Development of biotechnology of fermented milk product with Lactobacillus reuteri LR1 and the evaluation of its functional property in experiment in vitro and in vivo

Abstract

In this article the biotechnology of the dairy product based on the probiotic strain of Lactobacillus reuteri LR1 is presented. The following conditions of milk fermentation were screened: fermentation by monoculture of Lactobacillus reuteri LR1, fermentation by monoculture of Lactobacillus reuteri LR1 with addition of yeast extract as growth-promoting factor, and combined fermentation by Lactobacillus reuteri LR1, Lactobacillus helveticus NK1 and Streptococcus thermophilus (HTC). It had been demonstrated that after 8 hours of cultivation the number of Lactobacillus reuteri LR1 cells in the monoculture with introduced yeast extract was up to 5,9x108 CFU/cm3 whereas cell count for the monoculture without yeast extract introduction was 1,6x107 CFU/cm3. The optimized biotechnological parameters of the dairy product fermentation, which provided the required Lactobacillus reuteri LR1 cell count, were as follows: Lactobacillus reuteri LR1 starter dosage of 6%, HTC starter dosage of 3-4%, fermentation temperature of 37±1 °C, and fermentation duration of 6 hours. The developed product possessed an apparent antagonistic activity against test-cultures of such pathogenic and opportunistic microorganisms as E. coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Klebsiella pneumoniae. The survival of the test-cultures cultivated with the obtained dairy product on the first cultivation day was from 36 to 46% and on the second - from 8 to 20%, in comparison with the pure test-cultures. The investigation of the functional properties of the obtained dairy product was carried out by the single -factor experiment with the albino Wistar rat-stock (initial body weight 160±10 g, n=10 in each group). Its positive effect on the rats' microbiome composition and lipid exchange indices has been demonstrated. It had been shown that the administration of the obtained dairy product in the rats' diet (5 ml per day per os) during 30 days didn't cause any abnormalities in the health status and behavior of the laboratory animals of spf-category. The number and distribution of leucocytes and lymphocytes, and granulocytes in all rats' populations (intact, control and treatment) were within the normal range. Upon the introduction of the developed dairy product into the rats' diet, the increased levels of bifidobacteria, lactic acid bacteria and typical for normal rats' microflora enterobacteria were observed in the rats' microbiome. As for the biochemical indices that characterize rats' lipid metabolism, the rats consuming fermented dairy products (control and treatment) demonstrated statistically significant reduction of blood serum cholesterol level compared to the intact rat group; additionally the rats consuming the developed in this study dairy product (treatment) demonstrated statistically significant reduction of blood serum triglyceride level compared to the intact rats. Utilized in this study Lactobacillus reuteri LR1 is the first strain that was purified in Russia and characterized as useful for manufacturing of the probiotic food products, since currently only Lactobacillus reuteri strains of foreign origin can be seen on the market.

Keywords:Lactobacillus reuteri LR1, Lactobacillus helveticus NK1, Streptococcus thermophilus, growth-promoting factor, combined cultivation, technological parameters, extent of survival, functional food

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (5): 52-62. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10053. (in Russian)

В настоящее время молочные заводы выпускают большое количество кисломолочных продуктов с пробиотиками (бифидобактериями, ацидофильны­ми молочнокислыми палочками, пропионовокислыми бактериями, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei и др.), которые являются представителями нормальной кишечной микрофлоры человека. Для увеличения объ­ема производства кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами перспективны представляются поиск новых пробиотических штаммов и разработка на их основе продуктов функционального назначения [1, 2]. Одним из таких штаммов является Lactobacillus reuteri.

L. reuteri - это вид гетероферментативных молоч­нокислых бактерий, которые присутствуют в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) человека и животных и считаются одними из немногих истинно аутохтонных видов лактобацилл, присущих человеку. L. reuteri был выделен из фецес человека и идентифицирован как L. fermentum Biotyp 11 [3]. Впоследствии был переклас­сифицирован и назван L. reuteri на основе детально изученного типа муреина клеточной стенки, ДНК-гомо­логии и G+C содержания [4]. L. reuteri развивается при температуре 45 °С, но не развивается при 15 °С, оптимальная температура роста составляет 35-38 °С и активная кислотность 6,0-6,8 ед. рН. L. reuteri фермен­тирует глюкозу, фруктозу, арабинозу, рибозу, сукрозу, раффинозу и глюконат. Клеточная стенка бактерий не содержит тейхоиновой кислоты и муреин лизин-D-изоаспарагинового типа.

Такие штаммы L. reuteri, как DSM 17938, ATCC 55730, ATCC PTA 6475, наряду с другими представителями лактобацилл широко используются для профилактики и комплексного лечения не только некоторых гастроэн­терологических заболеваний (хеликобактериоз, синд­ром раздраженного кишечника и др.) [5-7], но и таких, как нозокомиальная пневмония [8, 9], метаболический синдром и опосредованные с ним сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, диабет и др. [10, 11]. В послед­нее время все большее количество исследований пос­вящено изучению влияния микрофлоры ЖКТ на работу центральной нервной системы. Так, хроническое воспа­ление и/или иммунная активация ЖКТ, которые лежат в основе этиологии синдрома раздраженного кишечника и в первую очередь связаны с нарушением нормального состава микробиома кишечника, являются фактором риска при расстройствах центральной нервной системы, таких как депрессия, нервная анорексия, обсессивно-компульсивное расстройство и аутизм [12, 13].

