In vivo study of plant protein products from soybeans and non-alkaloid lupine Dega variety

Abstract

Research on finding additional sources of vegetable protein as an alternative to soy has shown a great prospect of using lupine. The study of biological effects of flour of nonalkaloid lupine Dega variety will assess the future prospects for its use in food industry.

The aim - a comparative study of protein products - soybean flour and non-alkaloid lupine flour (Dega-1 variety), added to laboratory rats’ diet.

Material and methods. Experiment was carried out on three groups of Wistar rats (n=30, 210±5g) for28 days: 1stgroup — rats that consumed the standard vivarium diet (control); 2nd group and 3rd group - animals, that consumed standard diet with addition of lupine flour (protein content - 42.1%) and soy flour (protein content - 50.2%), replacing 26 and 23% protein in standard diet, respectively.

Results. As a result of the experiment, fluctuations in body weight of rats in 2nd group and 3rd group were observed from the 11th day; the weight gain of rats in 1st group was 7.74%, 2nd group and 3rd group - 3.32 and 2.04%. Noted changes could be explained by food adaptation of organism to the main nutrients of protein products. The blood test showed minor changes in the hematological and biochemical parameters within physiological reference values. Consumption of lupine flour led to a slight increase of leukocytes (by 14.2%) and lymphocytes (by 24.5%), an increase in the activity of certain enzymes (aspartate aminotransferase by 18.4%, alanine aminotransferase by 26.2% and lactate dehydrogenase by 21.6%, p>0.05), while alkaline phosphatase activity decreased (14.4%, p<0.05) in comparison with control. Incorporation of soy flour into the diet of rats showed a statistically significant increase in the concentration of monocytes, eosinophils, basophils and immature cells (by 57.1% in comparison with 1st group and 83.3% in comparison with 2nd group), while relative content of granulocytes reduced (by 15.1% relative to the control).

Conclusion. The inclusion of plant proteins into the rat’s diet did not cause significant deviations in physiological (motor activity), biochemical, hematological parameters in experimental animals. However, the identified features in animals of the experimental groups, possibly related to biologically active substances and anti-alimentary factors in soybean and lupine, indicate the need to improve technological approaches to lupine protein products production in order to improve functional characteristics and completely remove substances that deteriorate nutrients absorption. A possible solution is lupine proteins’ proteolysis, the use of various methods of fractionation, isolation and purification in combination with pretreatment to obtain protein concentrates or isolates with improved nutritional, technological and functional properties.

Keywords:lupine seed, soy flour, alkaloids, rats

For citation: Fedulova L.V., Zverev S.V., Kotenkova E.A., Vasilevskaya E.R. In vivo study of plant protein products from soybeans and non-alkaloid lupine Dega variety. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (2): 24-31. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10014. (in Russian)

Бобовые культуры являются важным компонентом рациона питания населения, на их долю приходится порядка 20% мирового потребления белка, причем большую часть составляют соевые бобы [1]. Потребление сои в Российской Федерации достигает 3 млн тонн в год, из них около половины импортируется, поскольку возможности внутреннего производства сои в стране ограничены из-за малого количества почвенно-климатических зон ее эффективного выращивания. По этой причине постоянно предпринимаются попытки найти сое приемлемую альтернативу. В качестве таковой уже не один десяток лет продвигается люпин, который по содержанию белка немногим уступает сое, но имеет районы произрастания, существенно сдвинутые к северу, при этом выход белка с гектара у него в 1,5 раза выше [2].

