Assessment of the sufficiency of Moscow population with folic acid, depending on the combined effect of polymorphism of MTHFR and FTO genes

Abstract

The results of assessing the sufficiency of folic acid of the residents of the Moscow region have been presented depending on rs1801133 MTHFR gene polymorphism and rs9939609 FTO gene polymorphism. A total of 326 people were examined, including 74 men and 252 women aged 20 to 65 years. The results of determining the level of folic acid in blood serum showed insufficiency of this vitamin among the population of the Moscow region of the Russian Federation. The expressed vitamin deficit (level <3,0 ng/ml) was detected in 24.2% of the surveyed residents, in 22.8% folic acid level was at the lower bound of the norm (3.0-4.5 ng/ml). The results of genotyping showed a statistically significant association of low folic acid level with rs1801133 MTHFR gene polymorphism in carriers of A allele of rs9939609 FTO gene polymorphism both in the homozygous state (genotype AA) and in the heterozygous (genotype AT) state, OR=4.26; CI (1.40-12.9), p=0.008, as well as with rs9939609 FTO gene polymorphism in carriers of the T allele of rs1801133 MTHFR gene polymorphism both in the homozygous (genotype TT) and heterozygous (CT genotype) state, OR=3.29; CI (1.07-10.1), p=0.03. In carriers of 3 alleles of risk offolic acid deficiency [rs9939609 FTO gene polymorphism and rs1801133 MTHFR gene polymorphism (genotypes CT/AA and TT/AT)] blood serum level of folic acid was below the norm, that indicated folate deficiency in this category of persons.

Keywords:оbesity, body mass index, folic acid, rs1801133 polymorphism of the gene of methylenetetrahydrofolate reductase, rs9939609 polymorphism of FTO gene

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (2): 17-23. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10014.

Фолиевая кислота, выполняющая роль донора метильных групп в цикле S-аденозилметионина, которые затем используются в процессе метилирова­ния дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и синтезе дезоксинуклеотидов de novo, является одним из основ­ных микронутриентов, оказывающих значительное воз­действие на геном [1]. В экспериментах in vitro показано, что повреждение генома, вызванное дефицитом фолиевой кислоты, сходно с повреждением его от воздействия ионизирующего излучения [2].

В метаболизме этого витамина ключевое значение имеет фермент метилентетрагидрофолатредуктаза, ко­торый катализирует восстановление 5,10-метилентет-рагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат, активную форму фолиевой кислоты, необходимую для образо­вания метионина из гомоцистеина и далее - S-адено-зилметионина, играющего ключевую роль в процессе метилирования ДНК [1].

Активность этого фермента регулируется геном метилентетрагидрофолатредуктазой, официальный символ MTHFR (местоположение - 1р36.3), для которого выяв­лен целый ряд однонуклеотидных полиморфизмов. При этом наибольший интерес представляет полиморфизм, в котором цитозин (C) в позиции 677 заменен тимидином (T), что приводит к замене аминокислотного остатка аланина на остаток валина (позиция 223) в сайте связы­вания фолата (rs1801133).

В ряде работ показано, что низкий уровень фолиевой кислоты ассоциирован с высоким уровнем индекса массы тела (ИМТ), что может иметь потенциально важ­ное значение для здоровья, так как добавление фолата в рацион могло бы внести свой вклад в лечение ожи­рения в случае установления причинно-следственной связи [3, 4]. Показано также высокое содержание гомоцистеина, биомаркера низкого уровня фолиевой кис­лоты, в сыворотке крови детей и подростков с ожи­рением и избыточной массой тела [5]. Однако в ряде других работ не выявлено связи низкого уровня этого витамина с ожирением [6, 7].

В связи с установлением ассоциации низкого уровня фолиевой кислоты с ожирением в ряде этнических групп представляет интерес изучение вклада полиморфизма rs9939609 гена FTO, который достоверно связан с ожи­рением [8-10], в развитие дефицита фолатов.

Кроме того, следует отметить, что функциональная роль полиморфизмов rs9939609 (ген FTO) и rs1801133 (ген MTHFR) в развитии дефицита этого витамина в ор­ганизме практически не исследована.

