The study of the metabolism of iodotyrosines included in the iodized milk protein in rats

Abstract

In the course of evolution in animals and humans, a complex and effective system for providing the body with iodine in the form of various organic and inorganic compounds was developed. The metabolism of inorganic iodine has been studied quite well, in contrast to the mechanism of assimilation of its organic compounds. Among the latter, iodotyrosines, which are part of iodinated milk proteins, are of particular interest. To distinguish the peculiarities of the biotransformation of iodotyrosines in the animals' organism, their concentration and the concentration of tyrosine in blood plasma of rats after single administration of iodinated milk proteins were determined. For comparison, in parallel a group of animals received potassium iodide. The tested preparations were administered intragastrically with a probe in the form of aqueous solutions at a dose equivalent to 30 iodine per 1 kg of body weight. The level of mono - and diiodotyrosine in rat blood plasma was determined by HPLC with a mass spectrometer detector. The tyrosine content was determined on an automatic amino acid analyzer. The registration of the indices was carried out before the administration and 1, 4 and 24 hours after the administration of the substances. In the course of the conducted studies it was found that when iodinated milk proteins are once administered, a significant increase in the concentrations of monoiodotyrosine and diiodotyrosine is observed. The maximum level of iodinated amino acids, exceeding the control values by more than 6 fold, was recorded 4 hours after the ingestion of iodine-containing organic compounds into the body. At the same time interval, an increase in the concentration of tyrosine was observed in one of the experimental groups receiving iodinated milk protein. The simultaneous presence of tyrosine and its iodinated derivatives in blood plasma may indicate that monoiodotyrosine and diiodotyrosine are capable of being absorbed into the systemic bloodstream without metabolic transformations in the liver. Under introduction of potassium iodide, an increase in blood plasma concentration of monoiodotyrosine by 35% compared to the control was observed only after 24 hours, which may be a consequence of the activation of the thyroid gland due to the intake of an increased amount of iodine.

Keywords:iodine, milk iodinated protein, metabolism of iodotyrosines, rats

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (3): 12-17. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10026.

Уровень обеспечения организма человека и живот­ных поступающими с пищей биологически актив­ными веществами оказывает выраженное влияние на его метаболический и физиологический статус [1-3]. Общеизвестна роль йода в синтезе тироксина и трийодтиронина, а также зависимость образования этих гормонов щитовидной железы от снабжения организма йодом [4-8]. Соединения йода, которые могут служить источниками этого микроэлемента для организма, можно разделить на вещества неоргани­ческой природы, диссоциирующие с образованием йодид- и йодат-ионов, и органические соединения, в которых йод связан ковалентно с органической матрицей, чаще всего с аминокислотами, например с тирозином [9]. В ходе эволюции у животных и чело­века выработалась сложная и эффективная система по обеспечению организма йодом [10-13]. Считается, что в щитовидную железу йод может поступать толь­ко в форме йодид-иона, поскольку именно за счет окисления йодида в более реакционно-способную форму происходит йодирование тирозиновых остат­ков в молекуле тиреоглобулина [14]. Ковалентно свя­занный йод, поступая через пищеварительный тракт в печень, под действием ферментов отщепляется от органического носителя и в виде йодида поступает в системный кровоток и в щитовидную железу [9]. Данное утверждение основано на том, что печень спо­собна метаболизировать йодсодержащие соединения путем дейодирования [15]. Однако щитовидная желе­за также содержит микросомальную дегалогеназу, которая катализирует дейодирование моно- и дийодтирозина, образующихся при протеолизе тиреоглобулина [16, 17]. Таким образом, высказываемое многими исследователями мнение о главной регулирующей роли дегалогеназ печени в усвоении и метаболиз­ме органического йода сильно упрощено и спорно. Для правильного понимания процесса обмена органи­ческого йода в организме животных и человека необходимо проведение исследований для уточнения основ­ных физиолого-биохимических механизмов усвоения и метаболизма ковалентно связанного йода.

Цель данной работы - сравнительное изучение в опытах на крысах метаболизма йодтирозинов, вхо­дящих в состав йодированных молочных белков либо образующихся при введении йодида калия.

