Investigation of lignans and anthocyanins as the main biologically active polyphenols of Schizandra chinensis fruits

Abstract

For the first time the content and composition of dibenzocyclooctadiene lignans and anthocyanins in 10 samples of Chinese magnolia-vine fruits (Schizandra chinensis) collected in the Moscow Region, Khabarovsk and Primorsky Krai were studied. The determination of the profile of lignans was carried out according to the our original HPLC technique with diode-array spectrophotometric and mass spectrometric detection. The validation of the methodology for linearity, accuracy and precision was carried out. 11 characteristic for Schizandra chinensis lignans were found in all samples. In dried fruits the main lignan was schisandrine, in fresh-frozen fruits - angeloylgomizin O. The total content of lignans in fresh-frozen fruits was 5.50 mg/g, in dried fruits - from 12.50 to 18.95 mg/g. Anthocyanins of Chinese magnolia-vine were mainly represented by cyanidin glycosides, among which cyanidin-3-xylosylrutinoside was predominated. The total content of anthocyanins determined by pH-differential spectrophotometry was from 0.21 mg/g in fresh-frozen fruits to 0.35-0.72 mg/g in dried fruits. The results obtained can be used to identify and standardize the fruits of Chinese magnolia- vine and the products of their processing.

Keywords:chinese magnolia-vine, lignans, anthocyanins, high performance liquid chromatography, mass spectrometry

Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 3. С. 79-87.

Плоды лимонника китайского [Schizandra chinensis (Turcz.) Baill.] - вьющейся листопадной лианы семейс­тва лимонниковые (Schizandraceae) - являются бога­тым источником биологически активных веществ (БАВ). Наряду с использованием плодов лимонника (Fructus Schizandrae) в качестве лекарственного растительного сырья их также употребляют в пищу в виде соков, пюре, варенья, джемов и настоек. Сок лимонника применяют для винного букетирования. В качестве вкусоароматического ингредиента плоды лимонника добавляют в чай. Сушеные плоды и экстракты лимонника используют при производстве специализированных пищевых продуктов, в том числе для питания спортсменов.

В результате ряда фитохимических исследований из плодов лимонника были выделены и идентифициро­ваны различные БАВ, такие как лигнаны, полисахариды, флавоноиды, в частности антоцианины, эфирные масла, органические кислоты, витамины [1]. Основной и наибо­лее характеристической группой БАВ для растений се­мейства лимонниковые являются лигнаны. В растениях рода лимонник присутствуют 5 классов лигнанов: дибензоциклооктадиеновые (тип А), спиробензофураноидные дибензоциклооктадиеновые (тип В), 4-арилтетралино-вые (тип С), 2,3-диметил-1,4-диарилбутановые (тип D) и 2,5-диарилтетрагидрофурановые (тип Е) [2]. Однако наибольшей биологической активностью обладают дибензоцикооктадиеновые лигнаны (рис. 1), которые в свою очередь могут подразделяться на 2 типа в за­висимости от стереоструктуры: R- или S-бифенильной конфигурации. Кроме того, циклооктеновые кольца этих лигнанов представлены в виде конформаций твист-ванна-кресло или твист-ванна. Множество хиральных особенностей и стереоизомеров приводит к образова­нию очень сложных структур соединений данного типа.

Фармакологические исследования показали, что экс­тракты и настойки лимонника оказывают гепатопротекторное, антиоксидантное, нейропротекторное, неспеци­фическое общеукрепляющее (адаптогенное) действие, повышают остроту зрения, особенно ночного [1-3]. В случае использования плодов лимонника китайского значимый вклад в биологическую активность вносят антоцианины, наличие которых также является одним из критериев подлинности [4].

Цель данной работы - определение содержания и со­става основных дибензоциклооктадиеновых лигнанов и антоцианинов плодов лимонника китайского.

Материал и методы

Изучено 10 образцов плодов лимонника китайского, произрастающих в Московской области и Дальневос­точном регионе (табл. 1).

Профиль лигнанов и антоцианинов в лимоннике ис­следовали c использованием системы жидкостной хро­матографии Agilent 1100 ("Agilent Technologies", США), оснащенной дегазатором, бинарным насосом, термо­статом колонок, термостатируемым автосамплером, спектрофотометрическим диодно-матричным детекто­ром (ДМД) и времяпролетным масс-селективным детек­тором Agilent 6210 LC/MS-TOF (ВЭЖХ-МС-TOF). Суммар­ное содержание антоцианинов определяли с помощью спектрофотометра Shimadzu 1800 ("Shimadzu", Япония) с диапазоном длин волн 190-1100 нм.

Для определения содержания и состава лигнанов была разработана оригинальная ВЭЖХ-методика с ДМД и МС. Условия ВЭЖХ: колонка ProteCol C18 НРН125 250x4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза: 0,1% раствор мура­вьиной кислоты (А), ацетонитрил (В); линейный гради­ент: 0 мин - 50% В, 50 мин - 95% В, 51-60 мин - 50% В; скорость потока растворителя 0,5 см3/мин, температура колонки 25 °С, температура автосамплера 20 °С, объем вводимой пробы 10 мм3; детектирование при λ=254 нм и λ=235 нм. Спектры снимали в диапазоне от 190 до 400 нм. Параметры масс-спектрометрии: напряжение на капилляре - 3,5 кВ, поток газа-осушителя (азот) - 9 дм3/мин, температура - 325 °С, давление на рас­пылителе - 0,27 МПа, сканирование масс - в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне от 100 до 1500 m/z.

