Relationship between changes in peroxide oxidation lipoide index, cоenzyme Q10 and free fatty acids by of rats depending of fatty acid component in the ration

AbstractOntogenetic peculiarities of relationship concentration of coenzyme (Ко) Q10, peroxide oxidation lipoide (POL) content, peroxidation index (PI), concentration of omega 3 and omega 6 PUFA and saturated fatty acid in blood serum and liver of rats of 1, 3, 9 and 12 months old are studied. In blood serum pronounced riverse dependence was discovered between КоQ10 concentration and POL process intensivety in rats of 3 to 6 month old, fed palm and linseed oil. Direct relationship was established between TBA-active products in liver of all animal groups and peroxidation index. Value PI can be used for evaluation of potential substrates of POL in experiments and for creation of ration with definite fatty acid composition.

Keywords:fish oil, palm and linseed oil, coenzyme Q10, rats of 1, 3, 6, 9 and 12 months

Состояние здоровья человека тесно взаимосвязано с характером питания, в частности с жировой составляющей его рациона. В исследованиях последних лет была установлена терапевтическая эффективность включения в диету больных, страдающих поражением сердечно-сосудистой системы, сахарным диабетом типа 2, гиперхолестеринемией, аллергическими, кожными и другими заболеваниями, жировых продуктов, богатых полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) [8, 15, 16]. В настоящее время, кроме традиционных для нашей страны растительных масел, используемых в питании (подсолнечное, соевое, кукурузное), все чаще стали применяться масла тропического происхождения - пальмовое, кокосовое, которые содержат 50% насыщенных жирных кислот (ЖК). На долю ПНЖК в этих маслах приходится не более 10% от суммы ЖК.

Поступление в организм (в составе пищи или специальных препаратов) ПНЖК, включающихся в липиды тканей и мембран, увеличивает в них содержание потенциальных субстратов перекисного окисления липидов (ПОЛ). В экспериментальных исследованиях установлена возможность индукции ПОЛ в результате такого рода изменений в составе липидов тканей [11, 12, 14, 17]. Существенное значение в этих условиях имеет адекватная обеспеченность организма антиоксидантами.

Одним из самых активных антиоксидантов является коэнзим (КоQ10). Специфика его действия заключается в том, что он уничтожает свободные радикалы внутри клетки. В отличие от других антиоксидантов (витамины Е, А, β-каротин), которые, выполнив свою функцию, теряют активность, КоQ10 способен регенерироваться в организме [3].

Свободные ЖК, являющиеся необходимым компонентом в пище человека, участвуют в образовании биологически активных веществ. Высшие ЖК участвуют непосредственно в построении липопротеидов плазмы крови, и в составе последних (как транспортной формы ЖК) доставляются в органы-мишени, в которых ЖК служат или источником энергии (сердечная и поперечно-полосатая мускулатура), или предшественниками синтеза тканевых триглицеридов с последующим отложением в клетках органов. Профиль и количество свободных ЖК в сыворотке крови меняются в зависимости от возраста, режима питания, изменения гормонального статуса [9].

Целями данного исследования были оценка влияния различного по составу ЖК жирового компонента рациона на фоне дополнительного потребления КоQ10 на показатели ПОЛ в сыворотке крови и печени крыс, а также анализ влияния в онтогенезе вышеуказанных факторов на содержание свободных ЖК в сыворотке крови животных.

Материал и методы

Исследования были выполнены на растущих крысах - самцах Вистар с исходной массой тела 90-110 г. Животных содержали на стандартном полусинтетическом рационе, в состав которого входили казеин (источник белка), крахмал маисовый (источник углеводов), жир в количестве (по калорийности) соответственно 23,52 и 23%, а также пшеничные отруби (в качестве пищевых волокон) и солевая смесь, содержащая необходимые минеральные компоненты.

В зависимости от вида жира, используемого в рационе, были сформированы 4 группы животных. Крысы 1-й группы, контрольной, получали в качестве жирового компонента рациона подсолнечное масло : лярд в соотношении 1:1 крысы 2-й группы - пальмовое масло, 3-й - рыбий жир, 4-й - льняное масло. Дополнительно крысы всех групп получали КоQ10 из расчета 100 мг/кг массы тела. Животные получали необходимые водо- и жирорастворимые витамины, добавляемые в физиологических нормах в рацион каждой группы. Кормление крыс осуществляли вволю со свободным доступом к воде.

