Molecular and genetic studies of genetically engineered potato: transformation event PH05-026-0048

Abstract

Expert evaluation of genetically engineered organisms (GMO) identification methods is aimed at confirmation their adequacy with the tool and methodological base used in the institutions of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing to control market turnover and labelling of genetically engineered food. The primer system's specificity was experimentally confirmed in studies with other GM potato lines, as well as with the results of the BLAST-analysis. The efficiency, linearity and correctness of the method meet the requirements of the European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed. Limit of detection and limit of quantification of GM potato line PH05-026-0048 genomic DNA were 0.019% (11 copies of the GM potato genomic DNA) and 0.06% (36 copies of the GM genomic DNA of the potato) per 100 ng of total DNA, respectively.

Keywords:genetically engineered potato, methods of control over genetically engineered organisms, transformation event PH05-026-0048

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 25-31. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10038.

В соответствии с законодательством РФ и Евразий­ского экономического союза (ТР ТС 015/2011, ТР ТС 021/2011, ТР ТС 022/2011, ТР ТС 023/2011, ТР ТС 024/2011, ТР ТС 027/2012, ТР ТС 029/2012, постановле­ние Правительства РФ от 23.09.2013 № 839) пищевая продукция, полученная с использованием генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО), отно­сится к категории новых пищевых продуктов, которая до выхода на рынок проходит процедуру государс­твенной регистрации. В рамках данной процедуры должны быть выполнены молекулярно-генетические исследования и санитарно-эпидемиологическая экс­пертиза ГМО, предназначенных для производства продовольственного сырья и пищевых продуктов [1, 2]. Молекулярно-генетические исследования пре­дусматривают проведение медико-генетической оцен­ки, а также характеристику и оценку специфичности методов идентификации ГМО. Исследования включа­ют BLAST-анализ праймеров и зондов, определение характеристик и показателей точности метода, экспе­риментальное подтверждение специфичности метода в исследованиях с другими ГМО.

Исходя из сложившейся практики контроля основным методом обнаружения, идентификации и количествен­ного определения ГМО является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации. Несмотря на то что для не подвергавшихся технологической переработке пищевых продуктов и продовольственного сырья могут быть использованы иммунологические методы детек­ции специфичных для ГМО белков, универсальность, специфичность и простота ПЦР делают ее методом вы­бора при лабораторных исследованиях.

Генно-инженерно-модифицированный (ГМ) картофель линии PH05-026-0048 содержит в геноме кассеты экс­прессии генов CS-rpi и Ahas, детерминирующих устой­чивость соответственно к фитофторозу и к гербициду имидазолинону. Экспрессию CS-rpi регулируют промо­тор p-rpi и терминатор t-rpi, которые не входят в перечень регуляторных генетических элементов, определяемых в рамках рутинного контроля за ГМО; экспрессию Ahas регулируют промотор pNOS и терминатор tNOS, кото­рые, напротив, могут быть выявлены в процессе скри-нинговых лабораторных исследований пищевой продук­ции. Таким образом, обнаружение ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 на основании детекции маркерных регу-ляторных элементов не представляет проблемы, однако метод идентификации трансформационного события и количественного определения этого ГМО в настоящее время не входит в список утвержденных в Российской Федерации.

Цель настоящей работы - подтверждение харак­теристик, определенных для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, что необходимо для внедрения данного метода в прак­тику надзорной службы.

Материал и методы

Исследования проведены с использованием сертифи­цированных стандартных образцов (Сertified Reference Material, CRM) ERM-BF435a (0% ГМО, немодифицированный картофель) и ERM-BF435b (100% ГМ-картофель линии PH05-026-0048).

Метод идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, основанный на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan® PCR, позволяет определять содержание рекомбинантной ДНК относительно общей ДНК картофеля, присутствующей в образце. Протокол ПЦР разработан и валидирован European Commission Joint Research Centre [3].