Подготовка проб: около 3,0 г измельченных заморо­женных плодов лимонника или около 1,0 г измельченных сушеных плодов лимонника помещали в круглодонную колбу объемом 100 см3, добавляли 80 см3 70% этанола и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Затем обрабатывали на ультразвуковой (УЗ) бане Codyson CD-4820 ("Shenzhen Codyson Electrical Co., Ltd.", Китай) при комнатной тем­пературе в течение 5 мин, охлаждали до комнатной температуры, перемещали в мерную колбу объемом 100 см3, доводили объем 70% этанолом. 1,5-2 см3 из­влечения помещали в центрифужную пробирку и цент­рифугировали на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5424 ("Eppendorf", Германия) при 15 000 об./мин в течение 10 мин.

Количественную оценку содержания лигнанов в пло­дах лимонника осуществляли методом внешнего стан­дарта.

Стандартный раствор схизандрина (схизандрол А, ≥98,0%, "ZHONGXIN INNOVA®", Китай) (0,98 мг/см3) готовили в метаноле, помещая на 3 мин в УЗ-баню. Рабочие растворы получали путем разбавления в 2, 10, 100 и 1000 раз. Все растворы хранили в холодильнике при температуре +4 °С.

Суммарное содержание мономерных антоцианинов определяли рН-дифференциальным методом, под­готовку проб осуществляли по методике, описанной ранее [5]. Профиль антоцианинов определяли по разра­ботанной нами ранее методике [6].

Результаты и обсуждение

Лигнаны

В исследованных образцах обнаружено более 20 ин­дивидуальных лигнанов, среди которых выделяют 11 ос­новных и наиболее характеристичных лигнанов (рис. 2), по содержанию которых фармакопейный вид лимонника Schizandra chinensis (Turcz.) Baill. (Bei-Wuweizi, северный лимонник) можно отличить от нефармакопейного вида Schizandra sphenanthera Rehd. et Wils. (Nan-Wuweizi, южный лимонник) [7, 8].

Типичные хроматограммы извлечения из плодов ли­монника китайского изображены на рис. 3.

Номера пиков 11 основных лигнанов и ангелоилгомизина О на хроматограмме соответствуют их номерам в табл. 2 и на рис. 3.

Времена удерживания, УФ-максимумы и результаты масс-спектрометрического анализа 11 основных лигнанов лимонника представлены в табл. 2.

Были определены некоторые валидационные характе­ристики разработанной методики определения лигнанов.

Линейность. В подобранных хроматографических условиях были трижды введены рабочие растворы схизандрина в 5 концентрациях. Калибровочная кри­вая концентрации схизандрина (мг/см3) от площади пика (мА) имела линейный характер (у=23592х+42,195; RI=0,9999).

Правильность и прецизионность. Для оценки правиль­ности и внутрилабораторной прецизионности методики были проанализированы стандартные растворы схизандрина с низкой (0,0098 мг/см3), средней (0,098 мг/см3) и вы­сокой (0,490 мг/см3) концентрациями и рассчитано отно­сительное стандартное отклонение (RSD). Правильность определяли по результатам 6 параллельных измерений рабочих растворов схизандрина. Среднее значение было использовано для расчета RSD. Промежуточная преци­зионность определялась повторным анализом тех же растворов один раз в день в течение 5 дней.

Относительное стандартное отклонение повторяе­мости для низкой концентрации составило 0,53%, для средней - 0,33%, для высокой - 0,15%. Относительное стандартное отклонение промежуточной прецизион­ности для низкой концентрации было 0,51%, для сред­ней - 0,30%, для высокой - 0,25%.

Результаты исследования содержания схизандрина представлены в табл. 3. Ошибка определения по резуль­татам 3 параллельных исследований для всех лигнанов не превышала 7,2%.

В сушеных плодах лимонника (образцы № 2-10) пре­обладал схизандрин (25,7-37,2% от суммы лигнанов), количество которого варьировало от 3,59 до 6,22 мг/г (см. табл. 3). В свежезамороженных плодах лимонника в качестве основного лигнана был найден ангелоилгомизин О - 1,05 мг/г (24,7% от суммы лигнанов), а содер­жание схизандрина составило 0,99 мг/г (18,0% от суммы лигнанов). Во всех образцах, кроме № 2 и 3, обнару­жено относительно высокое содержание схизандрина В (14,8-24,2% от суммы лигнанов) - 1,05-3,34 мг/г. Все образцы, за исключением образца № 2, отличаются достаточно высоким количеством гомизина А - от 0,39 мг/г в свежих плодах до 0,79-1,98 мг/г в сушеных (4,7-12,9% от суммы лигнанов). К другим мажорным лигнанам относятся схизандрин А, схизандрин С и ангелоилгомизин Н. Схизандрин А был найден в исследо­ванных образцах в количестве 0,26-1,76 мг/г (4,7-9,3% от суммы лигнанов). Относительно высокое содержа­ние схизандрина С отмечено в образцах № 3 и 8-10 -1,11-1,20 мг/г (6,8-8,6% от суммы лигнанов). Наиболее высоким содержанием ангелоилгомизина Н отличались образцы № 5-10 - 0,81-1,09 мг/г (4,6-6,8% от суммы лигнанов).

