The protein biological value of curd produced with transglutaminase and specificities of its impact on growing rats

AbstractThe comparative evaluation of protein biological value of curd manufactured by the traditional technology and using microbial transglutaminase has been carried out. The biological experiment was conducted at Wistar laboratory rats fed by the analyzed curd samples as the protein (in the amount of 10% of the total calorie content of the diet) composed of semisynthetic diet. Within 22 days the individual rates of feed eating and the rat's body weight gain have been analyzed. During the exchanged period (from 23 to 24 days) besides the listed readings the amount of nitrogen egested with faeces and urine has been considered. The protein biological value of curd produced with transglutaminase and according to the traditional technology was evaluated by determination of protein efficiency coefficient, true nitrogen absorbency, nitrogenous balance. Besides, at the end of the exchanged period the blood immune component and protein catabolism by means of biochemical blood serum analysis has been evaluated. The results of in vitro analyses make it possible to state the assumption regarding the curd biological value improvement and digestibility of curd protein by means of milk proteins fermentative modification. The revealed reliable increase of the total protein concentration (by 4%), urea nitrogen (over 20%) and creatinine level correlated with high protein amount in the tested product consumed by rats within the exchanged period. The detected reduction of leucocytes and lymphocytes amount in blood of rats consuming the tested curd samples testified the reasonability of the additional investigation of immune reactions. The calculation of the indicators characterizing the biological value of curd protein based on its amino acid composition showed the increase of amino acid imbalance in curd produced with transglutaminase mainly due to lysine excess and the corresponding reduction of assimilability by 1.7%.

Keywords:transglutaminase, protein modification, curd, amino acid composition, biological value, rats, nitrogen assimilability, biochemical blood values

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (2): 44-52. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10018.

В настоящее время особое внимание уделяется раз­работкам стратегий по повышению биологической ценности пищевых продуктов, реализуемых путем моди­фикации состава и внесения различных функциональ­ных ингредиентов и модулей. Применение специализи­рованных видов пищевых добавок, модифицирующих белок, может способствовать повышению его биологи­ческой ценности, обусловленной дополнением лимити­рующими незаменимыми аминокислотами. Одним из путей повышения пищевой ценности молочных продук­тов может стать разработка технологий эффективно­го использования побочных продуктов, образующихся в процессе производства.

Стоит отметить, что при использовании современных технологий получения творога более 70% сыворотки практически не перерабатывается. При этом молочная сыворотка, в которую в процессе производства перехо­дит около 50% сухих веществ молока, содержит, кроме углеводов, липидов, органических кислот, минеральных солей, витаминов и ферментов, от 0,5 до 1,5% белка, включая казеин и сывороточные белки, являющиеся дополнительным источником триптофана, цистина, ли­зина, лейцина, гистидина, метионина, треонина [1].

Модификация белка путем ферментативного сши­вания с помощью трансглутаминазы (ТГ) позволяет улучшить его функционально-технологические свойства (термостабильность, гелеобразующая и эмульгирующая способность, растворимость и др.) [2-5]. Использование ТГ при производстве творога способствует также реше­нию проблемы увеличения выхода продукта, уменьше­ния потерь сухих веществ с сывороткой и, кроме того, снижения степени загрязнения сточных вод предпри­ятий [6, 7].

