Toxicological sanitary characterization of silver nanoparticles introduced in gastrointestinal tract of rats

AbstractWater suspensions of silver nanoparticles were introduced intragastrically to growing male Wistar rats daily for 28 days. There were studied animals mass gain, relative masses of viscera, intestinal barrier resistance against protein macromolecules, DNA oxidative damage, tissue non-protein thiol levels, first and second phase of xenobiotic detoxication system activity, lysosomal membranes stability in liver together with routine blood biochemical and hematological indices and caecal’s microbiocenose state. The data testifying to possible toxic risks, connected with reaction of silver’s nanoparticles is obtained.

Keywords:silver, nanoparticles, toxicity, rats

Металлическое серебро (Ag) в форме наночастиц (НЧ- Ag) широко применяется в качестве компонента защитных антимикробных покрытий, а также при производстве различных средств для обеззараживания воды, упаковочных материалов, косметических препаратов, дезинфицирующих средств и других видов продукции [1], поскольку даже очень низкие концентрации НЧ-Ag способны уничтожать бактерии [10, 13, 14, 26]. Однако токсичность НЧ-Ag для высших животных и человека изучена недостаточно.

Несмотря на данные, подтверждающие в опытах in vitro повреждающее действие НЧ-Ag на клетки [12, 15, 16, 22, 25], токсичность Ag для лабораторных животных в опытах in vivo не выявлена [11, 17, 18, 24]. В частности, не установлено отрицательного воздействия НЧ-Ag и нами в опубликованной ранее работе [8]: 28-дневное внутрижелудочное введение крысам НЧ-Ag в суточной дозе до 0,1 мг/кг не вызывало никаких неблагоприятных эффектов. Более высокие дозы НЧ-Ag в указанной работе не охарактеризованы из-за присутствия в препарате стабилизирующей добавки - диоктилсульфосукцината натрия, которая сама обладает выраженной токсичностью.

Целью настоящего исследования было охарактеризовать воздействие на лабораторных животных более высоких доз НЧ-Ag (до 1 мг/кг/сут), стабилизированных нетоксичным водорастворимым полимером.

Материал и методы

В работе был использован препарат НЧ-Ag "Арговит", производимый ООО "НПЦ "ВекторВита" (Новосибирск, Россия), согласно ТУ 9310-13-00008064-00. Препарат представляет собой водную дисперсию НЧ-Ag, содержащую 1,0-1,4% (по массе Ag) и 18,6-19,0% стабилизатора - поливинилпирродидона (ПВП) с молекулярной массой 15-30 кД. Данный полимер малотоксичен для человека и высших животных и используется, в частности, как компонент кровезаменителей. Исследования проведены с помощью трансмиссионного электронного микроскопа "JEM-100 СХ" (фирма "Jeol", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. В составе используемой дисперсии были выявлены НЧ-Ag округлой, эллипсоидной или неправильной формы со средним диаметром 34,9±14,8 нм (рис. 1а, б). Минимальный размер указанных частиц составил 8,4, максимальный - 80,9 нм.

Эксперименты проведены в соответствии с [7] на 105 крысах-самцах Вистар с исходной массой 81±2 г. Крыс содержали группами по 3 животных в пластмассовых клетках и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом, приготовленном на основе казеина [5, 7]. Доступ к корму и питьевой воде для животных не ограничивали.

Животные были разделены на 7 групп по 15 крыс в каждой. Тестируемые материалы вводили крысам внутрижелудочно через зонд на протяжении 28 дней. Крысам 1-й (контрольной) группы вводили дистиллированную воду. Животные 2-й группы получали разведенный деионизованной водой препарат НЧ-Ag из расчета 0,1 мг Ag на 1кг массы тела в день (препарат, как указывалось выше, содержит стабилизатор ПВП). Животным 3-й опытной группы вводили 1,0 мг/кг/сут препарат НЧ-Ag, разведенный деионизированной водой и содержащий указанный выше ПВП. Крысы 4-й группы получали взвесь макроскопического Ag из расчета 0,1 мг/кг массы тела/день, извлеченного, согласно [3], из нитрата серебра ч.д.а, и дополнительно ПВП - 1,33 мг/кг в день. Крысам 5-й группы вводили дисперсию макроскопического Ag и дополнительно ПВП в количестве соответственно 1 и 13,3 мг/кг в день. Животные 6-й и 7-й групп получали только стабилизатор ПВП в количестве соответственно 1,33 и 13,3 мг/кг в день.