Клинические испытания показали, что прием L. reuteri безопасен как для детей, так и для взрослых, обеспе­чивает нормализацию микробиома кишечника у чело­века, достоверно снижает частоту и тяжесть диареи различной этиологии, снижает частоту возникновения инфекций и воспаления ЖКТ [14-18]. Являясь кисло­тоустойчивыми, они сохраняются в желудке дольше прочих бактерий, выживая в больших количествах (80%) в желудке в течение 2 ч.

Штамм L. reuteri LR1 был выделен в 2014 г. из фецес человека, идентифицирован современными методами в ФГАНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности" и показана его антагонистическая активность в отношении многих па­тогенных микроорганизмов, в том числе характеризу­ющихся множественной устойчивостью к антибиоти­кам [19]. Штамм лактобацилл данного вида является первым, выделенным в России и охарактеризованным как пригодный для производства пробиотических пи­щевых продуктов, поскольку до сих пор в составе таких продуктов используются штаммы зарубежного производства.

Цель настоящей работы - установить технологичес­кие параметры производства кисломолочного продукта с использованием L. reuteri LR1 и L. helveticus NK1 при совместном культивировании и исследовать функцио­нальные свойства разработанного продукта.

Материал и методы

Для восстановления культуры L. reuteri LR1 исполь­зовали среду МРС (MRS) жидкую, культивировали при температуре 37±1°С в анаэробных условиях. Культи­вирование всех образцов проводили на приборе па­раллельных биореакторов (DAS GIP, Германия) при температуре 37±1°С с автоматическим измерением активной кислотности. Отбирали пробы через каждые 2 ч от начала культивирования.

Влияние дрожжевого экстракта пищевого качества как ростового фактора на изменение активной кис­лотности штамма L. reuteri LR1 в процессе культиви­рования определяли инокулированием 6% закваски в стерилизованное обезжиренное молоко и в стерили­зованное обезжиренное молоко с добавлением 0,2% дрожжевого экстракта и выдерживанием в течение 24 ч при температуре 37±1 °С. Процент внесения инокулята L. reuteri LR1 и температура его культивирования были выбраны на основании ранее проведенных исследова­ний [20]. Количество вносимого инокулята L. helveticus NK1 и Streptococcus thermophilus (ХТС) варьировали от 1 до 6%. Внесение L. reuteri LR1 во всех опытах составляло 6%.

Количество клеток L. reuteri LR1 при совместном культивировании с ХТС определяли методом предель­ных разведений в среде гидролизатно-молочной среде ГМК-1 и MRS-агаре с добавлением ампициллина в коли­честве 2 мг/дм3 среды и культивировании посевов в ана­эробных условиях в течение 3-5 дней при температуре 37±1 °С [21]. Колонии, выросшие на ГМК-1 и MRS-агаре c добавлением ампициллина, микроскопировали и про­водили морфологическую оценку принадлежности кле­ток к L. reuteri. Количество клеток ХТС определяли методом предельных разведений в стерильном обез­жиренном молоке при температуре 37±1 °С в течение 3-5 дней по ГОСТ 33951-2016.

Исследования по определению антагонистической активности разработанного продукта по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре прово­дили методом развивающихся смешанных популяций в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10 [22]. В качестве тест-штаммов были выбраны вероцитотоксигенный штамм Escherichia coli АТСС 25922, антибиотикорезистентный штамм Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus АТСС 6538, полученные из коллекции ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России, и возбудитель внутрибольничных инфекций антибиотикорезистентный штамм Klebsiella pneumoniae, полученный из Национального медицин­ского исследовательского центра трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова.

Статистическую обработку данных проводили по результатам 3-4 повторностей, построение графи­ков, диаграмм и таблиц с применением программ Statistica 10 и Microsoft Office 2010.

Исследования по определению функциональных свойств разработанного кисломолочного продукта про­водили в условиях однофакторного эксперимента на белых крысах линии Вистар на базе экспериментальной клиники-лаборатории биологически активных веществ животного происхождения в ФГБНУ "Федеральный на­учный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова".

Исследования проводили на клинически здоровых сексуально наивных животных spf-категории, полу­ченных из НПП "Питомник лабораторных животных" филиала ФГБУН "Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН(Пущино, Россия), случайным образом отобранных, инди­видуально промаркированных и прошедших адаптацию на протяжении 5 сут, с исходной массой тела 160±10 г.

На протяжении периода адаптации и в течение экс­перимента животных содержали в системе индивиду­ально вентилируемых клеток [в составе вентиляцион­ного блока VENT II и стеллажа с клетками типа Bio A.S. (EHRET, Германия), при оптимальном микроклимате в каждой отдельной клетке: температуре (22±3) °С, влажности 50-60%, освещении 12/12 - световой день с 6.00 до 18.00].