Цель настоящей работы - изучение ассоциации по­лиморфизма rs1801133 гена MTHFR c обеспеченностью фолиевой кислотой в зависимости от носительства аллеля риска ожирения полиморфизма rs9939609 гена FTO у жителей Московского региона.

Материал и методы

Обследованы 326 человек, проживающих в Москов­ском регионе, из них 74 мужчины и 252 женщины в возрасте от 20 до 65 лет. Избыточная масса тела и ожирение (ИМТ≥25 кг/м2) были констатированы у 72,9% обследованных.

При изучении ассоциации полиморфизма rs1801133 гена MTHFR с обеспеченностью фолиевой кислотой по типу "случай-контроль" все обследованные были разделены на 2 группы: у пациентов 1-й группы содер­жание фолиевой кислоты в сыворотке крови превышало 4,5 нг/мл (контроль), а 2-й составляло менее 4,5 нг/мл (случай).

Содержание фолиевой кислоты в сыворотке крови определяли с использованием тест-системы ID-Vit® Folic Acid ("R-Biopharm", Германия) на иммунохемилюминесцентном автоматическом анализаторе "Immulite 2000 XPi" ("Siemens Healthcare Diagnostics Inc.", США).

У всех обследованных была проведена идентифика­ция полиморфизмов rs1801133 гена MTHFR и rs9939609 гена FTO. ДНК выделяли из крови стандартным мето­дом, с использованием многокомпонентного лизирующего раствора, разрушающего комплекс ДНК с бел­ком, затем ее сорбировали на покрытые силикагелем магнитные частицы, отмывали спиртом и на конечном этапе элюировали в буферный раствор. ДНК выделяли с использованием набора реагентов "РеалБест ДНК-экстракция 3" (ЗАО "Вектор-Бест", РФ) на ав­томатической станции epMotion 5075 ("Eppendorf", Германия).

Для идентификации полиморфизма rs1801133 гена MTHFR применяли полимеразную цепную реакцию учас­тков генов с последующим расщеплением их специ­фической рестриктазой (Hinf1) ("Promega Corporations США) и анализом фрагментов методом гель-электрофо­реза в агарозных гелях с добавлением бромида этидия (0,5 мг/мл) [11].

Идентификацию полиморфизма rs9939609 гена FTO проводили с применением аллель-специфичной ампли­фикации с детекцией результатов в режиме реального времени и использованием TaqMan-зондов, комплемен­тарных полиморфным участкам ДНК c использованием реагентов ("СИНТОЛ", РФ).

Для проведения амплификации использовали амплификатор "CFX96 Real Time System" ("Bio-Rad", США), агарозные гели визуализировали в проходящем УФ-свете с помощью системы документации Gel Doc ("Bio-Rad", США).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием системы PASW Statistics 20. Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций методом Пирсона χ2 проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института ге­нетики человека (Мюнхен, Германия).

Результаты и обсуждение

Результаты определения концентрации фолиевой кис­лоты в сыворотке крови показали недостаточную обес­печенность этим витамином населения Московского региона РФ. Выраженный дефицит витамина (уровень <3,0 нг/мл в сыворотке крови) отмечался у 24,2% жителей, у 22,8% содержание фолиевой кислоты было вблизи нижней границы нормы (3,0-4,5 нг/мл). Среднее значение этого показателя среди всех обследован­ных составило 5,19±0,39 нг/мл, среди мужчин - 4,58± 0,42 нг/мл, среди женщин - 6,45±0,80 нг/мл. Таким об­разом, концентрация фолиевой кислоты была статисти­чески значимо ниже у мужчин по сравнению с величи­ной этого показателя у женщин (р<0,05).

При анализе результатов исследования концентрации фолиевой кислоты в крови у всех обследованных по типу "случай-контроль" не выявлялось связи аллеля Т полиморфизма rs1801133 гена MTHFR с величиной этого показателя. В группе лиц с концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови <4,5 нг/мл выявлена более низкая частота встречаемости аллеля Т (29,7%), однако различия по сравнению с частотой в группе, в которой уровень превышал 4,5 нг/мл, не достигали статистичес­кой значимости (табл. 1).