В ходе эксперимента у крыс всех групп еженедельно определяли прирост массы тела, взвешивая их на электронных весах с точностью ±0,5 г.

На 29-й день эксперимента крыс умерщвляли путем обескровливания (под легким эфирным наркозом), подвергали патолого-анатомическому вскрытию, на секции отбирали внутренние органы (печень, почки, селезенка, сердце, семенники, тимус, легкие), определяли их относительную массу (ОМ), в % от массы тела. В печени выявляли содержание цитохромов Р450 и b5, а также активность ряда ферментов I и II фазы детоксикации ксенобиотиков - этоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A1), метоксирезоруфиндеалкилазы (CYP1A2), пентоксирезоруфиндеалкилазы (CYP2B1), глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронозилтрансферазы; общую и неседиментируемую активность арилсульфатаз А и В, активность β-галактозидазы и β-глюкуронидазы, а также уровень восстановленного глутатиона (GSH). В крови с помощью стандартных гематологических методов изучали уровень гемоглобина (Hb), содержание эритроцитов, лейкоцитов (нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов) и тромбоцитов. Одновременно с помощью биохимического анализатора "Konelab 20 I" фирмы "Thermo Scientific" (США) определяли биохимические показатели сыворотки крови (аланинаминотрансферазу - АЛТ; аспартатаминотрансферазу - АСТ; альбумин; общий белок; глюкозу; креатинин; мочевую кислоту; мочевину; щелочную фосфатазу). В печени выявляли апоптоз гепатоцитов, а также содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (8-oxo-dG - продукт окислительного повреждения ДНК). Кроме перечисленных показателей, определявшихся в крови и печени крыс, изучали также состояние микробиоценоза слепой кишки и иммуноферментным методом степень всасывания в тонкой кишке макромолекул белка, вводимого однократно перорально (2 г на 1 кг массы тела). У всех животных в плазме крови определяли содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ)* и активности ферментов антиокислительной защиты в эритроцитах крыс (диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, глютатионпероксидазы, глютатионредуктаза, супероксиддисмутазы, каталазы) (соответственно по [2, 4, 19-21, 23, 27]. Для характеристики НЧ диоксида серебра в настоящей работе были использованы методы, которые применялись нами ранее для определения НЧ диоксида титана [5, 6, 9].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ SPSS 17.0 согласно критерию Манна-Уитни с определением средней арифметической (М), ее ошибки (m), индекса достоверности (р) и проведением факторного анализа с использованием теста ANOVA.

Рис. 1. а - Репрезентативная электронная микрофотография препарата НЧ-Ag. Электронный микроскоп "JEM-100CX" ("Jeol", Япония), ускоряющее напряжение 80 кВ; б - гистограмма распределения частиц по диаметру

Ось абсцисс - диаметр частиц, нм; ось ординат - число частиц в интервале ±10 нм.

Таблица 1. Относительная масса внутренних органов крыс на 29-й день опыта

Таблица 2. Cодержание цитохромов Р450 и b5 и активность ферментов I и II фазы метаболизма ксенобиотиков у крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента абсолютная и относительная масса тела у животных во всех группах изменялась практически однотипно: небольшие различия в массе тела у крыс исследуемых групп были статистически недостоверны.

