый по вкусовым качествам продукт, содержащий пептидно-связанную, т.е. органическую форму цинка [4]. Достаточно высокое содержание органической формы этого эссенциального микроэлемента в составе полученных водорастворимых комплексов свидетельствует о возможности их эффективного использования в качестве ингредиентов широкого ассортимента специализированных продуктов, в первую очередь в форме напитков.

Таблица 2. Аминокислотный состав ВФММ1 и ВФММ2 (г/100 г белка) и их аминокислотный скор (%) относительно шкалы ФАО/ВОЗ

Таблица 3. Распределение по молекулярным массам пептидных фракций в составе комплексов ВФММ 1 и ВФММ 2 с цинком до и после нанофильтрации (НФ)

Литература

1. Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б., Деев Л.И. // Успехи соврем. биол. - 1995. - Т. 115, № 2. - С. 213-224.

2. Зорин С.Н, Бучанова А.В. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 2. - С. 73-77.

3. Зорин С.Н., Матяш A.И. и др. // Вопр. дет. диетологии. - 2008. - Т. 6, № 3. - С. 36-38.

4. Зорин С.Н. // Микроэлементы в медицине. - 2007. - Т. 8, № 1. - С. 53-55.

5. Зорин С.Н., Баяржаргал М. // Биомед. химия. - 2009. - Т. 55, № 1. - С. 73-80.

6. Лисицын А.Б., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Методы практической биотехнологии. - М.: Техмир, 2002. - 113 с.

7. Нгуен Хай Иен, Новикова М.В. и др. // Рыб. пром-сть. - 2009. - № 1. - С. 43-45.

8. Новикова М.В., Рехина Н.И. и др. // Вопр. питания. - 1998. - № 1. - С. 10-13.

9. Хефтман Э. Хроматография. Практическое приложение метода. - М.: Мир, 1989. - Т. 1. - 111 с.

10. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. - М.: Брандес-Медицина, 1998. - 185 с.

11. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 03081449-01. Стандарт качества лекарственного средства. - С. 1-11.