Материал и методы

При выполнении работы были использованы экс­периментальный йодированный молочный белок (ЭБ) (ООО "Фонд развития науки", РФ) [18], йодирован­ный молочный белок "Йодказеин" (ЙК) (ООО "НПК Медбиофарм", РФ) [19], а также йодид калия (ПАО "НПО "Йодобром", РФ). В ЭБ матрицей для йодиро­вания выступают сывороточные белки, в ЙК - казеин. Основной ароматической аминокислотой, вступающей с йодом в реакцию замещения, при производстве обоих йодированных молочных белков является тирозин. Гидроксил тирозина, связанный с ароматическим кольцом, представляет собой сильнейший орто-пара-ориентант, особенно в щелочной среде. Валентные электроны атома кислорода оказываются частично рассредоточен­ными в орто-положения бензольного ядра, и тем самым создаются условия для прохождения реакции электрофильного замещения. Йод встраивается в молекулу тирозина, образуя прочную связь с углеродом, и одно­временно приобретает положительную степень окис­ления Результатом взаимодействия йодирующего агента с тирозином является образование как моно-, так и дийодпроизводного (монойодтирозин и дийодтирозин соответственно).

Проведенное исследование структуры и подлинности йодированных молочных белков подтвердили наличие в их составе моно- и дийодтирозинов. Характеристика йодированных молочных белков представлена в табл. 1.

Исследование проведено на крысах линии Вистар возрастом 8-10 нед, полученных из лицензированного источника (филиал "Андреевка" ФГБНУ "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА России). Поступив­ших животных до начала эксперимента содержали в те­чение 5 дней в карантинной комнате для адаптации при групповом содержании в клетках. Содержание грызунов и все манипуляции с ними проводили в условиях вивария ФГБНУ "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН с учетом существующих эти­ческих норм и правил в строгом соответствии с протоколом исследований и действующей нормативной документацией [20-22]. Животных размещали группами по 6 особей в пластиковых клетках ("TECNIPLAST", Ита­лия) тип IV S на подстилке из мелкой древесной стружки при свободном доступе к воде и пище. Для кормления использовали стандартный полнорационный комбикорм по ГОСТ Р 50258 (ООО "Лабораторкорм", РФ). В качес­тве питья крысы получали водопроводную воду. Корм и воду животные получали ad libitum.

После прохождения карантина животных произвольно распределяли на 4 группы: 1-я группа состояла из интактных крыс (n=16); 2-я группа состояла из крыс (n=12), которым вводили ЭБ; 3-я группа состояла из крыс (n=12), которым вводили ЙК; крысам (n=12) 4-й группы вводили йодид калия. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно зондом в виде водных растворов однократно. Дозировки составили для ЭБ - 1500 мкг/кг; для ЙК -429 мкг/кг; для йодида калия - 39 мкг/кг, что соответс­твует 30 мкг йода на 1 кг массы тела (эквивалент 300 мкг йода в сутки для человека средней массой тела 60 кг с учетом коэффициента межвидового переноса доз, равного 6). После введения препаратов животные под­вергались пищевой депривации не более чем на 24 ч.

Перед введением исследуемых образцов, через 1, 4 и 24 ч после введения по 4 животных из каждой группы подвергали эвтаназии в СО2-камере ("VetTech", Ве­ликобритания) и отбирали биологический материал. Плазму крови для определения йодтирозинов хранили при -30 С°. Содержание моно- и дийодтирозина в плазме крови крыс определяли методом высокоэффетивной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором по ГОСТ 33422-2015 [23]; содержание тирозина определяли на автоматическом аминокис­лотном анализаторе LC 3000 ("Eppendorf - Biotronilc", Германия).

Результаты исследований обрабатывали пара­метрическими методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента для несвязан­ных совокупностей [24]. Для расчета достоверности различий двух выборок при уровне значимости р<0,05 определяли среднее арифметическое (M), среднее квадратичное отклонение (σ), коэффициент вариации (V), среднюю ошибку средней арифметической (m).

Результаты и обсуждение

Метаболизм аминокислот в организме животных на­чинается с их высвобождения из белков пищи в ходе протеолиза последних в желудочно-кишечном тракте. Свободные аминокислоты быстро всасываются в ки­шечнике, попадают в портальную систему и, следова­тельно, в печень [19].

Возможно 2 пути пресистемного метаболизма йодтирозинов, образующихся при протеолизе йодированных молочных белков. Первый путь связан с дейодированием йодтирозинов под действием дегалогеназ печени с образованием тирозина и йодид иона. Второй путь предполагает поступление в системный кровоток не­измененных моно- и дийодтирозина. В первом случае с течением времени в крови должна увеличиваться кон­центрация только тирозина, во втором - будет расти кон­центрация как тирозина (поскольку он входит в состав йодированных молочных белков), так и йодтирозинов.