Идентификация трансформационного события вы­полнена с использованием пары праймеров, один из них расположен внутри перенесенной генетичес­кой конструкции, другой - в области геномной ДНК картофеля, прилегающей к трансгенной вставке, и олигонуклеотидного зонда с репортерным флуорес­центным красителем FAM (6-карбоксифлуоресцеин) на 5'-конце и гасителем BHQ1, относящемся к семейс­тву красителей Black Hole Quenchers, - на 3'-конце (табл. 1) [3].

Для обнаружения целевого (референсного) гена кар­тофеля (гена fru, кодирующего β-фруктозидазу) исполь­зовали пару ген-специфичных праймеров и зонд, мечен­ный FAM на 5'-конце, и BHQ1 - на 3'-конце [3].

Праймеры и зонды синтезированы Научно-производс­твенной компанией (НПК) "Синтол" (РФ). ПЦР-РВ проводили с использованием аналога 2x TaqMan Universal PCR Master Mix - 2,5x реакционной смеси для ПЦР-РВ в присутствии референсного красителя ROX (НПК "Синтол", РФ), содержащего праймеры и зонды в концентра­циях, указанных в табл. 2.

Для выделения ДНК применяли модифицирован­ный метод щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии ("Promega", США) [4]. Пригодность полученных препаратов ДНК для ампли­фикации при последующей ПЦР подтверждали методом ПЦР по [5].

Для постановки ПЦР использовали амплификатор CFX96TM Real-Time PCR System ("Bio-Rad", США) (табл. 3). Продукты ПЦР анализировали путем их детекции в режиме реального времени. Полученные данные об­рабатывали с помощью пакета CFX ManagerTM Software, версия 1.6 ("Bio-Rad", США).

Проверку специфичности праймерной системы для выявления генетической мишени в трансформационном событии РН05-026-0048 проводили с помощью качес­твенного анализа методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени по технологии TaqMan на препара­тах ДНК ГМ-картофеля линии PH05-026-0048, а также других ГМ-линий картофеля: ЕН92-527-1 (CRM, ERM-BF421b), AV43-6-G7 (CRM, ERM-BF431e) и традиционного аналога (CRM, ERM-BF435a). В качестве отрицательного контроля использовали пробу без ДНК-матрицы.

Анализ нуклеотидных последовательностей праймеров относительно референсного генома картофеля Solanum tuberosum проводили с помощью онлайн-сервиса BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [6] базы данных GenBank, алгоритм BLASTN.

Относительное количество ГМ-картофеля PH05-026-0048 определяли на основании калибровочной кривой (график зависимости логарифма % концентрации от ве­личины для каждой калибровочной точки), для по­строения которой использовали стандарты - контроль­ные растворы с известным содержанием ДНК картофеля.

Эффективность, линейность, правильность, прецизи­онность, предел обнаружения и диапазон применения метода оценивали по результатам независимой троек­ратной амплификации.

Результаты и обсуждение

Специфичность праймерной системы для идентифи­кации трансформационного события PH05-026-0048 методом ПЦР-РВ экспериментально подтверждена в ис­следованиях с другими ГМ-линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа. Данные анализа продук­тов ПЦР с ГМ-специфичными и таксон-специфичными праймерами представлены на рис. 1 и в табл. 4.

Появление продукта ПЦР в реакции с праймерами, специфичными для конкретного трансформационного события, подтверждает присутствие в анализируемом образце искомой генетической конструкции, соответс­твующей линии PH05-026-0048, при этом отсутствие продукта ПЦР в реакциях с другими ГМ-линиями карто­феля свидетельствует о специфичности данной праймерной системы.

Результаты определения относительного количества ГМ-картофеля линии PH05-026-0048 с помощью калиб­ровочной кривой представлены на рис. 2 и в табл. 5.

Как видно из табл. 5, значения систематической ошибки (bias, systematic error) лежат в интервале зна­чений ±25% для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, что говорит о близости полученных результатов к истинному зна­чению. Кроме того, значения относительного стан­дартного отклонения (relative within laboratory standard deviation - RSDr) для каждого стандартного образца, полученные в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, также нахо­дятся в допустимом интервале значений ≤25%.

