A comparative evaluation of the effect of soy protein and its enzymatic hydrolysate on lipid metabolism in male Wistar rats with induced obesity

Abstract

Among various food proteins, soybean proteins have the greatest traditions of application for the dietary correction and prevention of lipid metabolism disorders and related complications.

Aim. In an in vivo experiment using male Wistar rats, the lipid-lowering properties of soy protein and its enzymatic hydrolysate were tested to evaluate their possible use as ingredients of specialized foods.

Material and methods. Animals were randomly divided into 3 groups: control group G1 and 2 experimental groups G2 and G3. The total duration of the experiment was 70 days. The animals of the control group G1 were fed with high-lipid semi-synthetic diet. Animals of the experimental groups G2 and G3 received the same high-fat semi-synthetic diet, but with a 50% replacement of casein with soy protein isolate (SPI) and enzymatic hydrolyzate of SPI (EHSPI), respectively. The blood glucose was measured once per 2 weeks. At the end of the experiment on the 71st day the level of glycated hemoglobin was determined in the blood; the levels of triglycerides, cholesterol, high density lipoproteins (HDL), low density lipoproteins (LDL) and the concentration of malon dialdehyde were determined in the serum.

Results and discussion. Starting from the 6th week of the experiment and prior to its completion, the average food intake of animals from the G3 group was significantly (р<0.05) lower compared to animals of the G1 control group. The food intake of animals of group G2 was significantly (р<0.05) reduced compared with this indicator for animals of group G1, starting from the week 8 of the experiment and prior to its completion. The monitoring of the body weight gain did not reveal significant differences between all groups of animals, despite differences in the food intake. Replacing casein in the diet by 50% with SPI had a pronounced antioxidant and cholesterol-lowering effect. The total cholesterol content (1.65±0.05 mmol/l) decreased significantly (р<0.05) due to a decrease in LDL (0.90±0.03 mmol/l), and malon dialdehyde level lowered (3.7±0.5 gmol/l, р<0.05) in the serum of group G2 rats compared with animals of the control group G1 (2.01±0.13 and 1.12±0.09 mmol/l; 5.1±0.4 gmol/l, respectively). Replacing casein by 50% with EHSPI in the diet of G3 rats was unfavorable, significantly (р<0.05) increasing the level of total cholesterol (2.76±0.16 mmol/l) and cholesterol in LDL (1.66±0.12 mmol/l) in blood of these animals compared with animals of both comparison groups G1 and G2. Conclusion. A preclinical comparative study of the cholesterol-lowering and antioxidant properties of the SPI substantiates the prospect of its following clinical trials with the aim of including into the composition of specialized foods for prevention and diet therapy of the disorders of endogenous cholesterol homeostasis.

Keywords:metabolic syndrome, soy protein isolate, enzymatic hydrolysate, lipid metabolism, cholesterol, low-density lipoproteins

For citation: Sidorova Yu.S., Zorin S.N., Petrov N.A., Frolova Yu.V., Kochetkova A.A., Mazo V.K. A comparative evaluation of the effect of soy protein and its enzymatic hydrolysate on lipid metabolism in male Wistar rats with induced obesity. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (4): 18-24. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10037 (in Russian)

Широкая распространенность нарушений липидного метаболизма у населения России определяет актуальность отечественных разработок новых эффективных специализированных пищевых продуктов (СПП) профилактического назначения, позволяющих снижать риски развития этой патологии и сопутствующих клинических проявлений. Результаты клинических и экспериментальных исследований, накопленные к настоящему времени мировой нутрициологией, свидетельствуют о гипохоле-стеринемическом действии растительных белков [1, 2].

Среди различных пищевых белков наибольшие традиции применения для диетической коррекции и профилактики нарушений липидного обмена и связанных с ним ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, артериальной гипертензии, сахарного диабета 2 типа и метаболического синдрома имеют белки сои. В нашем недавнем кратком обзоре экспериментальных исследований гиполипидемических свойств растительных белков отмечены перспективы использования их ферментативных гидролизатов в составе СПП для профилактики нарушений метаболизма [3].

Необходимым этапом, предшествующим использованию соевого белка и/или его ферментолизатов в составе СПП для диетотерапии и профилактики связанных с нарушением липидного обмена алиментарно-зависимых заболеваний, является доклиническая оценка их эффективности.