В настоящий момент в Российской Федерации культивируют 3 вида люпина: желтый, белый и люпин узколистный, при этом сорта люпина принято делить на безалкалоидные (до 0,025%), малоалкалоидные (0,025-0,1%) и алкалоидные (>0,1%). В пищевой промышленности и кормопроизводстве применяют мало- и безалкалоидные сорта. Белый люпин привлекает внимание из-за высокого содержания белка и сбалансированности аминокислот при низком содержании алкалоидов [3]. Кроме того, многочисленными исследованиями показано, что белый люпин может служить источником пищевых и биоактивных компонентов [4]. Так, в ядрах люпина содержится порядка 40% пищевых волокон, что превышает показатели большинства других бобовых [5]. Показан позитивный эффект полисахаридов белого люпина, в частности выявлено, что α-галактозиды люпина предотвращают рост и развитие потенциально патогенных бактерий [6]. Получены данные о значительном содержании в люпине белом высокоактивных ингибиторов протеаз, подавляющих канцерогенные и воспалительные процессы в желудочно-кишечном тракте [7]. Продемонстрированы гиполипидемический эффект in vivo белковых изолятов белого люпина, характеризующийся снижением концентрации холестерина и нормализацией профиля липопротеинов в крови, а также гипогликемическое действие за счет позитивного влияния на углеводный обмен [8-10], что было подтверждено данными об инсулинсвязывающих свойствах основных белковых компонентов семян люпина - конглютинов (в частности белка γ-конглютина) [11]. Таким образом, люпин является ценным источником растительных белков, в том числе оказывающих биологические эффекты. Однако основными лимитирующими факторами широкого использования люпина в Российской Федерации являются содержащиеся в нем токсические вторичные метаболиты: люпанин, люпинидин, гидроксилюпанин и др. [2, 12]. К настоящему времени разработана технология производства продуктов первичной переработки безалкалоидного люпина сорта Дега в виде муки, крупки, хлопьев для использования в производстве мясных продуктов, хлебобулочных и макаронных изделий и т.п. для повышения пищевой ценности и увеличения ассортимента аглютеновых диетических продуктов [13].

Цель работы - сравнительное изучение белкового соевого продукта и белкового продукта из безалкалоидного люпина сорта Дега при введении их в рацион лабораторным животным.

Материал и методы

Объектами исследования являлись мука люпина белого сорта Дега (ВНИИЗ, Россия) и мука соевая ("Партнер-М", Россия), данные по физико-химическому составу образцов представлены в табл. 1. В процессе производства белковых продуктов растительное сырье не подвергалось тепловому воздействию.

Исследование проводили на лабораторных крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 210±5г (n=30), полученных из филиала "Андреевка" ФГБУ "НЦБМТ" РАМН (Московская область, п. Андреевка). В период карантина (14 сут) и проведения эксперимента (28 сут) животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в клетках типа IV S (Tecniplast, Италия).

Для проведения эксперимента животные были произвольно распределены на 3 группы (n=10): 1-я группа состояла из контрольных животных, потребляющих на протяжении всего эксперимента стандартный рацион вивария (СРВ); животным 2-й и 3-й групп в рацион дополнительно вводили муку безалкалоидного люпина сорта Дега (СРВ + Л) и соевую муку (СРВ + С), замещая 27,7 и 23,5% белка стандартного рациона соответственно.

Содержание основных пищевых компонентов использованных рационов представлено в табл. 2.

Каждые 3-и сутки животных всех групп осматривали и взвешивали с помощью электронных технических весов "Ohaus" (Adventurer Pro, США) с точностью ±0,1 г. Изучение ориентировочно-исследовательского поведения животных проводили на установке "Открытое поле" (НПК "Открытая наука", Россия) за 1 сут до начала и на 27-е сутки эксперимента, регистрировали вертикальную и горизонтальную двигательную активность, норковый рефлекс.

На 28-е сутки эксперимента после усыпления животных в камере для эвтаназии с помощью углекислого газа (VetTech, Великобритания) брали кровь из правого желудочка сердца в стеклянные пробирки без антикоагулянта и пластиковые пробирки с ЕDTA (Aquisel, Испания). Также определяли абсолютную массу печени, левой почки, селезенки, сердца путем взвешивания на электронных весах с точностью ±0,001 г (Acculab Vicon, США). Общее клиническое исследование проб цельной крови проводили на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе "Abacus junior vet 2.7" (Diatron Messtechnik GmbH, Австрия), используя наборы реактивов Diatron. Биохимические исследования сыворотки крови, полученной по [14], проводили на анализаторе "BioChem SA" (HTI, США), используя наборы реактивов HTI.

Содержание, питание, уход и выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями российских и зарубежных нормативных актов -приказа Минздрава России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики", Директивы Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых для научных целей.

Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения SPSS Statistics 17.0, использовали t-критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни при нормальном и отличающемся от нормального распределении параметров. Математическая обработка данных включала расчет средних значений со стандартными ошибками (M±m). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Состояние животных всех групп на протяжении всего эксперимента находилось в пределах физиологической нормы. Наблюдение за динамикой изменения массы тела крыс в ходе эксперимента (см. рис. А) показало, что животные контрольной (1-й) группы стабильно увеличивали массу тела в течение всего эксперимента, в среднем по 3 г/сут. Масса тела крыс 2-й и 3-й групп возрастала в среднем по 2 г/сут с 1-х по 11-е сутки эксперимента, впоследствии выявлено снижение массы тела крыс 2-й группы до 14-х суток, 3-й группы - вплоть до 17-х суток (не более 1,5 г). Дальнейшее наблюдение показало стабилизацию массы тела экспериментальных животных 2-й и 3-й групп. Поедаемость корма в течение эксперимента в среднем для животных 1-й группы составляла 12,3-13,6 г/сут на крысу, 2-й группы - 12,513,1 г/сут, 3-й группы - 12,1-12,9 г/сут (см. рис. Б). Статистически значимых изменений потребления корма животными всех групп не выявлено. В целом к концу эксперимента прибавка массы тела относительно начальной у крыс 1-й группы составила 7,74%, у животных 2-й группы - 3,32%, у крыс 3-й группы - 2,04%.

У животных, потреблявших соевую и люпиновую муку, в первые 10 сут эксперимента отмечена схожая тенденция к увеличению массы тела, дальнейшие колебания массы тела крыс начиная с 11-х суток, возможно, связаны с включением в рацион экспериментального растительного белка и последующей пищевой адаптации организма.

При тестировании ориентировочно-исследовательского поведения было показано, что до начала эксперимента животные всех групп при помещении в центр установки проявляли нормальную локомоторную активность. Изменений в характере двигательной активности на 27-е сутки не отмечено, снижение исследовательского поведения, проявляющегося как норковый рефлекс, к концу эксперимента можно связать с привыканием животных к экспериментальной установке и переходу их к патрулированию знакомой территории (табл. 3).

Гематологическое исследование выявило, что показатели крыс всех групп (табл. 4) не выходили за границу физиологической нормы для данного вида животных, возраста и пола. У животных 2-й группы относительно контроля отмечено увеличение количества лейкоцитов (на 14,2%) и лимфоцитов (на 24,5%), не достигающее, однако, уровня статистической значимости. У животных 3-й группы выявлено статистически значимое увеличение содержания смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток (на 57,1% и на 83,3% по сравнению с показателями крыс 1-й и 2-й групп) за счет увеличения относительного содержания моноцитов(на 60,3% и на 40,9% по сравнению со значениями крыс 1-й и 2-й групп) на фоне снижения относительного содержания гранулоцитов (на 15,1% по сравнению с показателями крыс 1-й группы). Достоверных различий между остальными анализируемыми показателями у крыс экспериментальных групп не отмечено.

При биохимическом исследовании сыворотки крови животных опытных групп выявлены некоторые отличия от показателей крыс контрольной группы. У крыс 2-й группы отмечено снижение активности щелочной фосфатазы на 14,4% (р<0,05) на фоне повышения активности аспартатаминотрансферазы на 18,4%, аланинаминотрансферазы на 26,2% и лактатдегидрогеназы на 21,6%, не достигающего уровня статистической значимости. У крыс 3-й группы отмечено уменьшение уровня креатинина на 9,2% (р<0,05) при недостоверном увеличении активности аланинаминотрансферазы на 24,9% и щелочной фосфатазы на 15,2% (табл. 5). Также у животных 3-й группы при сравнении с показателями крыс 2-й группы отмечены повышенная активность щелочной фосфатазы (34,6%, р<0,05) и снижение активности аспартатаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы (на 14,3 и 19,7% при р>0,05). Остальные показатели не отличались от контроля и не выходили за границы физиологической нормы.

Возможно, изменения показателей крови крыс, потреблявших муку люпина, а именно: недостоверное увеличение количества лейкоцитов и лимфоцитов, повышение ферментативной активности (аспартатами-нотрансфераза, аланинаминотрансфераза и лактатдегидрогеназа) при статистически значимом снижении активности щелочной фосфатазы, - связаны с неблагоприятным воздействием на метаболизм азота глобулинов данного сорта люпина [16]. Однако стоит отметить, что вышеописанные изменения незначительны и находятся в пределах физиологических референтных значений.

При патологоанатомическом исследовании животных не обнаружено проявлений воспалительных патологических процессов во внутренних органах: в пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени, дыхательной системе, органах кровообращения и кроветворения, мочевыделительной системе. У контрольных животных печень и селезенка имели однородный бордовый цвет и упругую консистенцию, у животных, которым вводили исследуемые добавки, печень была несколько уменьшена в размерах, полнокровна, однородного цвета, упругой консистенции. Почки однородного цвета, упругие, эластичные. Статистически значимых изменений со стороны относительной массы анализируемых внутренних органов не отмечено. Однако стоит отметить, что у крыс 2-й группы выявлено не достигающее уровня статистической значимости увеличение относительной массы почки на 18,5% и уменьшение массы печени на 7,3% (табл. 6).