Однако, несмотря на многочисленные свидетельства преимуществ использования ТГ для сшивания функ­циональных молочных белков, данных о влиянии пот­ребления молочных продуктов, в частности творога, полученного с применением ферментативной модифи­кации, на усвоение нутриентов организмом недоста­точно. Известно, что использование ТГ может приводить к появлению дополнительных ковалентных перекрест­ных связей между белками пищи, вызывая тем самым существенные изменения в их структуре, и оказывать негативное влияние как на пищевые качества конечного продукта, так и на общее состояние организма [8]. Не­смотря на то что во всем мире проводятся исследования по изучению постпрандиальных эффектов ферментативно сшитых белков животного происхождения, появ­ляются публикации, в которых высказываются гипотезы о том, что микробные ТГ могут выступать в качестве нового экологического триггера глютеновой энтеропатии. Эти предположения преимущественно строятся на том, что микробные ТГ, так же как и эндогенные ТГ тканей человека, дезаминируют/трансаминируют глютен и способны, сшивая белки и другие макромолекулы, изменять их антигенные свойства за счет повышения стабильности белка против собственных протеиназ ор­ганизма и неполного гидролиза чужеродного белка, что при повышенной кишечной проницаемости может приводить к увеличению антигенной нагрузки на иммун­ную систему организма [8]. Помимо этого, опасения по поводу широкого применения ТГ связаны с вопросом биодоступности лизина обработанных продуктов, так как в результате воздействия ТГ образуются сшивки между глутамином и лизином [9].

Отдельно стоит отметить недостаточность исследова­ний по оценке качественных характеристик молочных продуктов, изготовленных с применением ТГ. Очевидно, что образование ковалентных перекрестных связей аминокислот в той же самой или в другой белковой молекуле белка может снизить усвояемость и биологи­ческую доступность незаменимых аминокислот, участ­вующих в реакции сшивания. В связи с этим актуально изучение биологической ценности и усвояемости белка конечного продукта, изготовленного с применением ТГ.

Цель исследований - сравнительное изучение биоло­гической ценности и усвояемости белка творога, под­вергавшегося ферментной модификации.

Материал и методы

Объектами исследований являлись образцы молоч­ного продукта - творога, изготовленного по тради­ционной технологии (КТ), и творога, изготовленного с использованием ТГ (ТТГ) [10].

Аминокислотный состав обоих видов творога опреде­ляли методом ионообменной хроматографии на амино­кислотном анализаторе LC-5000 ("Biotronik", Германия), расчет содержания аминокислот производили автомати­чески с помощью Chromatopac C-R3A ("Shimadzu", Япо­ния). Исходя из аминокислотного состава анализируе­мых продуктов с целью оценки его сбалансированности и биологической ценности белка были рассчитаны сле­дующие критерии: коэффициент избыточности незаме­нимых аминокислот, характеризующий общее количес­тво аминокислот, которое теоретически из-за взаимной несбалансированности не может быть утилизировано организмом на анаболические нужды; коэффициент сопоставимой избыточности, характеризующий сум­марную массу неутилизируемых аминокислот в таком количестве оцениваемого белка, которое эквивалентно их потенциально утилизируемому содержанию в 100 г белка-эталона; показатель усвояемости белка [11, 12].

Биологический эксперимент проводили на 33 расту­щих белых крысах-самцах стока Вистар, полученных из филиала "Андреевка" ФГБУН "Научный центр биоме­дицинских технологий" ФМБА России. После прохожде­ния карантина в течение 10 сут крыс произвольно раз­делили на 3 группы по 11 животных. Средняя масса тела крыс на начало эксперимента составила 88,0±10,0 г На протяжении всего срока проведения исследований экспериментальные животные получали изокалорийные (400 ккал/100 г сухого корма) полноценные рационы с содержанием расчетного уровня белка 10% по ка­лорийности, представленного для контрольных крыс 3-й группы казеином (К), для опытных крыс 1-й и 2-й групп - ТТГ и КТ (табл. 1). Рацион был рассчитан и скор­ректирован на основании химического состава иссле­дуемых образцов. Кормление животных осуществляли ежедневно в одно и то же время, в период с 15.00 до 16.00. Животные потребляли воду, полученную на ус­тановке водоподготовки ("Merck Millipore", Германия) и минерализованную путем добавления минеральных солей для получения физиологически полноценного минерального состава.