Целью нашего исследования была сравнительная характеристика влияния изолята соевого белка (ИСБ) и его ферментолизата на липидный обмен у крыс-самцов линии Вистар, потребляющих высокожировой рацион.

Материал и методы

Использовали ИСБ "SuproXT 221 DIP" (США) с добавленным фосфатом кальция. Содержание белка в ИСБ составило 80%, кальция - 2,75%, фосфора - 1,9%.

В качестве ферментного препарата использован панкреатин из панкреатической железы свиньи (Sichuan Biosyn Pharmaceutical Co., КНР, активность 2,25 МЕ/мг).

Ферментативный гидролизат ИСБ (ФГИСБ) получали, используя установку, состоящую из диспергатора марки Я9-ОРП со встроенным центробежным насосом, резервуара марки Я1-ОСВ с мешалкой и терморубашкой вместимостью 1000 л. К 150 л 5,0% водного раствора ИСБ при перемешивании добавляли 150 г панкреатина (соотношение белок/фермент 50 : 1). Гидролиз проводили при температуре 50-52 °С в течение 3 ч при постоянном перемешивании, после чего продукт пастеризовали при 75 °С в течение 20 мин. ФГИСБ высушивали на распылительной сушильной установке ("Ниро Атомайзер", Дания) производительностью 20 кг испаренной влаги в час при температуре воздуха на входе в сушильную башню 160-165 °С, на выходе -80-85 °С. Полученный ферментолизат, использованный в дальнейшем в эксперименте по кормлению животных, представлял собой тонкодисперсный порошок с высоким содержанием среднецепочечных пептидов светло-кремового цвета, влажностью 9,5%, хорошо растворимый в воде, имел удовлетворительный вкус с легким горько-соленым привкусом и характерным запахом.

30 крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 80±5 г были получены из питомника лабораторных животных Филиал "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России. Исследования выполнены в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил лабораторной практики" и требованиями ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики". Крыс содержали в контролируемых условиях окружающей среды (температура 20-26 °C, относительная влажность 30-60%, 12-часовой цикл освещения).

После 7-дневного карантина крыс распределили на 3 группы с применением принципа рандомизации: контрольную группу Г1 составили животные с массой тела 127±2 г, опытную группу Г2 - с массой тела 126±3 г и опытную группу Г3 - с массой тела 126±2 г, различия по массе тела незначимы (р≥0,05). Животных содержали по 2 особи в клетке. Животные группы Г1 получали высокожировой полусинтетический рацион. Животные опытных групп Г2 и Г3 также получали высокожировой полусинтетический рацион, но с 50% заменой казеина на ИСБ и ФГИСБ соответственно (табл. 1).

Воду и корм животные получали ad libitum. На протяжении всего исследования длительностью 70 сут определяли индивидуальные показатели поедаемости корма и прироста массы тела каждого животного. Через сутки на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали. Определяли уровень глюкозы в крови 1 раз в 2 нед: животных депривировали голодом в течение 12 ч, кровь брали из хвостовой вены.

На 71-е сутки депривированных голодом в течение ночи животных выводили из эксперимента декапита-цией под легким эфирным наркозом. Собранную после декапитации животного кровь центрифугировали в течение 15 мин при 500g, сыворотку хранили при -20 °С.

Уровень глюкозы в крови животных определяли с помощью портативного электрохимического глюкометра "OneTouch Select" (LifeScan Inc., США). Уровень глики-рованного гемоглобина в крови определяли с использованием набора "Гликогемотест" (ЭЛТА, Россия). В сыворотке крови на автоматическом анализаторе "Konelab 20i" (Thermo Scientific, Финляндия) определяли содержание триглицеридов, холестерина (ХС), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) определяли расчетным путем по формуле согласно [5]: ЛПНП = 3/4 (ХС - ЛПВП).

Концентрацию малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически согласно [6] с некоторыми модификациями.

Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием пакета программ SPSS Statistics 20 с применением непараметрического рангового критерия Манна-Уитни и критерия Стьюдента. Вычисляли среднее значение (М),стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего (m). Данные представлены как M±m. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова и поведению при ежедневном осмотре было удовлетворительным.