Обсуждение

Таким образом, включение в рацион крыс белковых продуктов (муки безалкалоидного люпина сорта Дега и соевой муки) в течение 28 сут не вызывает выраженных изменений со стороны показателей массы тела, относительной массы внутренних органов, а также ориентировочно-исследовательского поведения, морфологических и биохимических показателей крови. При этом выявлены некоторые особенности у животных опытных групп, возможно, связанные с наличием в составе муки сои и люпина биологически активных веществ и антиалиментарных факторов. Невысокие показатели прироста массы тела крыс при включении исследуемых образцов согласуются с ранее полученными данными [9], свидетельствующими о том, что белковая фракция люпина может влиять на сытость и снижать потребление энергии. Также это может быть связано с наличием в соевой и люпиновой муке ингибитора трипсина Кунитца, снижающего перевариваемость белка рациона. Снижение прибавки массы тела у крыс 3-й и 2-й групп в 3,8 и 2,3 раза относительно значений крыс контрольной группы можно объяснить тем, что содержание ингибиторов трипсина в соевом шроте значительное и находится на уровне 3,0-3,5 г/кг, тогда как в разных сортах люпина не превышает 0,2 г/кг [17].

Отмеченные изменения гематологических показателей (в пределах нормальных физиологических отклонений), характеризующиеся у животных 2-й группы недостоверным увеличением содержания лейкоцитов и лимфоцитов, у крыс 3-й группы - статистически значимым увеличением содержания смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток за счет моноцитов и снижения гранулоцитов, не зафиксированы в других работах. Между тем общеизвестно, что некоторые растительные белки являются иммунореактивными. Так, в исследованиях in vitro установлено, что белок люпина может вызывать увеличение продукции активных форм кислорода в нейтрофилах [18]. Изменение активности щелочной фосфатазы у животных 2-й группы (снижение на 14,4% относительно значений 1-й группы и на 34,6% относительно 3-й группы), возможно, свидетельствует о снижении всасываемости цинка и железа у животных, что может быть обусловлено содержанием фитата в муке люпина. Тем не менее известно, что в таких бобовых, как соя, которая широко используется в пищевой индустрии, содержание фитиновой кислоты, являющейся основной формой хранения фосфора в семенах растений, значительно больше, чем в зернах люпина [17, 19].

Для предотвращения возможных негативных эффектов, связанных с антиалиментарными факторами (включая ингибиторы трипсина, специфические олигосахара, фитаты, метаболиты α-галактозида и пр.), необходима оптимизация технологических подходов к производству белковых продуктов из люпина с улучшенными пищевыми, технологическими и функциональными свойствами. Одними из путей снижения аллергенности и повышения функциональности может стать протеолиз белков люпина, применение различных методов фракционирования, выделения и очистки в сочетании с предварительной обработкой для получения белковых концентратов или изолятов с целевыми функциональными и технологическими свойствами.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов.

Литература

1. Lefranc-Millot C., Teichman-Dubois V. Protein from vegetable sources: a focus on pea protein // Novel Proteins for Food, Pharmaceuticals and Agriculture. John Wiley and Sons, 2018. P. 197-216. doi: 10.1002/9781119385332.ch10.

2. Зверев С.В., Панкратьева И.А., Цыгуткин А.С., Штеле А.Л. Использование белого люпина в экономике России // Хранение и переработка зерна. 2014. № 5. C. 31-34.

3. Цыгуткин А.С., Зверев С.В. Белый люпин как сельскохозяйственная культура // Хранение и переработка зерна. 2014. № 4. C. 20-23.