С 1-х по 22-е сутки включительно животных содер­жали в стандартных условиях вивария при свобод­ном доступе к воде и пище в пластмассовых клетках TECNIPLAST тип IV S, в которые помещали не более 6 крыс (в соответствии с нормами размещения живот­ных) [13]. Условия содержания животных были стандар­тизированы: температура - 20±3 °С, влажность - 48±2%, освещение режим день/ночь (с 6.00 до 18.00/с 18.00 до 6.00). В качестве подстила использовали березовую стружку. В этот период учитывали прирост массы тела животных с помощью электронных технических весов Ohaus ("Adventurer Pro", США) с точностью ±0,1 для оп­ределения массы тела животных.

С 23-х по 24-е сутки, в обменный период, животных всех групп пересаживали в индивидуальные метаболи­ческие клетки ("Techniplast", Испания). После пищевой депривации (10 ч) животным индивидуально скармли­вали соответствующие рационы, содержание белка в которых определяли методом Кьельдаля [14], исполь­зуя коэффициент пересчета с общего азота на белок (6,25). На протяжении 3 дней ежедневно учитывали массу тела животных, индивидуальные показатели поедаемости корма, собирали фекалии и мочу, определяя в них содержание азота на аппарате Кьельтек 2300 ("Foss Tecator", Швеция).

Для оценки влияния потребления КТ и ТТГ на расту­щих крыс рассчитывали следующие показатели [15, 16]:

- коэффициент эффективности белка (КЭБ) (PER):

где ΔΒ - прирост массы тела животного в процессе проведения эксперимента (г); Ip - суммарное количес­тво белка (г), потребленного животным за тот же пе­риод;

- истинную усвояемость (Dист) азота исследуемых об­разцов/казеина по формуле:

где I - общее количество азота (г), потребленного в составе рациона крысой в течение обменного периода; F - количество азота (г), экскретированного с калом крысой в течение обменного периода; F0 - эндоген­ный азот кала (г) крысы, гипотетически находившейся на безбелковой диете, в течение такого же обмен­ного периода. Значение показателя F0 принято равным 0,020 [17];

- биологическую ценность (БЦ) по формуле:

где U - количество азота (г), экскретированного с мочой крысой в течение обменного периода; U0 - эндоген­ный азот мочи (г) крысы, гипотетически находившейся на безбелковой диете, в течение такого же обмен­ного периода. Значение показателя U0 принято равным 0,005 [17];

- азотистый баланс (А) по формуле:

По окончании эксперимента (25-е сутки) животных усыпляли в камере для эвтаназии ("Vet Tech", Ве­ликобритания) с помощью углекислого газа, отби­рали из левого желудочка сердца кровь. Анализ проб цельной крови проводили на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе Abacus junior vet 2.7 ("Diatron Messtechnik GmbH", Австрия), исполь­зуя наборы реактивов Diatron, сыворотки крови - на автоматическом биохимическом анализаторе BioChem FC 360 ("HTI", США), используя наборы реактивов High Technology (США).

Эксперимент проводили в соответствии с требо­ваниями приказа Минздрава России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил надлежащей ла­бораторной практики", Директив Европейского сооб­щества 86/609EEC и 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей (Европейского парламента и Совета Европейского союза).

Статистическую обработку проводили с использо­ванием пакета программ Statistica 10.0. Результаты представлены в виде взвешенного среднего значения ± стандартное отклонение. Достоверность различий сред­них величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, оценивали мето­дом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA с применением критерия Дункана). Критический уро­вень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Аминокислотный состав и скор незаменимых амино­кислот контрольного и опытного образцов творога отно­сительно идеального (эталонного) белка представлены в табл. 2.

Полученные результаты показали, что содержание практически всех незаменимых аминокислот одинаково в обоих видах творога, за исключением лизина, содер­жание которого в ТТГ выше почти на 21 мг в 1 г белка. В обоих образцах творога минимальный скор определен у изолейцина. Относительно казеина, выбранного в ка­честве контроля сравнения, можно отметить высокое со­держание глутаминовой кислоты, лизина и изолейцина (превышает значения исследуемых продуктов более чем на 20%) согласно данным изготовителя, а также источникам литературы [18].