Проведенный анализ показал отсутствие влияния на прирост массы тела НЧ-Ag и Ag как химического элемента. У животных всех опытных групп, получавших НЧ-Ag, Ag (металлическое) и ПВП, относительная масса печени, сердца, семенников, тимуса и легких была такой же, как у контрольных животных (табл. 1). Причем ОМ этих внутренних органов была одинаковой независимо от того, что получали животные - НЧ-Ag, металлическое серебро или ПВП.

Однако ОМ почек животных 2-й группы, получавших НЧ-Ag, была достоверно ниже, чем у животных 6-й группы, получавших ПВП. При сравнении 3-й и 5-й групп подобного эффекта не наблюдалось. ОМ селезенки крыс 3-й группы была достоверно выше, чем в 5-й группе. Вместе с тем такой же эффект наблюдался и у крыс 7-й группы. Полученные данные указывают на отсутствие влияния НЧ-Ag на ОМ всех исследованных нами внутренних органов.

Как следует из рис. 2, степень всасывания в кровь макромолекул белка, введенного перорально, достоверно не отличается от таковой у животных обеих групп, получавших НЧ-Ag. Однако обращает на себя внимание тот факт, что всасывание белка (овальбумина - ОВА) в тонкой кишке у животных 3-й группы оказывается достоверно выше, чем у животных 5-й группы. Различия между животными 3-й группы, получавшими Ag, и животными 7-й группы, получавшими только ПВП, имели ту же направленность, хотя были недостоверны. Данный результат указывает на возможность неблагоприятного увеличения всасывания макромолекул Ag вследствие приема высокой дозы НЧ-Ag.

Результаты исследования показали, что у крыс 2-й и 3-й групп, получавших НЧ-Ag, содержание 8-оксо-2-дезоксигуанозина (маркер окислительного повреждения ДНК) практически такое же, как у контрольных животных и животных 4-й и 5-й групп, получавших Ag (металлический) и ПВП. Эти данные подтверждают, что используемые дозы препарата не вызывают усиления окислительного повреждения ДНК.

Таблица 3. Показатели системы антиоксидантной защиты у крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Как следует из табл. 2, достоверных изменений в общем содержании цитохромов P-450 и b5 в печени животных 1-7-й групп не наблюдали. Активность CYP1A1 была максимальной у животных 2-й группы, причем различия с 4-й группой достоверны. Аналогичный эффект отмечен и для CYP1A2. Установлено, что единственным фактором, влияющим на данный показатель, является присутствие ПВП. Активность CYP2B1 во всех группа (за исключением 7-й) понижена по сравнению с показателем у контрольных животных. При этом наибольшим снижение было в 4-й, 5-й и 6-й группах. Фактором, достоверно влияющим на данный показатель, является введение ПВП. Что же касается животных, получавших НЧ-Ag, у них степень подавления активности CYP2B1 оказалась минимальной.

Активность глутатион-S-трансферазы у крыс всех опытных групп не отличалась от таковой в контрольной группе, но оказалась достоверно пониженной у животных 4-й группы. При этом у крыс, получавших НЧ-Ag, этот показатель в среднем имел наибольшие значения. Аналогичная картина наблюдалась и при определении активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы. Таким образом, не выявлено признаков, свидетельствующих о снижении в печени под действием высоких и низких доз НЧ-Ag функции системы детоксикации ксенобиотиков. Что касается ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков (изоформы CYP), то наблюдаемые эффекты связаны, скорее всего, не с действием НЧ-Ag, а с влиянием стабилизатора ПВП. В случае конъюгирующих ферментов II фазы метаболизма ксенобиотиков НЧ-Ag, по-видимому, не только не ослабляют защиту, но, возможно, приводят к ее определенной активации. Иными словами, негативного влияния НЧ-Ag на микросомальную систему детоксикации ксенобиотиков не выявлено.

Таблица 4. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Результаты определения неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз в печени крыс продемонстрировали отсутствие ее достоверных изменений у животных всех опытных групп по сравнению с контролем. Исключением была неседиментируемая активность β-глюкуронидазы, которая оказалась ниже у животных 2-й группы (5,08±0,49%), чем 6-й (5,98±0,32%). Таким образом, никаких признаков того, что введение животным препарата НЧ-Ag вызывает дестабилизацию лизосомальных мембран гепатоцитов, не обнаружено.