Результаты более ранних наших исследований сви­детельствуют, что у лиц с ИМТ≥25 кг/м2, которые явля­лись носителями аллеля Т полиморфизма rs1801133 гена MTHFR (генотипы СТ + ТТ), содержание фолиевой кислоты в сыворотке крови было достоверно ниже, чем у носителей генотипа СС, что подтверждает статистически значимую ассоциацию аллеля Т дан­ного полиморфизма с низкой обеспеченностью этим витамином.

В то же время в группе лиц с ИМТ<25 кг/м2 не обна­ружено различий в концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови в зависимости от генотипа поли­морфизма rs1801133 гена MTHFR [12]. Частота встре­чаемости аллеля Т полиморфизма rs1801133 гена MTHFR у лиц с избыточной массой тела и ожирением в группе обследованных с низкой концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови была статисти­чески значимо выше (на 21,1%) по сравнению с группой лиц с высоким ее уровнем: OR=2,50; CI (1,09-5,74) при р=0,03.

На следующем этапе был проведен анализ связи уровня этого витамина в сыворотке крови с полимор­физмом rs1801133 гена MTHFR в зависимости от гено­типа полиморфизма rs9939609 гена FTO, для которого была однозначно установлена связь с избыточной мас­сой тела и ожирением у населения центральных регио­нов РФ [8].

В ходе проведенных исследований было показано, что у носителей генотипа ТТ полиморфизма rs9939609 гена FTO связь полиморфизма rs1801133 гена MTHFR с концентрацией фолиевой кислоты отсутствует (см. табл. 1).

В то же время у носителей аллеля риска избыточной массы тела и ожирения (А) полиморфизма rs9939609 гена FTO (генотипы АТ + АА) связь варианта rs1801133 гена MTHFR с концентрацией фолиевой кислоты в сы­воротке крови была статистически значима: OR=4,26; CI (1,40-12,9) при р=0,008.

В этой группе обследованных частота встречае­мости аллеля Т полиморфизма rs1801133 гена MTHFR у лиц с концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови ниже 4,5 нг/мл была почти в 3 раза выше, чем у лиц с уровнем фолиевой кислоты 4,5 нг/мл и выше (см. табл. 1).

Таким образом, носительство аллеля А полимор­физма rs9939609 гена FTO статистически достоверно связано с риском снижения концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови при наличии аллеля Т поли­морфизма rs1801133 гена MTHFR. Эти данные могут слу­жить объяснением достоверной ассоциации снижения уровня фолиевой кислоты в сыворотке крови женщин европейского происхождения детородного возраста с увеличением ИМТ [3, 4].

Носители аллеля А полиморфизма rs9939609 гена FTO с высокой степенью вероятности имеют избы­точную массу тела или ожирение, что при носительстве аллеля Т полиморфизма rs1801133 гена MTHFR ассоциировано с низкой концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови. По данным ряда иссле­дователей, у носителей аллеля Т в гомозиготном со­стоянии (генотип ТТ) отмечается снижение активности метилентетрагидрофолатредуктазы примерно до 35%, что, в свою очередь, приводит к дефициту фолиевой кислоты [1, 13].

Установлена ассоциация аллеля Т полиморфизма rs1801133 с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний у японцев [14], европейцев и американцев европейского происхождения [15], а также с риском сахарного диабета 2-го типа [16, 17].

Следует, однако, отметить, что функциональная роль генетических полиморфизмов гена MTHFR в этиологии этих патологий до конца не изучена, но, предполо­жительно, связана с нарушением синтеза, репарации и метилирования ДНК.

Результаты изучения связи концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови с полиморфизмом rs9939609 гена FTO показали отсутствие статистически значимой ассоциации (табл. 2). Также не обнаружено достоверной связи с обеспеченностью фолиевой кислотой этого по­лиморфизма у носителей генотипа СС полиморфизма rs1801133 гена MTHFR.

В то же время у носителей аллеля Т как в гомозигот­ном, так и в гетерозиготном состоянии (генотипы СТ и ТТ) полиморфизма rs1801133 гена MTHFR была об­наружена статистически достоверная ассоциация по­лиморфизма rs9939609 гена FTO с обеспеченностью фолиевой кислотой OR=3,29 при р=0,03 (см. табл. 2).