4. Prusinski J. White lupin (Lupinus albus L.) - nutritional and health values in human nutrition - a review // Czech J. Food Sci. 2017. Vol. 35. Р. 95-105. doi: 10.17221/114/2016-CJFS

5. Calabrт S., Cutrignelli M.I., Lo Presti V., Tudisco R., Chiofalo V., Grossi M. et al. Characterization and eff ect of year of harvest on the nutritional properties of three varieties of white lupine (Lupinus albus L.) // J. Sci. Food Agric. 2015. Vol. 95, N 25. P. 3127-3136. doi: 10.1002/jsfa.7049

6. Palacio M.I., Weisstaub A.R., Zuleta A., Etcheverría A.I., Manrique G.D. α-Galactosides present in lupin flour affect several metabolic parameters in Wistar rats // Food Funct. 2016. Vol. 7, N 12. Р. 4967-4975. doi: 10.1039/C6FO01297C

7. Clemente A., Arques M.C. Bowman-Birk inhibitors from legumes as colorectal chemopreventive agents // World J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20, N 30. Р. 10 305-10 315. doi: 10.3748/wjg. v20.i30

8. Bahr M., Fechner A., Kramer J. et al. Lupin protein positively affects plasma LDL cholesterol and LDL: HDL cholesterol ratio in hypercholesterolemic adults after four weeks of supplementation: a randomized, controlled crossover study // Nutr. J. 2013. Vol. 12. Р. 107. doi: 10.1186/1475-2891-12-107

9. Capraro J., Magni C., Scarafoni A. et al. Pasta supplemented with isolated lupin protein fractions reduces body weight gain and food intake of rats and decreases plasma glucose concentration upon glucose overload trial // Food Funct. 2014. Vol. 5. P. 375-380. doi: 10.1039/c3fo60583c.

10. Sewani-Rusike C.R., Jumbam D.N., Chinhoyi L.R., Nkeh-Chungag B.N. Investigation of hypogycemic and hypolipidemic eff ects of an aqueous extract of lupinus albus legume seed in streptozotocin-induced type i diabetic rats // Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 2015. Vol. 12, N 2. P. 36-42. doi: 10.4314/ajtcam. v12i2.8

11. Gętek M., Czech N., Muc-Wierzgoń M. Grochowska-Niedworok E., Kokot T., Nowakowska-Zajdel E. The active role of leguminous plant components in type 2 diabetes // Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2014. Vol. 29. Р. 39-61. doi: 10.1155/2014/293961

12. Панкина И.А., Борисова Л.М. Исследование алкалоидности семян люпина // Научный журнал НИУ ИТМО. Сер. "Процессы и аппараты пищевых производств". 2015. № 4. С. 80-87.

13. Зверев С.В., Цыгуткин А.С. Первичная переработка зерна белого люпина // Соврем. фермер. 2014. № 8. C. 11-13.

14. Chernukha I.M., Fedulova L.V., Kotenkova E.A., Takeda S., Sakata R. Hypolipidemic and anti-infl ammatory eff ects of aorta and heart tissues of cattle and pigs in the atherosclerosis rat model // Anim. Sci. J. 2018. Vol. 89, N 5. P. 784-793. doi: 10.1111/asj.12986

15. Evans G.O. Animal Clinical Chemistry: a Practical Handbook for Toxicologists and Biomedical Researchers. 2nd ed. UK : Taylor and Francis Group, 2009. 368 p.

16. Rubio L.A., Grant G., Scislowski P.W.O. et al. The utilization of lupin (Lupinus angustifolius) and faba bean globulins by rats is poorer than of soybean globulins or lactalbumin but the nutritional value of lupin seed meal is lower only than that of lactalbumin // J. Nutr. 1995. Vol. 125. Р. 2145-2155.

17. Ленкова Т., Зевакова В. Питательная ценность и антипитательные факторы семян люпина // Птицеводство. 2012. № 1. С. 14-17.

18. Klos P., Poniedzialek B., Lampart-Szczapa E., Gralik J., Wiktorowicz K. The flow cytometric analysis of lupin proteins’ potential to induce the respiratory burst in human neutrophils // Acta Sci. Pol. Technol. Aliment. 2009. Vol. 8, N 1. Р. 91-97.

19. Bohn L., Meyer A.S., Rasmussen S.K. Phytate: impact on environment and human nutrition. A challenge for molecular breeding // J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2008. Vol. 9, N 3. P. 165-191.

References

1. Lefranc-Millot C., Teichman-Dubois V. Protein from vegetable sources: a focus on pea protein. In: Novel Proteins for Food, Pharmaceuticals and Agriculture. John Wiley and Sons, 2018: 197-216. doi: 10.1002/9781119385332.ch10

2. Zverev S.V., Pankrat’eva I.A., Cygutkin A.S., Shtele A.L. The use of white lupine in the Russian economy. Khranenie i pererabotka zerna [Grain Storage and Processing]. 2014; (5): 31-4. (in Russian)

3. Cygutkin A.S., Zverev S.V. White lupine as cultivation crop. Khranenie i pererabotka zerna [Grain Storage and Processing]. 2014; (4): 20-3. (in Russian)