Животные были произвольно распределены на группы по 10 крыс: животные 1-й группы (интактные) на про­тяжении всего эксперимента потребляли стандартный рацион вивария (ОРВ) - полнорационный комбикорм по ТУ 9296-002-70941247 ("Лабораторкорм", Россия); крысам 2-й группы (контрольные) дополнительно к ОРВ вводили кисломолочный продукт, сквашенный с использованием закваски Str. thermophilus "Контроль"; животным 3-й груп­пы (опытные) дополнительно к ОРВ вводили кисломолоч­ный продукт, сквашенный с использованием закваски L. reuteri LR1, Str. thermophilus и L. helveticus NK1 - "Опыт".

На протяжении всего срока проведения исследований экспериментальные животные получали изокалорий-ные (400 ккал/100 г сухого корма) полноценные рационы (табл. 1, 2).

В сутки животные всех экспериментальных групп по­требляли по 29 г ОРВ (116 ккал). Животные в контроль­ной и опытной группах получали рационы, состоящие из комбикорма и исследуемых кисломолочных продук­тов, которые скармливали в дополнение в количестве по 5 мл на голову (2 ккал) в сутки. Таким образом, доля кисломолочного продукта составила 14,7% от массы корма в сутки. Исследуемые продукты вводили живот­ным индивидуально, ежедневно per os.

Животные на протяжении эксперимента потребляли корм и воду ad libitum. Питьевую воду для поения лабораторных животных получали на установке водоподготовки EMD Millipore RiOs™ 50 (Merck Millipore, Германия). Минерализацию воды осуществляли путем добавления в нее минеральных солей для получе­ния физиологически полноценного минерального со­става (минерализация 314-382 мг/л: гидрокарбонаты -144-180, хлориды - 60-76, кальций - 6, магний - 3, натрий - 50-58, калий - 50-58). Температура воды для поения составляла 10-12 °С.

Содержание, питание, уход за животными, манипуля­ции, выведение их из эксперимента осуществляли в со­ответствии с требованиями приказа Минздрава России от 1.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил надлежа­щей лабораторной практики", Международными прави­лами гуманного обращения с животными - Директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей.

До начала исследования, каждые 4-е сутки и накануне эвтаназии животных взвешивали на электронных техни­ческих весах Ohaus (Adventurer Pro, США). По окончании эксперимента животных усыпляли в камере для эвтана­зии (VetTech, Великобритания) с помощью углекислого газа.

Патологоанатомическое исследование включало осмотр внешней поверхности тела, всех отверстий, внутричерепной, грудной и брюшной полостей и их содержимого. Печень, почки, селезенка, сердце всех животных были надлежащим образом отделены от всехприлегающих тканей и взвешены во влажном состоя­нии, сразу после вскрытия во избежание высыхания, на электронных технических весах Ohaus (Adventurer Pro, США).

Содержание лимфоцитов (LYM), гранулоцитов (GRA) и моноцитов (MON) определяли на проточном цитометре Guava EasyCyte (Merck Millipore, Германия) посредством детектирования размера и гранулярности клеток. Со­держание лейкоцитов определяли расчетным путем по формуле:

WBC = LYM + GRA + MON.

Относительное содержание лимфоцитов, гранулоцитов и моноцитов определяли расчетным путем по формулам: LYM/WBCx100%, GRA/WBCx100%, MON/ WBCx100%.

Биохимические исследования проводили на полуав­томатическом биохимическом анализаторе BioChem FC-360 (HTI, США), используя наборы реактивов (High Technology, США). В крови животных определяли кон­центрацию общего белка, альбумина, глюкозы, креатинина, холестерина, триглицеридов.

Для количественного учета групп микроорганизмов навеску из фекалий крыс массой 1 г вносили в регене­рированный агаризованный (0,1%) тиогликолево-фосфатный буфер, в соотношении 1:10. Из этой суспензии готовили последовательные 10-кратные разведения, которые вносили в соответствующие питательные среды.

Бифидобактерии в фекальных массах животных опре­деляли на среде TOS-MUP агар (TOS пропионатный агар с мупироцином лития); лактобациллы - на среде МРС (MRS); энтеробактерии - на среде Эндо и цитратном агаре. Содержание стафилококков определяли на желточно-солевом агаре, с последующим определением плазмокоагулирующей активности; энтерококков - на среде МИС (молочно-ингибиторная среда); дрожжей и плесневых грибов - на среде Сабуро. Содержание микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы фекалий.

Статистический анализ проводили с использова­нием программы Statistica 10. Результаты представляли в виде "среднее значение ± ошибка среднего" (M±m). Статистическую достоверность оценивали с примене­нием однопараметрического ANOVA-теста с примене­нием критерия Тьюки (при уровне значимости 0,05).

Результаты и обсуждение

Разработка биотехнологии кисломолочного продукта с использованием пробиотического штамма Lactobacillus reuteri LR1

Результаты предварительных опытов по культивиро­ванию L. reuteri LR1 на молоке показали, что данный штамм обладает низкой кислотообразующей и протеолитической активностью, что согласуется и с данными литературы [23]. В связи с этим с целью интенсификации роста исследуемого штамма были поставлены опыты по накоплению клеток исследуемого штамма на сте­рилизованном молоке и на стерилизованном молоке с добавлением дрожжевого экстракта (рис. 1).

Добавление дрожжевого экстракта к молоку способс­твовало развитию и накоплению клеток L. reuteri LR1, что свидетельствует о целесообразности использования дрожжевого экстракта как добавки в молоко для при­готовления производственной закваски или продукта на основе чистой культуры L. reuteri LR1.