Содержание небелковых тиолов в печени у животных всех опытных групп было практически одинаковым, что свидетельствует об отсутствии воздействия на указанные компоненты препарата НЧ-Ag, Ag (металлического) и ПВП (р>0,1). Таким образом, введение препарата НЧ-Ag существенно не влияет на уровень тиолов, характеризующий состояние окислительно-восстановительных процессов в печени.

Таблица 5. Содержание лейкоцитов (включая процент лимфоцитов и моноцитов) и тромбоцитов в периферической крови крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Изучение ПОЛ (табл. 3) показало, что содержание диеновых конъюгатов в плазме крови было несколько повышено у животных 2-й группы по сравнению с животными контрольной, а также 4-й и 6-й групп. Однако при более высокой дозе НЧ-Ag (3-я группа) этот эффект не проявлялся. При этом содержание малонового диальдегида в плазме крови крыс всех опытных групп было практически одинаково и не отличалось от такового в контроле. В то же время активность глутатионпероксидазы в крови животных всех опытных групп была достоверно повышена по сравнению с контролем. Активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы эритроцитов у животных всех опытных групп была практически одинаковой и не отличалась от таковой в контроле, что свидетельствует об отсутствии влияния используемых веществ. Активность каталазы эритроцитов у крыс 2-й группы была незначительно, но достоверно понижена по сравнению с показателем в 6-й группе. У животных 3-й и 7-й групп эта зависимость сменялась на противоположную. Полученные данные не позволяют судить о каком-либо однозначном и однонаправленном влиянии НЧ-Ag на состояние антиоксидантной защиты организма. Если выявляется действие НЧ-Ag, оно оказывается не дозозависимым и очень незначительным по величине (не выше 15% от контрольного уровня), поэтому нельзя говорить о каком-то негативном влиянии используемых доз НЧ-Ag на систему антиоксидантной защиты организма животных.

Как следует из табл. 4, концентрации общего белка, альбумина, мочевой кислоты, креатинина, активность АЛТ у крыс, получавших НЧ-Ag (2-я и 3-я группы), металлическое Ag (4-я и 5-я группы) или ПВП (6-я и 7-я группы), не претерпевала изменений по сравнению с таковой у контрольных животных. Однако активность АСТ оказывалась статистически достоверно повышенной у животных 7-й и особенно 3-й группы. Вместе с тем ее абсолютная величина была незначительной (24%) и оставалась в пределах колебаний, отмечаемых в контроле. В свою очередь уровень глюкозы в крови крыс, получавших НЧ-Ag, был ниже, чем в контроле, причем снижение зависело от дозы используемого препарата НЧ-Ag и для крыс 3-й группы было более статистически достоверным. В отличие от этого у животных, получавших металлическое Ag, концентрация глюкозы в крови не изменялась, а у получавших ПВП в высокой дозе возрастала, не выходя за пределы, характерные для контрольных животных. Таким образом, есть основание полагать, что введение крысам НЧ-Ag в высокой дозе может повлиять на состояние их углеводного обмена.

Таблица 6. Характеристика основных популяций нормального микробиоценоза слепой кишки крыс контрольной и опытных групп (M±m)

Рис. 2. Всасывание в кровь овальбумина (ОВА) у крыс 1-7-й групп. Ось абсцисс - номера групп; ось ординат - количество белка в крови через 3 ч, % от скормленной дозы антигена Ч 103, M±m