В табл. 2 приведены результаты мониторинга средней поедаемости корма за 1 сут животными всех групп (в расчете на 2-недельные интервалы).

Начиная с 6-й недели эксперимента и до его окончания, средняя поедаемость корма животными группы Г3, получавшими в составе рациона ФГИСБ и казеин, была достоверно ниже по сравнению с животными контрольной группы Г1, получавшими в составе рациона только казеин. Потребление корма животными группы Г2, получавшими ИСБ и казеин, достоверно снизилось по сравнению с этим показателем для животных группы Г1, начиная с 8-й недели эксперимента и до его окончания. Тем не менее средняя поедаемость корма животными, рассчитанная за весь эксперимент, для животных групп Г1, Г2 и Г3 достоверно не различалась и составила 16,9±0,6, 15,7±0,3 и 15,8±0,3 г/сут соответственно.

Мониторинг прироста массы тела не выявил достоверных различий между всеми группами животных на всем протяжении эксперимента, несмотря на отмеченные выше различия в поедаемости корма (рис. 1).

Потребление высокожирового рациона не привело к заметным нарушениям углеводного обмена: уровень глюкозы в крови на протяжении всего эксперимента (рис. 2) и содержание гликированного гемоглобина в крови по окончании эксперимента с кормлением (табл. 3) не различались у животных всех групп и находились в интервале нормальных значений для крыс-самцов линии Вистар [7].

Замена казеина 50% ИСБ в потребляемом рационе оказала выраженное антиоксидантное и гипохолесте-ринемическое воздействие: статистически значимо снизилось содержание общего ХС и МДА в сыворотке крови крыс группы Г2 по сравнению с животными контрольной группы Г1. Потребление ИСБ также достоверно снизило содержание ХС в составе ЛПНП. Замена казеина 50% ФГИСБ в рационе крыс группы Г3, наоборот, оказалась неблагоприятной, достоверно увеличив содержание общего ХС и ХС ЛПНП в крови этих животных по сравнению с животными обеих групп сравнения (Г1 и Г2).

В современной литературе одно из возможных объяснений гипохолестеринемического действия ИСБ связано с феноменом взаимодействия в тонкой кишке ХС с пептидными фракциями, образующимися при переваривании белка [8], в результате чего нарушаются мицеллярная растворимость ХС, его всасывание, изменяется энтерогепатическая циркуляция желчных кислот, приводящая к снижению содержания ХС в печени, а также снижается экспрессия некоторых генов белков -медиаторов липидного транспорта [9]. Следует также отметить, что высокое содержание в соевом белке глутамина - аминокислоты, необходимой для образования глутатиона, может способствовать защите клеток от повреждения свободными радикалами и играть важную роль в функционировании иммунной системы [10]. Гиполипидемические свойства пептидов как в составе ферментолизатов, так и высвобождающихся при переваривании белка (а также их синтетических аналогов) детерминированы аминокислотной последовательностью [11]. Можно предположить, что в условиях проведенного исследования протеолиз ИСБ in vitro (в отличие от переваривания ИСБ in vivo) не привел к высвобождению гиполипидемических пептидов в составе ферментолизата, способных играть ключевую роль в эндогенном гомеостазе ХС.

Заключение

При 70-суточном потреблении высокожирового рациона крысами-самцами линии Вистар 50% замена казеина ИСБ оказала определенное гипохолестеринемическое и антиоксидантное действие, снизив содержание общего ХС и ХС в составе ЛПНП, а также МДА в сыворотке крови этих животных. 50% замена казеина ФГИСБ, напротив, повышала содержание общего ХС и ХС ЛПНП в сыворотке крови. Доклиническое сравнительное исследование гипохолестеринемических и антиоксидантных свойств ИСБ обосновывает перспективность его последующих клинических испытаний с целью включения в состав СПП для профилактики и диетотерапии нарушений эндогенного гомеостаза ХС.

Финансирование. Поисково-аналитическая работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема № 0529-2019-0055).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература

1. Zhang X.-M., Zhang Y.-B., Chi M.-H. Soy Protein supplementation reduces clinical indices in type 2 diabetes and metabolic syndrome // Yonsei Med. J. 2016. Vol. 57, N 3. P. 681.