Таким образом, при полиморфизме rs9939609 гена FTO (аллель А) статистически значимая связь с низкой концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови наблюдается только у носителей аллеля Т (генотипы СТ и ТТ) полиморфизма rs1801133 гена MTHFR.

Анализ результатов определения концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови показал, что у носите­лей одного или двух аллелей риска дефицита фолиевой кислоты в генотипах полиморфизмов rs9939609 гена FTO и rs1801133 гена MTHFR этот показатель находился в пределах нормы и не отличался от величины у обсле­дуемых, которые не являются носителями указанных аллелей (табл. 3).

В то же время у носителей одновременно 3 аллелей риска дефицита фолиевой кислоты этих полиморфиз­мов концентрация фолиевой кислоты в сыворотке крови была ниже нормы, что свидетельствует о недостаточной обеспеченности этим витамином данного контингента и подтверждает результаты, полученные при их обсле­довании по типу "случай-контроль".

Обследованные с носительством 4 аллелей риска изучаемых полиморфизмов (генотип ТТ/АА) в данной группе не выявлены (см. табл. 3).

Заключение

Результаты определения концентрации фолиевой кис­лоты в сыворотке крови свидетельствуют о недостаточ­ной обеспеченности этим витамином населения Мос­ковского региона Российской Федерации. Практически только у половины обследованных лиц уровень фолиевой кислоты в сыворотке крови был в пределах нормы. Выраженный дефицит этого витамина (концентрация <3,0 нг/мл) выявлен у 24,2% обследованных жителей, у 22,8% концентрация фолиевой кислоты была на ниж­ней границе нормы (3,0-4,5 нг/мл).

Анализ данных генотипирования показал статисти­чески значимую ассоциацию с низкой концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови полиморфизма rs1801133 гена MTHFR у носителей аллеля риска ожире­ния (А) полиморфизма rs9939609 гена FTO как в гомо­зиготном (генотип АА), так и в гетерозиготном (генотип АТ) состоянии.

Результаты генотипирования показали статисти­чески значимую ассоциацию с низкой концентрацией фолиевой кислоты в сыворотке крови полиморфизма rs9939609 гена FTO у носителей аллеля Т как в гомози­готном состоянии (генотип ТТ), так и в гетерозиготном (генотип СТ).

У носителей 3 аллелей риска дефицита фолиевой кис­лоты полиморфизмов rs9939609 гена FTO и rs1801133 гена MTHFR (генотипы СТ/АА и ТТ/АТ) концентрация фолиевой кислоты в сыворотке крови ниже нормаль­ных величин этого показателя, что свидетельствует о недостаточной обеспеченности данным витамином этой категории обследованных. Для этой категории лиц необходим постоянный мониторинг концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови и его коррекция по­средством дополнительного включения этого витамина в состав рациона.

Результаты наших более ранних исследований под­тверждают увеличение выраженности фенотипических проявлений при сочетании полиморфизмов генов. Так, было показано увеличение риска ожирения у лиц, носи­телей комбинации полиморфизмов rs9939609 гена FTO и rs4994 гена ADRB3 [9].

Потенциирующий эффект недостаточной обеспечен­ности фолиевой кислотой при сочетанных полимор­физмах rs9939609 гена FTO и rs1801133 гена MTHFR, возможно, реализуется посредством изменения метабо­лизма гомоцистеина, биомаркера низкой концентрации фолиевой кислоты в сыворотке крови обследованных. Показано, что у детей и подростков с ожирением и из­быточной массой тела гипергомоцистеинемия коррели­рует с повышенной концентрацией лептина в сыворотке крови [5].

В то же время, как свидетельствуют результаты наших более ранних исследований, лептинорезистентность до­стоверно более выражена у лиц, носителей аллеля риска ожирения (А) полиморфизма rs9939609 гена FTO [10].

Источник финансирования. Научно-исследователь­ская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного за­дания в рамках Программы фундаментальных науч­ных исследований государственных академий наук на 2013-2020 гг. (тема № 0529-2016-0024).

Литература

1. Rosenberg N., Murata M., Ikeda Y. et al. The frequent 5,10-methy-lenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism is associated with a common haplotype in whites, Japanese, and Africans // Am. J. Hum. Genet. 2002. Vol. 70. P. 758-762.