Показатели, характеризующие биологическую цен­ность белка рационов, исходя из аминокислотного со­става, рассчитанные по методике, разработанной ака­демиками Н.Н. Липатовым-младшим и И.А. Роговым на основе развития принципа Митчелла-Блока, пред­ставлены в табл. 3. Анализ аминокислотной сбалан­сированности показал, что в диете с использованием в качестве источника белка образца творога, изготовленного с применением ТГ, сопоставимая избыточ­ность содержания незаменимых аминокислот выше на 1,2 г/100 г белка, при этом показатель усвояемости незаменимых аминокислот на анаболические цели ниже на 1,7 г/100 г. Таким образом, рациональное использова­ние и, соответственно, биологическая ценность белка ТТГ ниже, чем КТ, вследствие большей аминокислотной разбалансированности, обусловленной в основном уве­личением количества лизина (на ~30%). Это объясня­ется, очевидно, специфичностью действия ТГ.

При проведении биологического эксперимента было выявлено увеличение среднесуточной прибавки массы тела у животных всех групп (см. рисунок), при этом в период с 1-х по 22-е сутки установлен достоверный прирост массы тела крыс 3-й группы. По окончании обменного периода масса тела крыс 1-й и 2-й групп была ниже, чем у животных, получавших в качестве источника белка казеин, однако различия не достигали уровня статистической значимости. Эффективность утилизации белка, выражаемая КЭБ, как в период с 1-х по 22-е сутки, так и в обменный период была также выше у контрольных крыс 3-й группы. Стоит отметить, что усредненные значения коэффициента эффектив­ности белка за 22 сут статистически значимо не раз­личались у крыс всех групп. Результаты определения истинной усвояемости белка крысами и биологической ценности анализируемых продуктов (табл. 4) свидетель­ствуют о том, что среднее количество белка, потреблен­ного в составе рациона за сутки обменного периода, было одинаковым для животных 1-й и 2-й групп и незна­чительно больше, чем у животных контрольной группы. При этом экскреция азота с мочой была меньше у крыс 1-й и 2-й групп, а с фекалиями - у животных 3-й группы. Следует отметить, что у животных 3-й группы при на­именьшем количестве азота, выделенного с фекалиями, наблюдалась более выраженная элиминация азотсо­держащих продуктов с мочой. Выявлено, что белок ТТГ обладает большей биологической ценностью, чем белок КТ и К. Коэффициент истинной усвояемости белка ТТГ был ниже, чем белка казеина, но выше белка КТ. При этом азотистый баланс экспериментальных крыс всех групп достоверно не различался.

Для выявления нежелательных эффектов, сопряжен­ных с потреблением продукта с частично "сшитым" белком, по окончании обменного опыта был проведен анализ показателей крови, характеризующий состояние лейкоцитов (табл. 5). Полученные результаты показали, что у крыс 1-й группы (ТТГ) концентрация лейкоцитов была снижена на 20,4% по сравнению с показателем животных 3-й группы (К) преимущественно за счет снижения содержания лимфоцитов (свыше 25%). При этом у крыс этой группы выявлено недостоверное увеличе­ние относительного содержания гранулоцитов. У живот­ных 2-й группы анализируемые показатели статисти­чески значимо не отличались от показателей животных 3-й группы, однако выявлено статистически значимое снижение содержания моноцитов практически в 2 раза. Выявленная тенденция может указывать на возмож­ность образования при расщеплении белков ТТГ не­большой доли негидролизованных коротких пептидов, опосредованно оказывающих влияние на активацию иммунных реакций.