2. Tovar A.R., Torre-Villalvazo I., Ochoa M. et al. Soy protein reduces hepatic lipotoxicity in hyperinsulinemic obese Zucker fa/fa rats // J. Lipid. Res. 2005. Vol. 46, N 9. P. 1823-1832.

3. Сидорова Ю.С., Мазо В.К., Кочеткова А.А. Экспериментальная оценка гиполипидемических свойств белков сои, риса и их ферментативных гидролизатов // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 2. С. 77-84. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10021

4. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Саркисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценка обогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 46-55.

5. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vaccinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats // Nutrition. 2017. Vol. 41. P. 107-112.

6. Del Rio D., Stewart A. J., Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological markerof oxidative stress // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2005. Vol. 15, N 4. P. 316-328.

7. Абрашова Т.В., Гущин Я.А., Ковалева М.А., Рыбакова А.В., Селезнева А.И., Соколова А.П. и др. Справочник. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных. СПб. : ЛЕМА, 2013. 116 с.

8. Howard A., Udenigwe C.C. Mechanisms and prospects of food protein hydrolysates and peptide-induced hypolipidaemia // Food Funct. 2013. Vol. 4, N 1. P. 40-51.

9. Nagata Y., Noguchi Y., Tamaru S., Kuwahara K., Okamoto A., Suruga K. et al. Hypolipidemic potential of squid homogenate irrespective of a relatively high content of cholesterol // Lipids Health Dis. 2014. Vol. 13. P. 165.

10. Field C.J., Johnson I., Pratt V.C. Glutamine and arginine: immu-nonutrients for improved health // Med. Sci. Sports Exerc. 2000. Vol. 32, N 7. P. S377-S388.

11. Cho S.-J.,Juillerat M.A., Lee C.-H. Cholesterol lowering mechanism of soybean protein hydrolysate // J. Agric. Food Chem. 2007. Vol. 55, N 26. P. 10 599-10 604.

References

1. Zhang X.-M., Zhang Y.-B., Chi M.-H. Soy Protein supplementation reduces clinical indices in type 2 diabetes and metabolic syndrome. Yonsei Med J. 2016; 57 (3): 681.

2. Tovar A.R., Torre-Villalvazo I., Ochoa M., et al. Soy protein reduces hepatic lipotoxicity in hyperinsulinemic obese Zucker fa/ fa rats. J Lipid Res. 2005; 46 (9): 1823-32.

3. Sidorova Yu.S., Mazo V.K., Kochetkova A.A. The experimental evaluation of hypolipidmic properties of soy, rice proteins and their enzymatic hydrolysates. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (2): 77-84. (in Russian)

4. Sidorova Yu.S., Zorin S.N., Petrov N.A., Makarenko M.A., Sarkisyan V.A., Mazo V.K., et al. Physiological and biochemical evaluation of rats' diet enrichment with docosahexaenoic acid and astaxanthin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (5): 46-55. (in Russian)

5. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vac-cinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats. Nutrition. 2017; 41: 107-12.

6. Del Rio D., Stewart A. J., Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2005; 15 (4): 316-28.

7. Abrashova TV., Gutschin Ya.A., Kovaleva M.A., Rybakova A.V., Selezneva A.I., Sokolova A.P., et al. Directory. Physiological, biochemical and biometric indicators of the norm of experimental animals. Saint Petersburg: LEMA, 2013: 116 p. (in Russian)

8. Howard A., Udenigwe C.C. Mechanisms and prospects of food protein hydrolysates and peptide-induced hypolipidaemia. Food Funct. 2013; 4 (1): 40-51.

9. Nagata Y., Noguchi Y., Tamaru S., Kuwahara K., Okamoto A., Suruga K., et al. Hypolipidemic potential of squid homogenate irrespective of a relatively high content of cholesterol. Lipids Health Dis.2014; 13: 165.

10. Field C.J., Johnson I., Pratt V.C. Glutamine and arginine: immu-nonutrients for improved health. Med Sci Sports Exerc. 2000; 32 (7): S377-88.

11. Cho S.-J., Juillerat M.A., Lee C.-H. Cholesterol lowering mechanism of soybean protein hydrolysate. J Agric Food Chem. 2007; 55 (26): 10 599-604.