Концентрация Hb в крови крыс 2-й и 3-й групп практически не отличается от таковой в контроле. Однако по сравнению с 5-й группой концентрация в 3-й группе была незначительно понижена (на 16%). Результаты оценки остальных гематологических показателей свидетельствуют о том, что общее количество эритроцитов, их средний объем, среднее содержание Hb в эритроцитах у животных 2-й и 3-й групп находились в пределах показателей в контроле и не отличались от подобных показателей животных 4-й и 5-й групп. Уровень гематокрита у животных 2-й группы был незначительно понижен по сравнению с таковым в 4-й группе. Средняя концентрация Hb в эритроцитах животных 3-7-й групп оказалась достоверно ниже, чем в контроле, а у животных 2-й группе не отличалась от него. Полученные данные однозначно указывают на то, что НЧ-Ag и металлическое Аg не оказывают негативное воздействие на концентрацию Hb в эритроцитах (р>0,1), а ее снижение скорее связано с действием ПВП (р<0,05).

Общее количество лейкоцитов во 2-й группе несколько понижено по сравнению с подобным показателем животных 6-й группой и не отличалось от показателей животных 4-й группы (табл. 5). Отсюда можно сделать вывод, что фактором, влияющим на уровень лейкоцитов в крови, является введение серебра, а не НЧ-Ag. По числу нейтрофилов животные 2-й и 3-й групп, получавшие НЧ-Ag, не отличались от контрольных крыс, получавших металлическое Аg и ПВП. Количество тромбоцитов было достоверно снижено (по сравнению с контролем) только у крыс 7-й группы, получавших большую дозу ПВП, что, несомненно, свидетельствует об отрицательном влиянии этого вещества на тромбоцитарный показатель периферической крови крыс. Иными словами, точных данных, свидетельствующих о влиянии НЧ-Ag на клеточные показатели периферической крови (количество лейкоцитов и тромбоцитов), не получено.

Исследование апоптоза гепатоцитов показало, что доля живых клеток у животных 3-й группы составила 93,16±0,48% и была достоверно (р<0,05) выше, чем при применении аналогичной дозы Ag в 5-й группе (91,54±0,46%). При этом относительное число клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза, было ниже у крыс 3-й и особенно 5-й группы (соответственно 5,99±0,39 и 7,51±0,44%). Различия остальных изученных показателей апоптоза (число клеток в позднем апоптозе, число всех клеток, находящихся в стадии апоптоза, а также число мертвых клеток) между всеми группами животных не выявлены. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у крыс влияния НЧ-Ag, металлического Ag, а также ПВП на процессы апоптоза гепатоцитов.

Поскольку НЧ-Ag, как известно, в опытах in vitro обладают выраженной антимикробной активностью [1], было интересно изучить их возможное влияние на состояние кишечного микробиоценоза in vivo. Как следует из данных, представленных в табл. 6, численность бифидобактерий в содержимом слепой кишки крыс, получавших НЧ-Ag (2-я и 3-я группы), дозозависимо снижается по сравнению как с контролем, так и с данным показателем у животных 4-й и 5-й групп. Проведенный анализ показал, что НЧ-Ag достоверно влияют на этот показатель. Несмотря на явное угнетение численности бифидофлоры под действием НЧ-Ag, ее кислотообразующая антагонистическая активность остается без видимых изменений. Отчетливый ингибирующий эффект НЧ-Ag выявлен в отношении популяций лактобацилл, стрептококков и стафилококков. На общее количество аэробных и анаэробных микроорганизмов НЧ-Ag не оказывали специфического воздействия. Влияние НЧ-Ag на популяцию энтерококков было немонотонным и отличалось некоторой стимуляцией роста этих микроорганизмов при низкой концентрации и полным отсутствием эффекта при большой.

Изучение транзиторных популяций кишечной микрофлоры крыс показало, что численность таких их представителей, как цитратассимилирующие энтеробактерии, St. aureus, дрожжи и плесени, не претерпевает тех изменений, которые можно соотнести с эффектом действия НЧ-Ag, особенно в малой дозе (животные 2-й группы). Вместе с тем введение крысам НЧ-Ag в высокой дозе (3-я группа) вызывает уменьшение содержания гемолитических стрептококков и клостридий, по сравнению с таковым у животных, получавших металлическое Ag и ПВП. Таким образом, воздействие НЧ-Ag в высокой дозе на кишечный микробиоценоз состоит в ингибиции как полезной симбиотической микрофлоры, так и, возможно, некоторых популяций условно-патогенных микроорганизмов.