В центральной лаборатории микробиологии ФГАНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности" были проведены иссле­дования по разработке биотехнологии бактериального концентрата L. reuteri LR1 и бактериального концент­рата ассоциации штаммов L. reuteri LR1 и L. helveticus NK1. Отечественными и зарубежными исследовате­лями давно отмечено, что совместное культивирование слабого кислотообразователя с более сильным оказы­вает стимулирующий эффект на рост и размножение первой культуры [23, 24]. Было высказано множес­тво предположений по этому поводу, и одним из них было, что вторая культура в процессе своей жизнеде­ятельности расщепляет или синтезирует определенные вещества, которые необходимы для развития более слабой культуры. Разработанная 2-штаммовая ассо­циация показала хорошие технологические свойства, но не всегда по органолептическим показателям (вкусу и консистенции) обеспечивала выход продукции тре­буемого качества. В связи с этим при дальнейшей разработке технологии кисломолочного продукта на основе L. reuteri LR1 были выбраны 2 культуры -Str. thermophilus и L. helveticus NK1, которые обладают более сильными протеолитическими системами, уско­ряя процесс сквашивания молока и улучшая органолептические показатели продукта, такие как консистенцияи вкус. Был проведен ряд опытов по сокультивированию L. reuteri LR1 и композиции L. helveticus NK1 с Str. thermophilus (ХТС).

Инокулят ХТС получали культивированием 1% ком­позиции (L. helveticus NK1 с Str. thermophilus) в стерили­зованном молоке, инокулят L. reuteri LR1 готовили на стерильном обезжиренном молоке с добавлением дрож­жевого экстракта в количестве 0,2%, культивирование инокулятов проводили при температуре 37±1 °С.

Исследовали влияние закваски ХТС на развитие кле­ток L. reuteri LR1 в процессе сокультивирования на обез­жиренном молоке, для чего одновременно производили инокуляцию закваски ХТС и L. reuteri LR1.

На рис. 2 показаны результаты эксперимента по оценке влияния дозы инокулята ХТС на развитие L. re-uteri LR1 в процессе их совместного культивирования.

Представленные логарифмические кривые роста L. reuteri LR1 показывают практически одинаковую тен­денцию роста штамма в процессе сокультивирования с закваской ХТС: через 4 и 6 ч содержание клеток L. reuteri LR1 находится в одном lg-диапазоне неза­висимо от дозы ХТС, а через 8 ч количество клеток L. reuteri LR1 изменялось следующим образом: 3% ХТС -3,3x108 КОЕ/см3, 4% ХТС - 1,5x108 КОЕ/см3, 5% ХТС - 8,9x107 КОЕ/см3.

Анализ полученных данных показал, что после 8 ч сов­местного культивирования увеличение дозы инокулята ХТС не способствовало увеличению количества клеток L. reuteri LR1.

Присутствие и размножение 2-штаммовой закваски ХТС в среде обеспечивает стимулирующий эффект на развитие пробиотического штамма. Но, с другой сто­роны, большое содержание этих клеток может оказы­вать конкурентное действие и ингибирующий эффект на пробиотический штамм из-за резкого понижения активной кислотности питательной среды. Наибольший прирост клеток L. reuteri LR1 наблюдался через 8 ч куль­тивирования и составил при 3% ХТС - 25,9%, при 4% ХТС - 21,2%, при 5% ХТС - 18,0%.

Данные по изменению значений активной кислотности среды и количества клеток ХТС в процессе сокультивирования представлены на рис. 3.

Как видно из представленных данных, кривые кислотообразования для всех образцов одинаковы, активная кислотность достигает значения 4,6 ед. рН через 5 ч культивирования, а более активное развитие клеток наблюдается при внесении 4 и 5% инокулята ХТС. На­ибольшее содержание клеток было отмечено после 6 ч культивирования при внесении 4% инокулята ХТС и составляло 7x108 КОЕ/см3.

Для того чтобы выбрать оптимальное технологическое решение производства кисломолочного продукта, обес­печивающего высокое содержание клеток L. reuteri LR1, данные проведенных исследований были обобщенны и статистически обработаны (табл. 3).

Как видно из данных, приведенных в табл. 3, сокультивирование пробиотического штамма L. reuteri LR1 с закваской ХТС стимулирует рост L. reuteri LR1, повы­шая количество клеток в продукте.

При выборе момента прекращения сквашивания молока заквасочными культурами одним из важных критериев является значение активной кислотности сквашенного продукта. Для кисломолочного продукта, вырабатываемого на основе закваски ХТС, оптимальным уровнем активной кислотности является 4,6±0,1 ед. рН. Этому требованию отвечает 6 ч культивирования при внесении инокулятов L. reuteri LR1 и ХТС 4,5 ед. рН (см. рис. 2). Но следует также отметить, что при внесе­нии инокулятов L. reuteri LR1 и ХТС через 8 ч культи­вирования имеет место максимальный прирост клеток L. reuteri LR1.

Оценка функциональных свойств разработанного продукта

Одним из показателей, характеризующих функцио­нальные свойства разработанного кисломолочного продукта, является его антагонистическая активность к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. На рис. 4 представлены результаты эксперимента по определению антагонистической активности разрабо­танного продукта на основе закваски L. reuteri LR1 и ХТС по отношению к условно-патогенным и патоген­ным E. coli АТСС 25922, Salmonella typhimurium, S. aureus АТСС 6538, Kl. pneumoniae.