4. Prusinski J. White lupin (Lupinus albus L.) - nutritional and health values in human nutrition - a review. Czech J Food Sci. 2017; 35: 95-105. doi: 10.17221/114/2016-CJFS

5. Calabrr S., Cutrignelli M.I., Lo Presti V., Tudisco R., Chiofalo V., Grossi M., et al. Characterization and effect of year of harvest on the nutritional properties of three varieties of white lupine (Lupinus albus L.). J Sci Food Agric. 2015; 95 (25): 3127-36. doi: 10.1002/ jsfa.7049

6. Palacio M.I., Weisstaub A.R., Zuleta A., Etcheverrna A.I., Manrique G.D. a-Galactosides present in lupin flour affect several metabolic parameters in Wistar rats. Food Funct 2016; 7 (12): 4967-75. doi: 10.1039/C6FO01297C

7. Clemente A., Arques M.C. Bowman-Birk inhibitors from legumes as colorectal chemopreventive agents. World J Gastroenterol. 2014; 20 (30): 10 305-15. doi: 10.3748/wjg.v20.i30

8. Bahr M., Fechner A., Kramer J., et al. Lupin protein positively affects plasma LDL cholesterol and LDL:HDL cholesterol ratio in hypercholesterolemic adults after four weeks of supplementation: a randomized, controlled crossover study. Nutr J. 2013; 12: 107. doi: 10.1186/1475-2891-12-107

9. Capraro J., Magni C., Scarafoni A., et al. Pasta supplemented with isolated lupin protein fractions reduces body weight gain and food intake of rats and decreases plasma glucose concentration upon glucose overload trial. Food Funct. 2014; 5: 375-80. doi: 10.1039/ c3fo60583c

10. Sewani-Rusike C.R., Jumbam D.N., Chinhoyi L.R., Nkeh-Chun-gag B.N. Investigation of hypogycemic and hypolipidemic effects of an aqueous extract of lupinus albus legume seed in streptozotocin-induced type i diabetic rats. Afr J Tradit Complement Altern Med. 2015; 12 (2): 36-42. doi: 10.4314/ajtcam.v12i2.8

11. Gętek M., Czech N., Muc-Wierzgon M. Grochowska-Niedworok E., Kokot T., Nowakowska-Zajdel E. The active role of leguminous plant components in type 2 diabetes. Evid Based Complement Alternat Med. 2014; 29: 39-61. doi: 10.1155/2014/293961

12. Pankina I.A., Borisova L.M. The study of the alkaloids in lupin seeds. Nauchniy zhurnal NIU ITMO. Seriya "Processy i apparaty pishchevykh proizvodstv". 2015; (4): 80-7. (in Russian)

13. Zverev S.V., Cygutkin A.S. Primary processing of white lupine grain. Sovremenniy fermer [Modern Farmer]. 2014; (8): 11-3. (in Russian)

14. Chernukha I.M., Fedulova L.V., Kotenkova E.A., Takeda S., Sakata R. Hypolipidemic and anti-inflammatory effects of aorta and heart tissues of cattle and pigs in the atherosclerosis rat model. Anim Sci J. 2018; 89 (5): 784-93. doi: 10.1111/asj.12986

15. Evans G.O. Animal clinical chemistry: a practical handbook for toxicologists and biomedical researchers. 2nd ed. UK: Taylor and Francis Group, 2009: 368 p.

16. Rubio L.A., Grant G., Scislowski P.W.O., et al. The utilization of lupin (Lupinus angustifolius) and faba bean globulins by rats is poorer than of soybean globulins or lactalbumin but the nutritional value of lupin seed meal is lower only than that of lactalbumin. J Nutr. 1995; 125: 2145-55.

17. Lenkova T., Zevakova V. Nutritional value and anti-nutritional factor-tori lupine. Ptitsevodstvo [Poultry Farming]. 2012; (1): 14-7. (in Russian)

18. Klos P., Poniedzialek B., Lampart-Szczapa E., Gralik J., Wikto-rowicz K. The flow cytometric analysis of lupin proteins’ potential to induce the respiratory burst in human neutrophils. Acta Sci Pol Technol Aliment. 2009; 8 (1): 91-7.

19. Bohn L., Meyer A.S., Rasmussen S.K. Phytate: impact on environment and human nutrition. A challenge for molecular breeding. J Zhejiang Univ Sci B. 2008; 9 (3): 165-91