Для более полного понимания катаболизма белка исследуемых продуктов были проанализированы био­химические показатели сыворотки крови животных, характеризующие белковый обмен (табл. 6). У крыс 1-й и 2-й групп (ТТГ и КТ) относительно контрольных жи­вотных 3-й группы выявлено статистически значимое увеличение концентрации общего белка на 4,3 (ТТГ) и 4,1% (КТ) и азота мочевины на 21,5 и 30,3% соответст­венно. Интересно отметить незначительное (до 6%, p<0,05) повышение уровня креатинина в сыворотке крыс 1-й группы относительно показателей животных 2-й и 3-й групп. Данная тенденция может быть связана с не­обходимостью катаболизма большего количества белка, потребленного животными в обменный период.

На основании выполненных исследований необхо­димо отметить, что показатели, характеризующие био­логическую ценность белка опытных образцов про­дукта, изготовленного с применением ТГ, полученные расчетным путем, расходятся с результатами проведен­ного эксперимента на модели биологической системы. Увеличение аминокислотной несбалансированности в твороге, выработанном с применением ТГ, в основном за счет избытка лизина, не приводило к увеличению ко­личества неутилизируемого азота крысами, что может объясняться более высокими потребностями крыс в лизине. Снижения усвояемости белка с учетом вновь образованных дополнительных глутаминил-лизиновых связей, судя по биометрическим показате­лям животных, не отмечено. Эти данные согласуются с результатами исследований других авторов, которые выявили, что изопептидная связь, индуцированная ТГ между глутамином и лизином, расщепляется под дейс­твием ферментов желудочно-кишечного тракта и почек крыс [20, 21].

Проведенная сравнительная оценка кисломолочных продуктов - творога, изготовляемого с применением ТГ и по традиционной технологии, на растущих крысах сви­детельствует о том, что значения таких показателей, как потребление и экскреция азота, коэффициент эффек­тивности белка, коэффициент биологической ценности, истинная усвояемость азота, азотистый баланс и при­рост массы тела крыс, потреблявших в составе рациона творог, изготовленный с применением ТГ, незначительно (на 1,3-4,9%) превышали значения, полученные для кон­трольного образца творога. Колебания анализируемых гематологических и биохимических показателей крови экспериментальных животных не выходили за пределы физиологической нормы.

Полученные результаты имеют важное значение, по­скольку показывают, что перекрестная "сшивка" белка, повышающая степень использования пищевого сырья при производстве творога, по крайней мере не ока­зывает при этом отрицательное влияние на его усво­яемость и биологическую ценность, что согласуется с данными C.F.V. de Souza и др. [22], которые из экспе­риментов на крысах Вистар, потреблявших в составе рациона "сшитый" ТГ белок сухого молока, получили значения БЦ 94,59 и 94,19% для контрольной и опытной групп соответственно.

Таким образом, можно заключить, что введение в рацион растущим крысам Вистар молочного продукта (в количестве 10% белка от общей калорийности ра­циона) не вызывало отрицательных эффектов на анализируемые ростовые показатели животных. При этом отмеченное перераспределение иммунных клеток крови крыс, потреблявших творог, изготовленный с примене­нием микробной ТГ, указывает на необходимость про­ведения дальнейших исследований, в том числе на­правленных на понимание реакций взаимодействия ТГ с казеинами и сывороточными белками, процессов гидро­лиза пищеварительными ферментами модифицирован­ных белков и путей образования биоактивных пептидов, обладающих как позитивными (например, GMP-подоб-ные пептиды), так и негативными (модифицированные трансаминированные пептиды Glu-C) эффектами.

Литература

1. Храмцов А.Г., Молчанов Г.И., Жидков В.Е., Лунькова Л.В. Производство и использование белков молочной сыворотки в лечебно-диетическом питании: обзорная информация. Сер. Молочная промышленность. М. : АгроНИИТЭИПП, 1993. 32 с.

2. Zhu Y., Rinzema A., Tramper J., Bol J. Microbial transglutaminase -a review of its production and application in food processing // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. Vol. 44. P. 277-282.