С целью установления особенностей биотрансформа­ции йодтирозинов при первичном прохождении печени определяли их концентрацию, а также концентрацию ти­розина в плазме крови крыс после однократного введе­ния йодированных белков. Для сравнения параллельно животные 4-й группы получали йодид калия. Результаты представлены в табл. 2.

Проведенная оценка содержания моно-, дийодтирозина и тирозина в плазме крови крыс контрольной группы в течение 24 ч не выявила значимых измене­ний концентрации указанных аминокислот в различные временные интервалы, что свидетельствует об относи­тельно постоянном уровне данных соединений в крови животных.

Из данных табл. 2 видно, что через 1 ч после введения препаратов наблюдалось увеличение по сравнению с контролем концентрации монойодтирозина в крови крыс только 3-й группы (на 40,8%), уровни дийодтирозина и тирозина у всех опытных животных были сопоста­вимы с показателями крыс контрольной группы.

Через 4 ч после введения исследуемых субстан­ций концентрация монойодтирозина у животных 2-й группы выросла в 8,6 раза, 3-й группы - в 6,9 раза, в 4-й группе не изменилась. Концентрация дийодтирозина увеличилась только у крыс 2-й группы (в 7,1 раза). В 3-й группе, хотя и наблюдалось уве­личение концентрации дийодтирозина, значимых от­личий не установлено. Уровень тирозина изменился в сторону увеличения только у животных 2-й группы (на 28%), у животных других групп он соответствовал контролю.

Через 24 ч после однократного введения йодирован­ных белков концентрация монойодтирозина у животных 2-й и 3-й групп хотя и снизилась по сравнению с пока­зателем после 4 ч, по-прежнему превышала контроль­ный уровень в 3,6 и 3,2 раза соответственно. Выше контрольного значения был уровень монойодтирозина и в 4-й группе на 35,3%. Концентрация дийодтирозина у крыс 2-й группы уменьшилась по отношению к 4 ч, но все равно была выше, чем в контроле, в 3,9 раза. В 3-й и 4-й группах по этому показателю различий с контролем не установлено. Содержание тирозина было одинаково во всех экспериментальных группах.

Анализ полученных данных показывает, что введение в организм животных ЭБ приводит к значительному уве­личению концентрации в крови как монойодтирозина, так и дийодтирозина. Более высокая концентрация в плазме монойодтирозина по сравнению с дийодтирозином соответствует содержанию аминокислот в йодиро­ванном белке: 1,32% монойодтирозина и 0,64% дийодтирозина. Максимальная концентрация йодированных аминокислот (из зафиксированных) была установлена через 4 ч после поступления в организм животных ЭБ. В этот же временной интервал наблюдается увеличение концентрации тирозина. Эти данные согласуются с тем, что время переваривания сывороточных белков молока составляет 2-3 ч. Соответственно, по истечении этого времени концентрация аминокислот в крови будет мак­симальной, а затем начнет снижаться, что и подтверж­дается полученными результатами. Одновременное при­сутствие в плазме крови тирозина и его йодированных производных может свидетельствовать о том, что моно- и дийодтирозин способны поступать в системный крово­ток без метаболических превращений в печени.

При введении животным ЙК в плазме крови наблю­дался рост концентрации только монойодтирозина. Ка­зеин переваривается дольше, чем сывороточные белки: время переваривания казеина составляет порядка 6 ч. Измерение показателей осуществлялось через 1, 4 и 24 ч после приема йодированного белка, что, возможно, не позволило зафиксировать изменения концентрации тирозина и дийодтирозина. Можно предположить, что монойодтирозин, находясь на поверхности белковой молекулы, легче и быстрее высвобождается из состава белка. Наличие в крови монойодтирозина в высокой концентрации подтверждает возможность поступления в системный кровоток йодированных аминокислот.

Некоторое увеличение в крови концентрации монойодтирозина через 24 ч после введения йодида калия можно объяснить более активным синтезом тиреоидных гормонов после поступления повышенного количества йода в виде йодид-иона в щитовидную железу. Моно- и дийодтирозины образуются в железе при протеолизе тиреоглобулина и могут поступать в кровоток вместе с гормонами.

Таким образом, в ходе проведенных исследований ус­тановлено, что при однократном введении йодированных молочных белков, содержащих йодированные амино­кислоты, в плазме крови крыс значительно повышаются концентрации моно- и дийодтирозина. Это свидетельс­твует о том, что йодтирозины при первом прохождении через печень могут не подвергаться биотрансформации и поступать в системный кровоток в неизмененном виде. Данные, полученные в настоящем исследовании, расши­ряют имеющиеся представления о путях пресистемного метаболизма органических соединений йода.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутс­твии конфликта интересов.