2. Fenech M. Genome health nutrigenomics and nutrigenetics - diag­nosis and nutritional treatment of genome damage on an indi­vidual basis // Food Chem. Toxicol. 2008. Vol. 46, N 4. P. 1365-1370.

3. Mojtabai R. Body mass index and serum folate in childbearing age women // Eur. J. Epidemiol. 2004. Vol. 19, N 11. P. 1029-1036.

4. Lawrence J.M., Watkins M.L., Chiu V. et al. Do racial and ethnic dif­ferences in serum folate values exist after food fortification with folic acid? // Am. J. Obstet. Gynecol. 2006. Vol. 194. P. 520-526.

5. Narin F., Atabek M.E., Karakukcu M. et al. The association of plasma homocysteine levels with serum leptin and apolipoprotein B levels in childhood obesity // Ann. Saudi Med. 2005. Vol. 25. P. 209-214.

6. Liu X., Zhao L.J., Liu Y.J. et al The MTHFR gene polymorphism is associated with lean body mass but not fat body mass // Hum. Genet. 2008. Vol. 123, N 2. P. 189-196.

7. Bazzaz J.T., Shojapoor M., Nazem H. Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism in diabetes and obesity // Mol. Biol. Rep. 2009. Vol. 37, N 1. P. 105-109. doi: 10.1007/s11033-009-9545-z.

8. Батурин А.К., Сорокина Е.Ю., Погожева Е.В., Пескова Е.В. и др. Изучение региональных особенностей полиморфизма rs9939609 гена FT0 и Trp64Arg гена ADRB3 у населения Российской Федерации // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 2. С. 35-41.

9. Батурин А.К., Сорокина Е.Ю., Погожева А.В., Пескова Е.В., Макурина О.Н., Тутельян В.А. Изучение сочетанного влияния генетических полиморфизмов rs9939609 гена FT0 и rs4994 гена ADRB3 на риск развития ожирения // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 4. С. 42-47.

10. Егоренкова Н.П., Погожева А.В., Сорокина Е.Ю., Пескова Е.В., Макурина О.Н., Левин Л.Г. и др. Изучение особенностей метаболизма у лиц с полиморфизмом rs9939609 гена FTO // Вопр. питания. 2015. № 4. С. 97-104.

11. Sun J.H., Xu Y.C., Xue Y., Zhu H.L. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism associated with susceptibility to coronary heart disease in Chinese type 2 diabetic patients // Mol. Cell. Endocrinol. 2005. Vol. 229. P. 95-101.

12. Сорокина Е.Ю., Погожева А.В., Аристархова Т.В., Пескова Е.В., МакуринаО.Н.,БатуринА.К.Изучениеассоциацииполиморфизма rs1801133 гена MTHFR с факторами риска неинфекционных заболеваний // Профилактическая медицина 2017 : сборник. СПб., 2017. С. 117-122.

13. Stover P.J. Human nutrition and genetic variation // Food Nutr. Bull. 2007. Vol. 28, suppl. 1. P. S101-S115.

14. Inamoto N., Katsuya T., Kokubo Y. et al. Association of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism with carotid atherosclerosis depending on smoking status in a Japanese general population // Stroke. 2003. Vol. 34. P. 1628-1633.

15. Klerk M., Verhoef P., Clarke R. et al. MTHFR studies collaboration group. MTHFR 677C/T polymorphism and risk of coronary heart disease: a meta-analysis // JAMA. 2002. Vol. 288. P. 2023-2031.

16. Raza S.A., Abbas Z., Siddiqi Z., Mahdi F. Association between ACE (rs4646994), FABP2 (rs1799883), MTHFR (rs1801133), FTO (rs9939609) genes polymorphism and type 2 diabetes with dyslipidemia // Int. J. Mol. Cell. Med. 2017. Vol. 6, N 2. Р. 121-130.

17. Zhu В., Wu Х., Zhi Х. et al. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and type 2 diabetes mellitus in Chinese popu­lation: a meta-analysis of 29 case-control studies // PLoS. One. 2014. Vol. 7. doi: 10.1371/journal.pone.0102443.