Продолжительность эксперимента составляла 1, 3, 6 и 12 мес. По завершении указанных сроков опыта животных после легкого эфирного наркоза умерщвляли путем декапитации, подвергали патолого-анатомическому вскрытию и забирали печень и кровь. Собранную кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об./мин, отбирали сыворотку и хранили при температуре -20 °С. Гомогенат печени (10% концентрации) готовили на 0,9% растворе NaCl. Определяли содержание свободных ЖК в сыворотке крови [5]. Состав ЖК, используемого в рационах жирового компонента, а также ЖК печени исследовали методом газо-жидкостной хроматографии после предварительной экстракции и получения метиловых эфиров жирных кислот для проведения анализа [6]. Интенсивность процессов ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и ТБК-активных продуктов в сыворотке крови [1, 4] и печени животных [13]. Концентрацию КоQ10 в сыворотке крови определяли с помощью ВЭЖХ системы "Agilent 1100" со спектрофотометрическим детектором на аналитической колонке "Lunа C18" 150 Ч 4,6 (Phenomenex, США) в изократическом режиме элюирования [7], детектирование проводили при λ=275 нм. Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методом параметрической статистики с использованием критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Анализ состава ЖК жирового компонента используемых рационов свидетельствует о значительном различии в них содержания ПНЖК семейств ω-6 и ω-3. В табл. 1 представлено суммарное содержание в рационах животных ПНЖК, их соотношение и индекс, характеризующий способность ЖК к образованию перекисей (ИПО), рассчитанный согласно [10]. В рационе контрольных животных преобладали ЖК семейства ω-6, а соотношение ПНЖК было наивысшим (164). В рационе с рыбьим жиром (3-я группа) соотношение ПНЖК ω-6/ω-3 было наименьшим (0,08) за счет преимущественного содержания в рационе ЖК семейства ω-3. Самым высоким ИПО был в рационе с рыбьим жиром (148), в 15 раз превышая показатель в рационе с пальмовым маслом.

Таблица 1. Содержание полиненасыщенных жирных кислот различных семейств и индекс перекисного окисления в рационах крыс

Взаимосвязь влияния КоQ10 на содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови животных продемонстрирована на рисунке, где представлена динамика изменений содержания продуктов ПОЛ и КоQ10 в сыворотке крови в зависимости от продолжительности эксперимента. У 3-месячных крыс всех групп отмечено наивысшее содержание КоQ10 и наименьшее - продуктов ПОЛ (ДК и ТБК-активных).

Известно, что старение сопровождается снижением концентрации КоQ10 в миокарде. Показано, что к 20 годам этот показатель достигает максимума, к 40 годам понижается на 30%, а к 60 годам - на 50% [2]. Таким образом, при максимальном уровне КоQ10 в 3-месячном возрасте наиболее ярко проявляются его антиоксидантные свойства у животных всех групп независимо от источника жира в рационе. Содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) - было наивысшим у 1-месячных крыс, особенно в группах, содержащихся на рыбьем жире и льняном масле (соответственно 3,19±0,09 и 3,12±0,07). Однако у 3-месячных крыс всех групп этот показатель был практически одинаковым.

При увеличении срока пребывания животных на изучаемых рационах до 6 и 12 мес содержание ДК в сыворотке крови и печени повышалось у крыс во всех группах, причем наименьшим оно было у животных 3-й и 4-й групп. Следует отметить, что в рационах крыс этих групп жировой компонент обладает большей ненасыщенностью (ИПО - 148 и 126 соответственно), и именно у этих животных содержание ДК в сыворотке крови было наименьшим, особенно у крыс 4-й группы (1,49±0,04; в контроле - 2,18±0,06). Очевидно, это связано с наибольшим содержанием КоQ10 в сыворотке крови крыс данной группы. Содержание вторичных продуктов ПОЛ (ТБК-активных) в сыворотке крови 1-месячных животных было наименьшим у крыс 2-й и 4-й групп. У 3-месячных животных всех групп этот показатель уменьшался, а концентрации КоQ10 в сыворотке крови была, напротив, максимальной. К 6 и 12 мес содержание ТБК-активных продуктов в сыворотке крови крыс различных групп было практически одинаковым; исключение составляли животные контрольной группы, у которых содержание ТБК-активных продуктов было наивысшим (в 6 мес - 10,70±0,12 нмоль МДА/мл, в 12 мес - 11,66±0,15 нмоль МДА/мл) на фоне высокого содержания в рационе ПНЖК семейства ω-6.

В табл. 2 представлены данные о содержании ПНЖК ω-3 в печени животных и содержании ТБК-активных продуктов в зависимости от продолжительности опыта. Видно, что содержание ПНЖК семейства ω-3, как и ИПО, у животных 3-й и 4-й групп были наибольшими в сроке 3 мес. С увеличением срока пребывания животных на экспериментальных рационах до 6 мес оно уменьшалось примерно вдвое (у животных 3-й группы - с 26,1 до 11,0%, 4-й группы - с 23,4 до 14,8%), что свидетельствует об усиленном метаболизме этих кислот. В то же время в эти сроки исследования содержание ПНЖК ω-6 в печени животных этих групп практически не изменялось. К 12-месячному пребыванию крыс на используемых нами рационах (табл. 3) содержание ПНЖК ω-3 в печени изменилось незначительно по сравнению с 6 мес, а семейства ω-6 - возросло.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов и коэнзима Q10 в сыворотке крови крыс на различных рационах в зависимости от продолжительности эксперимента КоQ10, мкг/мл ТБК-акт. продукты, нмоль МДА/мл ДК, усл. ед/мл

ИПО и содержание ТБК-активных продуктов в печени 3-месячных животных были наивысшими (соответственно 144 и 314,74 нмоль МДА/г ткани) при содержании на рыбьем жире. Увеличение срока эксперимента до 6 мес приводило к уменьшению содержания в печени животных ТБК-активных продуктов во всех группах крыс что, очевидно, напрямую связано с ИПО в органе, т.е. понижением потенциальных субстратов ПОЛ. Иными словами, более длительное пребывание животных на рационах с различными источниками жира нивелировало содержание продуктов ПОЛ в печени, что может быть связано с влиянием КоQ10, проявляющего свои антиоксидантные свойства и тормозящего в организме процессы ПОЛ.