В заключение следует отметить, что полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния НЧ-Ag, которое проявляется лишь при высокой дозе (1 мг/кг/в день) указанного препарата. При этом изменяются только отдельные показатели состояния организма животных. При низких дозах НЧ-Ag (0,1 мг/кг/в день) упомянутые эффекты отсутствуют либо являются статистически недостоверными. Настоящая работа выполнена за счет средств Федерального бюджета, по государственному контракту с Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы".

Литература

1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. // Вопр. питания. - 2009. - Т. 78, № 6. - С. 13-20.

2. Гаврилов В.Б. // Лаб. дело. - 1983. - № 3. - С. 35-55.

3. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. - М.: Химия. - 1974. - 407 с.

4. Мальцев Г .Ю., Т ышко Н .В. // Гиг. и сан. - 2002. - № 2. - С. 69-72.

5. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 21-30.

6. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В. и др. // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 25-30.

7. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. МУ 1.2.2520-09.

8. Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Кравченко Л.В. и др. Труды 3-го съезда токсикологов России. - 2008, апр. - С. 327-329.

9. Шевелева С.А., Кузнецова Г.Г., Батищева С.Ю. и др. // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 5. - С. 29-34.

10. Amin R.M., Mohamed M.B., Ramadan M.A. et al. // Nanomed. - 2009. - Vol. 4, N 6. - P. 637-643.

11. Bhol K.C., Schechter P.J. // Dig. Dis. Sci. - 2007. - Vol. 52, N 10. - P. 2732-2742.

12. Braydich-Stolle L., Hussain S., Schlager J.J. et al. // Toxicol. Sci. - 2005. - Vol. 88, N 2. - P. 412-419.

13. Choi O., Hu Z. // Environ. Sci. Technol. - 2008. - Vol. 42, N 12. - P. 4 5 8 3 - 4 5 8 8 .

14. Dror-Ehre A., Mamane H., Belenkova T. et al. // J. Colloid Interface Sci. - 2009. - Vol. 339, N 2. - P. 521-526.

15. Hsin Y.H., Chen C.F., Huang S. et al. // Toxicol. Lett. - 2008. - Vol. 179, N 3. - P. 130-139.

16. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M. et al. // Toxicol. In Vitro. - 2005. - Vol. 9, N 7. - P. 975-983.

17. Ji J.H., Jung J.H., Kim S.S. et al. // Inhal. Toxicol. - 2007. - Vol. 19, N 10. - P. 857-871.

18. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S. et al. // Inhal. Toxicol. - 2008. - Vol. 20, N 6. - P. 575-583.

19. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. // Biochem. Med. - 1980. - Vol. 23, N 3. - P. 302-311.

20. Mille G. // Biol. Chem. - 1959. - N 244. - P. 502-506.

21. Niashikimi M., Rao N.A., Jagi K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1972. - N 46. - P. 849-854.

22. Park S., Lee Y.K., Jung M. et al. // Inhal. Toxicol. - 2007. - Vol. 19, suppl. 1. - P. 59-65.

23. Placer Z. // Nahrung. - 1968. - N 12. - P. 679.

24. Sawosz E., Binek M., Grodzik M. et al. // Arch. Anim. Nutr. - 2007. - Vol. 61, N 6. - P. 444-451.

25. Shin S.H., Ye M.K., Kim H.S. et. al. // Int. Immunopharmacol. - 2007. - Vol. 7, N 13. - P. 1813-1818.

26. Su H.L., Chou C.C., Hung D.J. et al. // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30, N 30. - P. 5979-5987.

27. Tilbotsen J.A., Sauberlich H.S. // Nutr. - 1971. - N 101. - P. 14 5 9 .