Для определения диапазона применения метода [интервала между наибольшей и наименьшей концен­трациями (количествами) определяемого вещества в образце (включая эти концентрации), при котором ана­литическая методика имеет приемлемый уровень пре­цизионности, правильности и линейности] для построе­ния калибровочной кривой использовали стандартные растворы с содержанием ГМ-картофеля РН05-026-0048 от 0,1 до 50% (рис. 3).

Как показано на рис. 3, в диапазоне рабочих концен­траций угол наклона стандартной кривой составляет -3,392, коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) равен 0,99, эффективность амплификации состав­ляет 90,7%. Полученные результаты подтверждают пря­мую пропорциональную зависимость аналитического сигнала от количества определяемого вещества в об­разце и, соответственно, линейность метода.

Предел обнаружения геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048, представляющий собой наименьшее количество определяемого аналита в образце, которое может быть обнаружено с использованием данного метода, составляет 0,019%, или 11 копий геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr≤25%. Предел количествен­ного обнаружения, представляющий собой наименьшее количество аналита в образце, которое можно количес­твенно определить с надлежащим уровнем достовер­ности и точности, составляет 0,06%, или 36 копий геном­ной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr≤25% (рис. 4).

Эффективность, линейность и правильность метода соответствуют требованиям Международной лаборато­рии Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed). Согласно полученным данным при всех трех независимых амплификациях значение коэффициента корреляции линейной регрессии (R2) было выше 0,98, а угол наклона стандартной кривой, получен­ной методом линейной регрессии, лежал в допустимых пределах (от -3,1 до -3,6). Результаты представлены в табл. 6.

Относительные стандартные отклонения результатов отдельных определений, полученные в условиях повто­ряемости (RSDr) для каждого стандартного образца внутри диапазона применения данного метода, пред­ставлены в табл. 7.

Результаты независимых индивидуальных испытаний представлены в табл. 8.

Как видно из табл. 8, относительное стандартное отклонение для каждого стандартного образца, по­лученное в условиях повторяемости при выполнении испытаний в одинаковых рабочих условиях, находилось в допустимом интервале значений <25%.

Таким образом, результаты проведенных исследова­ний подтвердили характеристики, определенные для количественного метода идентификации ГМ-картофеля линии PH05-026-0048. Высокая специфичность праймеров, специфичность, линейность и точность метода свидетельствуют о его надежности и пригодности для обеспечения эффективного надзора за обращением ГМ-картофеля в Российской Федерации.

Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Рос­сийского научного фонда (проект № 16-16-04123).

Литература

1. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения : методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М. : Федераль­ный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.

2. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками : методические указания (МУ 2.3.2.3388-16). М. : Федеральный центр гигиены и эпидеми­ологии Роспотребнадзора, 2016. 30 с.

3. The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank material (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014.

4. Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Сухачева М.В. и др. Выделение ДНК из различных пищевых продуктов с помощью модифи­цированного щелочного метода // Биотехнология. 2009. № 2. С. 83-90.

5. ГОСТ Р ИСО 21571-2014. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кис­лот. М. : Стандартинформ, 2016. 41 с.

6. GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (дата обра­щения 4.06.2018).

References

1. Methodical Guidelines 2.3.2.2306-07 "Medical and biological safety assessment of genetically modified organisms of plant origin*. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2008: 21 p. (in Russian)

2. Methodical Guidelines 2.3.2.3388-16 "Medical and biological safety assessment of stacked genetically modified organisms of plant origin". Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; 2016: 30 p. (in Russian)

3. The certification of a PH05-026-0048 potato tuber powder for its identity (ERM®-BF435b) and the certification of a blank material (ERM®-BF435a). European Commission Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements. 2014.

4. Bulygina E.S., Kolganova T.V., Sukhacheva M.V., et al. DNA extrac­tion from different food products using the modified alkaline method. Biotechnologiya [Biotechnology]. 2009; (2): 83-90. (in Rus­sian)

5. GOST R ISO 21571-2014 [ISO 21571:2005]. Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived prod­ucts. Nucleic acid extraction. Moscow: Standartinform, 2016: 41 p. (in Russian)

6. GenBank. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. (date of access June 04, 2018)