Как показали проведенные исследования (см. рис. 4), разработанный продукт обладает выраженной антаго­нистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Степень выжи­вания исходной численности тест-культур при совмест­ном культивировании с продуктом по сравнению с раз­витием чистой тест-культуры на 1-е сутки изменялась в диапазоне от 36 до 46%, а на 2-е сутки - от 8 до 20%.

Воздействие образцов разработанного кисломолочного продукта на основе лактобактерий на нормальную мик­рофлору кишечника крыс оценивали в условиях in vivo.

Состояние животных до начала эксперимента нахо­дилось в пределах физиологической нормы. Крысы активно поедали корм: имело место полное потреб­ление исследуемых образцов, как контрольных, так и опытных. Сохранность животных на протяжении эк­сперимента была 100%. Наблюдения за животными в течение 30 дней кормления изучаемыми кисломолоч­ными продуктами свидетельствовали о том, что откло­нений в состоянии здоровья и поведении крыс не от­мечалось. Добавление разработанного и контрольного продуктов положительным образом сказывалось на усвоении корма. У крыс, потреблявших с рационом кис­ломолочные продукты "Опыт" и "Контроль", прибавка массы тела была выше показателя интактных животных (на 11 и 6% соответственно), хотя калорийность рацио­нов интактных, опытных и контрольных крыс различа­лась незначительно (2 ккал).

Изучение видового состава и количественных уровней основных микробных популяций микробиома кишеч­ника крыс и их функциональной активности показало положительное влияние продукта на основе закваски L. reuteri LR1 и ХТС, проявляющееся в повышении об­щего числа анаэробных бактерий, уровней защитных популяций лактобактерий и энтеробактерий, а также в снижении численности условно-патогенной микро­флоры, что может быть связано с действием пробиотиков, входящих в состав продукта (табл. 4).

Благоприятное воздействие кисломолочных про­дуктов было характерно для продукта "Опыт". Так, у животных опытной группы условно-патогенные микро­организмы (коагулазоположительные стафилококки, дрожжи) не обнаруживались.

У животных всех групп содержание лейкоцитов и лимфоцитов, гранулоцитов и их распределение по популяциям находилось в пределах физиологической нормы (табл. 5). У крыс, получавших кисломолочный продукт "Опыт", по сравнению с показателями интактных животных наблюдалось снижение содержания лейкоцитов и лимфоцитов на 37,7 и 33,5%, однако не достигшее уровня статистической значимости. При этом у крыс контрольной и опытной групп выявлено статисти­чески значимое снижение содержания гранулоцитов на 42,2 и 61,8% соответственно по сравнению с показате­лем интактых крыс (см. табл. 5).

У животных всех групп гематологические показатели, характеризующие функциональное состояние эритро­цитов и тромбоцитов, находились в пределах физио­логической нормы - значимых отклонений между груп­пами не отмечено.

При биохимическом исследовании крови животных (табл. 6) установлено, что содержание общего белка, альбумина и креатинина, билирубина и глюкозы было в пределах нормы.

Со стороны биохимических показателей, характери­зующих липидный обмен, у крыс, потреблявших кисломолочные продукты, выявлено статистически значимое снижение концентрации холестерина в сыворотке крови, а у животных, получавших разработанный продукт, -и концентрации триглицеридов относительно показате­лей интактных животных. В настоящее время хорошо известны гипохолестеринемические свойства пробиотиков, подтвержденные как экспериментами in vivo, так и клиническими исследованиями [27]. В том числе пока­зано, что потребление крысами сквашенного с исполь­зованием штамма L. reuteri LR6 молока на фоне диеты с повышенным содержанием холестерина приводило к значительному снижению концентрации общего холес­терина и триглицеридов в сыворотке крови животных [28]. Тем не менее наличие у различных пробиотических культур гипохолестеринемической активности является штамм-специфичной характеристикой [29].

В целом показано, что исследуемые кисломолочные продукты при введении их в рацион не вызывают откло­нений в состоянии здоровья и поведении лабораторных животных spf-категории.

Заключение

Обобщая результаты всех апробированных комбина­ций была разработана биотехнология кисломолочного продукта с заквасочными культурами L. reuteri LR1 и ХТС: доза инокулята L. reuteri LR1 - 6%, ХТС - 3-4%, темпера­тура сквашивания - 37±1 °С, продолжительность скваши­вания - 6 ч. Количество клеток ХТС в продукте - не менее 1х107 КОЕ/см3 и содержание пробиотического штамма L. reuteri LR1 в 1 см3 продукта не ниже 106 КОЕ/см3.

Разработанный продукт обладает выраженной анта­гонистической активностью по отношению к условно-па­тогенным и патогенным микроорганизмам - E. coli АТСС 25922, Salmonella typhimurium, S. aureus АТСС 6538, Kl. pneumoniae.

Проведенный комплекс исследований по доклиничес­кому изучению функциональных свойств разработан­ного кисломолочного продукта свидетельствует о на­личии у него нормализующего эффекта на микробиоту и ряд показателей липидного обмена.