3. Liu M., Damodaran S. Effect of transglutaminase-catalyzed polymer­ization of beta-casein on its emulsifying properties // J. Agric. Food Chem. 1999. Vol. 47, N 4. P. 514-519.

4. Lorenzen P.C. Renneting properties of transglutaminase-treated milk // Milchwissenshaft. 2000. Vol. 55. P. 433-437.

5. O'Sullivan M.M., Kelly A.L., Fox P.F. Effects of transglutaminase on the heat stability of milk: a possible mechanism // J. Dairy Sci. 2002. Vol. 8. P. 1-7.

6. Шлейкин А.Г., Данилов Н.П., Шарапова Т.А. Технологические и медико-биологические аспекты действия трансглутаминазы // Изв. СПбГУНиПТ. 2009. № 3, 4. С. 47-49.

7. Зенина Д.В. Современные тенденции в повышении качества традиционного творога // Мол. пром-сть. 2012. № 5. С. 16-17.

8. Lerner A., Torsten M. Possible association between celiac disease and bacterial transglutaminase in food processing: a hypothesis // Nutr. Rev. 2015. Vol. 73, N 8. Р. 544-552.

9. Monogioudi E., Faccio G., Lille M., Poutanen K., Buchert J., Mattinen M.-L. Effect of enzymatic cross-linking of β-casein on proteolysis by pepsin // Food Hydrocolloids. 2011. Vol. 25. P. 71-81.

10. Зобкова З.С., Зенина Д.В. О влиянии микробной трансглутаминазы на процессы модификации молочных белков при производстве творога // Научное обеспечение молочной промышленности : сборник научных трудов. М. : ГНУ ВНИМИ, 2012. С. 79-84.

11. Покровский А.А. Биохимические обоснования разработки продуктов повышенной биологической ценности // Вопр. питания. 1994. № 1. С. 1-3.

12. Липатов Н.Н. Принципы и методы проектирования рецептур пищевых продуктов, балансирующих рационы питания // Изв. вузов. Пищевая технология. 1990. № 6. С. 5-10.

13. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th ed. Washing­ton, DC : National Academies Press, 2011. 248 р.

14. Скурихин И.М., Тутельян В.А. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. М. : Медицина, 1998. 142 с.

15. Покровский А.А. О биологической и пищевой ценности продуктов питания // Вопр. питания. 1975. № 3. С. 25-39.

16. Pellett P.L., Young V.R. Nutritional Evaluation of Protein Foods. Tokyo : The United Nations University, 1980. 162 p.

17. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. К оценке эндогенных потерь азота у белых крыс различного возраста // Вопр. питания. 1979. № 3. С. 48-52.

18. Просеков А.Ю., Курбанова М.Г. Анализ состава и свойств белков молока с целью использования в различных отраслях пищевой промышленности // Техника и технология пищевых производств. 2009. № 4. С. 68-71.

19. Evans G.O., George A. Animal Clinical Chemistry: A Practical Hand­book for Toxicologists and Biomedical Researchers. 2nd ed. UK : CRC Press, 2009. 368 р.

20. Seguro K., Kumazawa Y., Kuraishi C., Sakamoto H., Motoki M. The epsi-lon-(gamma-glutamyl)lysine moiety in cross-linked casein is an avail­able source of lysine for rats // J. Nutr. 1996. Vol. 126. P. 2557-2562.

21. Hultsch C., Bergmann R., Pawelke B., Pietzsch J., Wuest F., Johannsen B. et al. Biodistribution and catabolism of 18 F-labelled isopeptide Ne-(c-glutamyl)-L-lysine // Amino Acids. 2005. Vol. 29. Р. 405-413.

22. De Souza C.F.V., Venzka J.G., Flores S.H.,.Ayub M.A.Z. In vivo evalu­ation of cross-linked milk and wheat proteins mediated by microbial transglutaminase in white Wistar rats // Am. J. Food Technol. 2009. Vol. 4, N 3. P. 96-107.