Литература

1. Kim H.J., Kim N.K., Park H.K. et al. Strong association of relatively low and extremely excessive iodine intakes with thyroid cancer in an iodinereplete area // Eur. J. Nutr. 2017. Vol. 56, N 3. P. 965-971. doi:10.1007/ s00394-015-1144-2.

2. Коденцова В.М., Вржесинская О.А. Анализ отечественного и международного опыта использования обогащенных витаминами пищевых продуктов // Вопр. питания. 2016. № 2. С. 31-50.

3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Рисник Д.В., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы // Вопр. питания. 2017. Т. 86, № 4. С. 113-124.

4. Bost M., Martin A., Orgiazzi J. Iodine deficiency: epidemiology and nutri­tional prevention // Trace Elem. Med. 2014. Vol. 15, N 4. P. 3-7.

5. Carvalho D.P., Dupuy C. Thyroid hormone biosynthesis and release // Mol. Cell. Endocrinol. 2017. Vol. 458. P. 6-15.

6. Di Jeso B., Arvan P. Thyroglobulin from molecular and cellular biology to clinical endocrinology // Endocr. Rev. 2016. Vol. 37, N 1. P. 2-36. doi: 10.1210/er.2015-1090.

7. Targovnik H.M, Citterio C.E, Rivolta C.M. Iodide handling disorders (NIS, TPO, TG, IYD) // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2017. Vol. 31, N 2. P. 195-212. doi: 10.1016/j.beem.2017.03.006. Epub 2017 Apr 4.

8. WHO. World Health Organization, United Nations Children's Fund &International Council for the Control of Iodine Deficiency Disor­ders. Assessment of iodine deficiency disorders and monitoring their elimination. A guide for programme managers. 3rd ed. Geneva : World Health Organization, 2007. URL: http://whqlibdoc.who.int/publica-tions/2007/9789241595827_eng.pdf.

9. Применение йодказеина для предупреждения йоддефицитных забо­леваний в качестве средства популяционной,групповой и индивиду­альной профилактики йодной недостаточности : методические реко­мендации. М. : Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 12 c.

10. Dohan O., De la Vieja A., Paroder V., Riedel C., Artani M., Reed M. et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation and medical significance // Endocr. Rev. 2003. Vol. 24. P. 48-77.

11. Toth G., Noszal B. Thyroid hormones and their precursors I. Biochemical properties // Acta Pharm. Hung. 2013. Vol. 83, N 2. P. 35-45.

12. Rodriguez A-M., Perron B., LaCroix L. Identification and characterization of a putative human iodide transporter located at the apical membrane of thyrocytes // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. Vol. 87. P. 3500-3503.

13. Portulano C., Paroder-Belenitsky M., Carrasco N. The Na+/I-symporter (NIS): mechanism and medical impact // Endocr. Rev. 2014. Vol. 35. P. 106-149.

14. de Vijlder J.J.M. Primary congenital hypothyroidism: defects in iodine pathways // Eur. J. Endocrinol. 2003. Vol. 149. P. 247-256.

15. Трошина Е. А. К вопросу о недостатке и избытке йода в организме человека // Клин. и экспер. тиреоидология. 2010. № 4. С. 9-16.

16. Larsen P.R., Zavacki A.M. The role of the iodothyronine deiodinases in the physiology and pathophysiology of thyroid hormone action // Eur. Thyroid J. 2012. Vol. 1. P. 232-242.

17. Ruf J., Carayon P. Structural and functional aspects of thyroid peroxi­dase // Arch. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 445. P. 269-277.

18. Люблинский С.Л., Савчик С.А., Смирнов С.В. Способ получения биологически активной добавки к пище. Пат. РФ № 2212155, 2002.

19. Цыб А.Ф., Розиев Р.А., Скворцов В.Г., Клепов А.Н., Скобелев И.В., Ус П.П. и др. Средство для регулирования йодного обмена или профилактики йоддефицитных состояний. Пат. РФ № 2151611, 2000.

20. ГОСТ 31886-2012. Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP). Применение принципов GLP к краткосрочным исследованиям. М. : Стандартинформ, 2013. 10 с.

21. ГОСТ 33044-2014. Принципы надлежащей лабораторной практики. М. : Стандартинформ, 2015. 12 с.

22. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Washington, DC : National Academy Press, 1996. URL: http://dx.doi.org/10.17226/10498.

23. ГОСТ 33422-2015. Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. М. : Стандартинформ, 2016. 10 с.

24. Гланц С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. М. : Практика, 1998. 459 с.