В табл. 4 представлены данные о содержании свободных ЖК в сыворотке крови животных. Видно, что у 3-месячных животных 3-й и 4-й групп отмечено увеличение содержания свободных ЖК по сравнению с контролем, причем эти показатели были наивысшими за период всего эксперимента. Увеличение у крыс пула плазменных свободных ЖК в 3-месячном возрасте напрямую связано с самым высоким за весь период наблюдения содержанием в печени ПНЖК семейства ω-3 (см. табл. 2). Увеличенное содержание в печени ЖК этого семейств, очевидно, способствует компенсаторному синтезу эндогенных ЖК, а также поддержанию в печени необходимого уровня ПНЖК семейства ω-6. С увеличением времени пребывания на рационах содержание свободных ЖК уменьшается; достоверных различий между группами не отмечено.

Полученные данные свидетельствуют о том, что включение в состав используемых нами экспериментальных рационов различных источников жира (насыщенные жиры, жиры с преобладанием ПНЖК семейств ω-3 или ω-6) не вызывает у животных даже при длительном их пребывании на этих рационах существенных изменений в индукции ПОЛ.

Однако в 3-месячном возрасте в сыворотке крови животных всех групп отмечено наивысшее содержание КоQ10 и наименьшее продуктов ПОЛ (ДК и ТБК-активных). Это говорит о наиболее сильном проявлении антиоксидантных свойств КоQ10 в самом активном для животных возрасте. При этом высокий антиоксидантный потенциал КоQ10 сохранялся у 3- и 6-месячных животных, получавших рационы с пальмовым и льняным маслом (см. рисунок, а-г). В то же время содержание ТБК-активных продуктов в печени животных всех исследуемых групп напрямую зависело от степени ненасыщенности жирных кислот, используемых в рационах и отражалось в изменениях показателя ИПО. Этот показатель, определяющий способность ЖК к образованию перекисей, может использоваться для оценки потенциальных субстратов ПОЛ как при проведении экспериментальных исследований, так и при создании жировых композиций с заданным составом ЖК.

Таблица 2. Индекс перекисного окисления, содержание полиненасыщенных жирных кислот семейства ω-3 и ТБК-активных продуктов (нмоль МДА/г ткани) в печени крыс в зависимости от длительности эксперимента

Таблица 3. Содержание полиненасыщенных жирных кислот семейств ω-3 и ω-6, ТБК-активных продуктов (нмоль МДА/г ткани) и показателя ИПО в печени крыс после 12 мес пребывания на рационах

Таблица 4. Содержание свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс (мкмоль/л) в зависимости от длительности эксперимента

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. // Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 41-43.

2. Аронов Д.М. // Рус. мед. журн. - 2007. -Т. 15, № 20. - С. 1484-1489.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - С. 704.

4. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. // Лаб. дело. - 1989. - № 3. - С. 33-35.

5. Прохоров М.Ю., Тиунов М.П., Шакалис Д.А. // Лаб. дело. - 1977. - № 9. - С. 535-536.

6. Руководство Р. 1.1672-03 // Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - С. 240.

7. Шаранова Н.Э., Батурина В.А., Васильев А.В., Гаппаров М.М.Г. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 151, № 6. - С. 624-627.

8. Boelsma E., Hendriks H.F., Roza L. // Am. J. Clin. Nutr. - 2001. - Vol. 73. - P. 853-864.

9. Christeff N., Homo-Delarche F., Thobie N. et al. // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. - 1994. - N 51. - P. 12 5 -13 1.

10. Cosgrove J.P. ,Church D.F., Pryor W.A. // Lipids. - 1987. - N 22. - P. 299-304.

11. Herbert K.E. ,Wills E.D. // Biochem. Soc. Trans. - 1987. - Vol. 51. - P. 410-441.

12. Ibrahim W., Lee U.S., Yeh C.C. et al. // J. Nutr. - 1997. - Vol. 127, N 7. - P. 1401-1406.

13. Ohkawa H., Onishi Y., Yagi K. // Anal. Biochem. - 1979. - Vol. 95. - P. 351-358.

14. Piche L.A., Draper H.H., Colf P.D. // Lipids. - 1988. - Vol. 23. - P. 370-371.

15. Simopolos A.P. // Am. J. Clin. Nutr. - 1999. - N 70 (suppl.). - P. 560-569.

16. Thies F., Garry J.M. // Lancet. - 2003. - Vol. 8, N 361. - P. 47 7- 4 8 5 .

17. Tres A., Bou R., Codony R. et al. // J. Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56, N 16. - P. 7243-7272.