При введении в рацион экспериментальных живот­ных разработанного продукта в составе микробиоты кишечника крыс увеличилось содержание бифидо- и лактобактерий, а также энтеробактерий, типичных для нормофлоры крыс, в сыворотке крови снижалась концентрация холестерина и триглицеридов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутс­твии конфликта интересов.

Исследования выполнены при частичной (в части оценки функциональных свойств) финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 16-16-00094).

Литература

1. Shangpliang H.N.J., Sharma S., Rai R., Tamang J.P. Some technolog­ical properties of lactic acid bacteria isolated from Dahi and Datshi, naturally fermented milk products of Bhutan // Front. Microbiol. 2017. Vol. 8. P. 116. doi: 10.3389/fmicb.2017.00116.

2. Marco M.L., Heeney D., Binda S., Cifelli C.J., Cotter P.D., Foligne B. et al. Health benefits of fermented foods: microbiota and beyond // Curr. Opin. Biotechnol. 2017. Vol. 44. P. 94-102.

3. Lerche M., Reuter G. Das Vorkommen aerobwachsender grampositiver Stabchen des Genus Lactobacillus Beijerinck im Darminhalt erwachsener Menschen (Gleichzeitig ein Beitrag zur genaueren Kenntnis der aeroben Laktobazillen) // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. I Orig. 1962. Bd 185. S. 446-481.

4. Kandler O., Stetter K.O., Kohl R. Lactobacillus reuteri sp. nov., a new species of heterofermentative lactobacilli // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. I Orig. Reihe C. 1980. Bd 1. S. 264-269.

5. Sanchez B., Delgado S., Blanco-Miguez A., Lourenco A., Gueimonde M., Margolles A. Probiotics, gut microbiota, and their influence on host health and disease // Mol. Nutr. Food Res. 2017. Vol. 61, N 1. Article ID 1600240. doi: 10.1002/mnfr.201600240.

6. Bron P.A., Kleerebezem M., Brummer R.-J., Cani P.D., Mercenier A., MacDonald T.T. et al. Can probiotics modulate human disease by impacting intestinal barrier function? // Br. J. Nutr. 2017. Vol. 117. P. 93-107. doi: 10.1017/S0007114516004037.

7. Bird A.S., Gregory P.J., Jalloh M.A., Cochrane Z.R., Hein D.J. Probiotics for the treatment of infantile colic: a systematic review // J. Pharm. Pract. 2017. Vol. 30, N 3. P. 366-374.

8. Rojas M.A., Lozano J.M., Rojas M.X., Rodriguez V.A., Rondon M.A., Bastidas J.A. et al., Prophylactic probiotics to prevent death and nosocomial infection in preterm infants // Pediatrics. 2012. Vol. 130, N 5. P. e1113-e1120.

9. Cook D.J., Johnstone J., Marshall J.C., Lauzier F., Thabane L., Mehta S. et al. Probiotics: Prevention of Severe Pneumonia and Endotracheal Colonization Trial - PROSPECT: a pilot trial // Trials. 2016. Vol. 17. P. 377. doi: 10.1186/s13063-016-1495-x.

10. Zoumpopoulou G., Pot B., Tsakalidou E., Papadimitriou K. Dairy probiotics: beyond the role of promoting gut and immune health // Int. Dairy J. 2017. Vol. 67. P. 46-60.

11. Tonucci L.B., Olbrich dos Santos K.M., de Oliveira L.L., Ribeiro S.M.R., Martino H.S.D. Clinical application of probiotics in type 2 diabetes mellitus: a randomized, double-blind, placebo-controlled study // Clin. Nutr. 2017. Vol. 36. P. 85-92.

12. Toribio-Mateas M. Harnessing the power of microbiome assessment tools as part of neuroprotective nutrition and lifestyle medicine interventions // Microorganisms. 2018. Vol. 6. P. 35. doi: 10.3390/ microorganisms6020035.

13. Foster J.A., Rinaman L., Cryan J.F. Stress & the gut-brain axis: regulation by the microbiome // Neurobiol. Stress. 2017. Vol. 7. P. 124-136.

14. Szajewska H., Urbanska M., Chmielewska A., Weizman Z., Shamir R. Meta-analysis: Lactobacillus reuteri strain DSM 17938 (and the original strain ATCC 55730) for treating acute gastroenteri­tis in children // Benef. Microbes. 2015. Vol. 5, N 3. P. 285­293.

15. Chau K., Lau E., Greenberg S., Jacobson S., Yazdani-Brojeni P., Verma N. et al. Probiotics for infantile colic: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial investigating Lactobacillus reuteri DSM 17938 // J. Pediatr. 2015. Vol. 166, N 1. P. 74-78.

16. Mobini R., Tremaroli V., Stahlman M., Karlsson F., Levin M., Ljung-berg M. et al. Metabolic effects of Lactobacillus reuteri DSM 17938 in people with type 2 diabetes: a randomized controlled trial // Dia­betes Obes. Metab. 2017. Vol. 19, N 4. P. 579-589.

17. Francavilla R., Polimeno L., Demichina A., Maurogiovanni G., Principi B., Scaccianoce G. et al. Lactobacillus reuteri strain combination in Helicobacter pylori infection: a randomized, double-blind, pla­cebo-controlled study // J. Clin. Gastroenterol. 2014. Vol. 48, N 5. P. 407-413. doi: 10.1097/MCG.0000000000000007.