В умеренных количествах в образцах лимонника об­наружены γ-схизандрин, схизантерин В и гомизин J. В замороженных плодах выявлено 0,24 мг/г γ-схизанд-рина, в сушеных - 0,45-0,77 мг/г. Содержание схизантерина В варьировало от 0,18 мг/г в образце № 1 до 0,43-0,72 мг/г в образцах № 2-10. Количество гоми-зина J в образце № 1 составило 0,10 мг/г, в сушеных образцах - 0,24-0,55 мг/г.

Меньше других основных лигнанов в исследуемых образцах было схизантерина А и гомизина G - 0,05-0,24 и 0,14-0,30 мг/г соответственно.

Суммарное содержание лигнанов в свежих плодах составило 5,50 или 550 мг/100 г, в сушеных - 12,50­18,95 мг/г.

Антоцианины

Впервые был определен профиль индивидуальных антоцианинов плодов лимонника китайского, произ­растающих в Московской области, Хабаровском и Приморском краях. Типичная хроматограмма антоцианинов лимонника изображена на рис. 4. Результаты ВЭЖХ-ДМД-МС антоцианинов лимонника представлены в табл. 4.

Профиль антоцианинов в образцах лимонника отра­жен в табл. 5. Исследуемые образцы имели одинаковый профиль антоцианинов с выраженным преобладанием цианидин-3-ксилозилрутинозида (78,5-87,5% от общего содержания антоциановых пигментов) и в замороженных, и в сушеных плодах. Среди минорных антоцианинов идентифицированы 3-латирозид-5-глюкозиды, 3,5-диглю-козиды, 3-латирозид-5-ксилозиды, и 3-латирозиды цианидина, а также 3-рутинозиды цианидина и пеларгонидина.

Суммарное содержание антоцианинов в свежезамо­роженных плодах лимонника (образец № 1) составило 0,21 мг/г, что соответствует их содержанию в пло­дах лимонника китайского, заготовленного в Китае, -0,15-0,23 мг/г [9, 10], в высушенных плодах - от 0,35 до 0,72 мг/г.

Заключение

Полученные данные о количестве и профиле лигнанов и антоцианинов могут быть использованы при хемотаксономической идентификации и стандартизации плодов лимонника китайского, а также для оценки био­логической ценности лимонника в качестве сырья для производства специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище.

Финансирование. Исследование выполнено при фи­нансовой поддержке Российского научного фонда (про­ект № 14-36-00041).

Литература

1. Hwang D.Y. Chapter 20. Therapeutic effects of lignans and blend isolated from Schisandra chinesis on hepatic carcinoma // Recent Advances in Theories and Practice of Chinese Medicine / ed. H. Kuang. 2012. P. 389-402.

2. Panossian A., Wikman G. Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: an overview of Russian research and uses in medicine // J. Ethnopharmacol. 2008. Vol. 118. P. 183-212.

3. Szopa A., Ekiert R., Ekiert H. Current knowledge of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (Chinese magnolia vine) as a medicinal plant species: a review on the bioactive components, pharmacological properties, analytical and biotechnological studies // Phytochem. Rev. 2017. Vol. 16. P. 195-218.

4. Jo S.-H., Ha K.-S., Moon K.-S. et al. In vitro and in vivo anti-hyper-glycemic effects of omija (Schizandra chinensis) fruit // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 1359-1370.

5. Перова И.Б., Жогова А.А., Черкашин А.В., Эллер К.И., Раменская Г.В., Самылина И.А. Биологически активные вещества плодов калины обыкновенной // Хим.-фарм. журн. 2014. Т. 48, № 5. С. 32-39.

6. Перова И.Б., Жогова А.А., Полякова А.В., Эллер К.И., Раменская Г.В., Самылина И.А. Биологически активные вещества кизи­ла (Cornus mas L.) // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 5. С. 86-93.

7. American Herbal Pharmacopoeia. Schisandra Berry, Shisandra Chinensis. Analytical, Quality Control, and Therapeutic Monograph / ed. R. Upton. Santa Crus, 1999. P. 1-23.

8. Lu Y., Chen D.-F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera // J. Chromatogr. A. 2009. Vol. 1216. P. 1980-1990.

9. Ma C., Yang L., Yang F. et al. Content and color stability of anthocyanins isolated from Schisandra chinensis fruit // Int. J. Mol. Sci. 2012. Vol. 13. P. 14 294-14 310.

10. Wu X., Yu X., Jing H. Optimization of phenolic antioxidant extraction from Wuweizi (Schisandra chinensis) pulp using random-centroid optimazation methodology // Int. J. Mol. Sci. 2011. Vol. 12. P. 6255-6266.