18. Jadresin O., Hojsak I., Misak Z., Kekez A.J., Trbojevic T., Ivkovic L. et al. Lactobacillus reuteri DSM 17938 in the treatment of func­tional abdominal pain in children: RCT study // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2017. Vol. 64, N 6. P. 925-929. doi: 10.1097/MPG. 0000000000001478.

19. Fedorova T.V., Vasina D.V., Begunova A.V., Rozhkova I.V., Ras-koshnaya T.A., Gabrielyan N.I. Antagonistic Activity of Lactic Acid Bacteria Lactobacillus spp. against Clinical Isolates of Klebsiella pneumoniae // Appl. Biochem. Microbiol. 2018. Vol. 54, N 3. P. 277­287.

20. Раскошная Т.А., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Бегунова А.В. Разработка режимов культивирования L. reuteri для получения бактериального концентрата клеток // Техника и технология пищевых производств. 2016. № 3. С. 56-63.

21. Бегунова А.В., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Раскошная Т.А. Динамика размножения L. reuteri и L. helveticus // Мол. пром-сть. 2017. № 9. С. 47-48.

22. МУ 2.3.2.2789-10 "Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов".

23. Karlsson M. Evaluation of Lactobacillus reuteri DSM17938 as starter in cheese production // NY002 Agricultural Programme - Food Sci­ence 270 HEC, Second cycle, A2E. Uppsala : SLU, Dept. of Microbiol­ogy, 2013.

24. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Бегунова А.В., Раскошная Т.А., Ширшова Т.И. Ассоциация пробиотических культур L. reuteri и L. helveticus для разработки бактериального концентрата // Мол. пром-сть. 2017. 10. С. 60-61.

25. Clinical Laboratory Parameteres for Rats. Charles River, 2008. 14 p.

26. Animal Clinical Chemistry: A Practical Handbook for Toxicologist-sand Biomedical Researchers. 2nd ed. / ed. G.O. Evans. A. George Owen and Company/CRC Press, UK, 2009. 368 р.

27. Thushara R.M., Gangadaran S., Solati Z., Moghadasian M.H. Cardio­vascular benefits of probiotics: a review of experimental and clinical studies // Food Funct. 2016. Vol. 7. P. 632-642.

28. Singh T.P., Malik R.K., Katkamwar S.G., Kaur G. Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus reuteri LR6 in rats fed on high-cholesterol diet // Int. J. Food Sci. Nutr. 2015. Vol. 66, N 1. P. 71-75.

29. Ishimwe N., Daliri E.B., Lee B.H., Fang F., Du G. The perspective on cholesterol-lowering mechanisms of probiotics // Mol. Nutr. Food Res. 2015. Vol. 59. P. 94-105. doi: 10.1002/mnfr.201400548.

References

1. Shangpliang H.N.J., Sharma S., Rai R., Tamang J.P. Some technolog­ical properties of lactic acid bacteria isolated from Dahi and Datshi, naturally fermented milk products of Bhutan. Front Microbiol. 2017; 8: 116. doi: 10.3389/fmicb.2017.00116.

2. Marco M.L., Heeney D., Binda S., Cifelli C.J., Cotter P.D., Foligne B., et al. Health benefits of fermented foods: microbiota and beyond. Curr Opin Biotechnol. 2017; 44: 94-102.

3. Lerche M., Reuter G. Das Vorkommen aerobwachsender gram-posi-tiver Stabchen des Genus Lactobacillus Beijerinck im Darminhalt erwachsener Menschen (Gleichzeitig ein Beitrag zur genaueren Kenntnis der aeroben Laktobazillen). Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr. Hyg. I Orig. 1962; 185: 446-81.

4. Kandler O., Stetter K.O., Kohl R. Lactobacillus reuteri sp. nov., a new species of heterofermentative lactobacilli. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. Abt. I Orig. Reihe C. 1980; 1: 264-9.

5. Sanchez B., Delgado S., Blanco-Miguez A., Lourenco A., Gueimonde M., Margolles A. Probiotics, gut microbiota, and their influence on host health and disease. Mol Nutr Food Res. 2017; 61 (1): 1600240. doi: 10.1002/mnfr.201600240.

6. Bron P.A., Kleerebezem M., Brummer R.-J., Cani P.D., Mercenier A., MacDonald T.T., et al. Can probiotics modulate human disease by impacting intestinal barrier function? Br J Nutr. 2017; 117: 93-107. doi: 10.1017/S0007114516004037.

7. Bird A.S., Gregory P.J., Jalloh M.A., Cochrane Z.R., Hein D.J. Probiotics for the treatment of infantile colic: a systematic review. J Pharm Pract. 2017; 30 (3): 366-74.

8. Rojas M.A., Lozano J.M., Rojas M.X., Rodriguez V.A., Rondon M.A., Bastidas J.A., et al., Prophylactic probiotics to prevent death and nosocomial infection in preterm infants. Pediatrics. 2012; 130 (5): e1113-20.

9. Cook D.J., Johnstone J., Marshall J.C., Lauzier F., Thabane L., Mehta S., et al. Probiotics: Prevention of Severe Pneumonia and Endotracheal Colonization Trial - PROSPECT: a pilot trial. Trials. 2016; 17: 377. doi: 10.1186/s13063-016-1495-x.

10. Zoumpopoulou G., Pot B., Tsakalidou E., Papadimitriou K. Dairy probiotics: beyond the role of promoting gut and immune health. Int Dairy J. 2017; 67: 46-60.

11. Tonucci L.B., Olbrich dos Santos K.M., de Oliveira L.L., Ribeiro S.M.R., Martino H.S.D. Clinical application of probiotics in type 2 diabetes mellitus: a randomized, double-blind, placebo-controlled study. Clin Nutr. 2017; 36: 85-92.

12. Toribio-Mateas M. Harnessing the power of microbiome assessment tools as part of neuroprotective nutrition and lifestyle medicine interventions. Microorganisms. 2018; 6: 35. doi: 10.3390/microorganisms6020035.

13. Foster J.A., Rinaman L., Cryan J.F. Stress & the gut-brain axis: regu­lation by the microbiome. Neurobiol Stress. 2017; 7: 124-36.

14. Szajewska H., Urbanska M., Chmielewska A., Weizman Z., Shamir R. Meta-analysis: Lactobacillus reuteri strain DSM 17938 (and the original strain ATCC 55730) for treating acute gastroenteritis in children. Benef Microbes. 2015; 5 (3): 285-93.

15. Chau K., Lau E., Greenberg S., Jacobson S., Yazdani-Brojeni P., Verma N., et al. Probiotics for infantile colic: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial investigating Lactobacillus reuteri DSM 17938. J Pediatr. 2015; 166 (1): 74-8.

16. Mobini R., Tremaroli V., Stahlman M., Karlsson F., Levin M., Ljungberg M., et al. Metabolic effects of Lactobacillus reuteri DSM 17938 in people with type 2 diabetes: a randomized controlled trial. Diabe­tes Obes Metab. 2017; 19 (4): 579-89.

17. Francavilla R., Polimeno L., Demichina A., Maurogiovanni G., Principi B., Scaccianoce G., et al. Lactobacillus reuteri strain combination in Helicobacter pylori infection: a randomized, double-blind, pla­cebo-controlled study. J Clin Gastroenterol. 2014; 48 (5): 407-13. doi: 10.1097/MCG.0000000000000007.

18. Jadresin O., Hojsak I., Misak Z., Kekez A.J., Trbojevic T., Ivkovic L., et al. Lactobacillus reuteri DSM 17938 in the treatment of functional abdominal pain in children: RCT study. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2017; 64 (6): 925-9. doi: 10.1097/MPG.0000000000001478.

19. Fedorova T.V., Vasina D.V., Begunova A.V., Rozhkova I.V., Raskoshnaya T.A., Gabrielyan N.I. Antagonistic Activity of Lactic Acid Bacteria Lactobacillus spp. against Clinical Isolates of Klebsiella pneumo­nia. Appl Biochem Microbiol. 2018; 54 (3): 277-87.

20. Raskoshnaya T.A., Semenikhina V.F., Rozhkova I.V., Begunova A.V. The development of growth medium and Lactobacillus reuteri cul­tivation regimes for bacterial concentrate. Tekhnika i tekhnologiya pischevykh proizvodstv [Technique and Technology of Food Produc­tion]. 2016; 42 (3): 56-62. (in Russian)

21. Begunova A.V., Semenikhina V.F., Rozkhova I.V., Raskoshnaya T.A. Dynamics of L. reuteri and L. helveticus generation. Molochnaya promyshlennost' [Dairy Industry]. 2017; (9): 47-8. (in Russian).

22. MI 2.3.2.2789-10 "Methodological instructions on sanitary-epidemiological evaluation of safety and functional potential of probiotic microorganisms used for food products manufacture".

23. Karlsson M. Evaluation of Lactobacillus reuteri DSM17938 as starter in cheese production. In: NY002 Agricultural Programme - Food Science 270 HEC, Second cycle, A2E. Uppsala: SLU, Dept. of Micro­biology, 2013.

24. Semenikhina V.F., Rozhkova I.V., Begunova A.V., Raskoshnaya T.A., Shirshova T.I. Association of probiotic L. reurteri and L. helveticus cultures for bacterial concentrate development. Molochnaya pro-myshlennost' [Dairy Industry]. 2017; (10): 60-1. (in Russian)

25. Clinical Laboratory Parameteres for Rats. Charles River, 2008: 14 p.

26. Animal Clinical Chemistry: A Practical Handbook for Toxicologistsand Biomedical Researchers. 2nd ed. In: G.O. Evans (ed.). A. George Owen and Company/CRC Press, UK, 2009: 368 р.

27. Thushara R.M., Gangadaran S., Solati Z., Moghadasian M.H. Cardio­vascular benefits of probiotics: a review of experimental and clinical studies. Food Funct. 2016; 7: 632-42.

28. Singh T.P., Malik R.K., Katkamwar S.G., Kaur G. Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus reuteri LR6 in rats fed on high-cholesterol diet. Int J Food Sci Nutr. 2015; 66 (1): 71-5.

29. Ishimwe N., Daliri E.B., Lee B.H., Fang F., Du G. The perspective on cholesterol-lowering mechanisms of probiotics. Mol Nutr Food Res. 2015; 59: 94-105. doi: 10.1002/mnfr.201400548.