Antimutagenic and antioxidant features of confectionery products containing the powder from the leaves of Hippophae rhamnoides L.

AbstractThe aim of the work was to determine the possibility of using the powder from the leaves of Hippophae rhamnoides L. for enriching flour confectionery and to evaluate the antimutagenic and antioxidant activity of the product. The experiment was carried out on 24 white Wistar rats with initial body weight (b.w.) 180-200 g. The animals of the experimental group (n=8) received confection containing sea buckthorn powder at a rate of 20 mg per 100 g b.w. for 14 days on the background of a standard vivarium diet. The animals of the control and intact groups received confection containing no bioactive supplement at the same dose. Antimutagenic and antioxidant effects were estimated in a day after a single injection of cyclophosphamide at a dose of 20 mg/kg b.w. The number of chromosomal aberrations in bone marrow cells of white rats was counted and the activity of catalase, superoxide dismutase (SOD), the level of reduced glutathione and the concentration of TBA-active products in blood were evaluated. The intake of the confectionery containing the powdered H. rhamnoides leaves resulted in the 45% decrease of the number of damaged cells, 50% decrease of the proportion of cells with multiple chromosome breaks and 52% decrease of the number of achromatic gaps as compared to animals of the control group (n=8). The cake intake increased the activity of catalase (by 52%) and SOD (by 33%) and glutathione content (by 26%) in blood.

Keywords:confection, powder from the leaves of Hippophae rhamnoides L., cyclo-phosphamide, antimutagenic effect, antioxidant effect

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (1): 92-97. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10011.

B настоящее время в связи с развитием науки о пита­нии, а также со стремлением населения поддержи­вать физическое и умственное здоровье потребление и производство функциональных пищевых продуктов становится все более востребованным. В состав пище­вых продуктов вводятся специальные добавки, компо­ненты с высоким содержанием биологически активных веществ (БАВ), активизирующие функции отдельных систем организма, нормализующие метаболизм, вос­полняющие дефицит и снижающие риск развития забо­леваний. Расширение ассортимента пищевых продук­тов функционального назначения возможно за счет более широкого использования растительного сырья, содержащего ценные для функционирования организма человека БАВ [1, 2].

С этой точки зрения перспективным сырьем являются кора, листья и продукты комплексной переработки об­лепихи. Плоды облепихи в промышленных масштабах используются для производства облепихового масла, перерабатываются в соки, желе и другие консервиро­ванные продукты. Остальные части растения, а также продукты переработки плодов облепихи практически не применяются в производстве пищевых продуктов, несмотря на то что, по результатам исследований, они являются источником ценных БАВ. Известно, что листья, кора и корни облепихи отличаются высоким содержа­нием флавоноидов, дубильных веществ, служат источ­ником минеральных веществ [3].

Цели данной работы - определение возможности использования порошка из листьев Hippophae rhamnoi­des L. для обогащения мучного кондитерского изделия и оценка антимутагенного и антиоксидантного действия данного продукта.

Материал и методы

Для оценки пищевой ценности кекса и порошка из листьев Hippophae rhamnoides L. использовали об­щепринятые методы анализа химического состава и содержания БАВ. Содержание белка определяли по ГОСТ 10846-91. После минерализации образца с серной кислотой нейтрализовали кислоту щелочью, осуществляли перегонку и титрование дистиллята. По количеству выделившегося аммиака вычисляли ко­личество азота [4]. Массовую долю жира определяли по ГОСТ 31902-2012. Метод основан на экстракции жира эфиром с последующей отгонкой растворителя и взвешиванием жира [5]. Содержание нераствори­мой в растворе соляной кислоты золы оценивалипо ГОСТ 5901-87 методом озоления с последующей обработкой золы с соляной кислотой и повторным озолением материала [6]. Массовую долю углеводов опре­деляли феррицианидным методом по ГОСТ 5903-89 [7].

Для анализа содержания дубильных веществ исполь­зовали метод, основанный на окислении дубильных веществ раствором калия перманганата, а танинов -спектрофотометрический [8]. Содержание каротиноидов и хлорофиллов оценивали спектрофотометрически, путем измерения оптической плотности экстракта пиг­ментов при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения каротиноидов и хлорофиллов, с последу­ющим расчетом концентрации пигментов [9]. Количест­во флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом в пересчете на рутин [10]. Содержание ми­неральных веществ анализировали методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии с использованием прибора "PinAAcle 900T" ("Perkin Elmer", США). Содер­жание элемента в пробе определяли с использованием установленной функциональной зависимости между аналитическим сигналом и концентрацией элемента в образце сравнения [11].

Рецептура кекса включала следующие компоненты: мука пшеничная хлебопекарная высшего сорта, сахар-песок, маргарин, яйцо, соль, ванилин, сода, сахар­ная пудра, порошок из листьев облепихи Hippophae rhamnoides L. в количестве 15% (вместо муки).

Экспериментальные исследования выполнены на белых крысах линии Вистар с исходной массой тела 180-200 г. Содержание животных соответствовало "Правилам лабораторной практики (GLP) и приказу Мин­здрава России от 01.04.2016 № 193н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Перед началом экспериментов животных, отвечающих кри­териям включения, распределяли по группам с учетом пола, возраста, массы тела и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответс­твии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755), Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позво­ночных животных (Страсбург, 1986).

Животные были разделены на 3 группы. В каждую группу входило по 8 животных. Крысы опытной группы в течение 14 дней получали кондитерское изделие, содержащее 15% порошка из листьев облепихи, из расчета 20 мг на 100 г массы тела; животные интактной и контрольной групп - кондитерское изделие, не со­держащее биологическую добавку, в эквивалентной дозе по аналогичной схеме. Циклофосфан в дозе 20 мг на 1 кг массы тела вводили однократно животным кон­трольной и опытной групп внутрибрюшинно за 1 сут до декапитации (под эфирным наркозом). Животным интактной группы циклофосфан не вводили.

Антимутагенное влияние кондитерского изделия, содержащего порошок из листьев облепихи, оцени­вали с использованием методов учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [12]. Учет проводили через 24 ч после введе­ния циклофосфана, а за 2 ч до выведения из экспери­мента животным вводили внутрибрюшинно колхицин в дозе 2,5 мг на 1 кг массы тела. Костный мозг отби­рали из бедренной кости. После гипотенизации клеток в термостате с помощью 0,5% раствора калия хло­рида и фиксации смесью этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) готовили цитогенетические препараты. Аберрации хромосом аназизировали путем визуального просмотра метафазных пластинок при увеличении мик­роскопа χ1000. От каждой особи исследовали по 100 метафазных пластинок, удовлетворяющих необходи­мым требованиям. Повреждения хромосом учитывали согласно рекомендациям, изложенным в методических работах [12].

Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности каталазы в сыворотке крови [13], активности супероксиддисмутазы (СОД) [14] и по концентрации восстановленного глутатиона в крови [15]. Интенсив­ность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по концентрации ТБК-активных продуктов в сыворотке крови [17].

Экспериментальный материал обрабатывали с ис­пользованием пакетов статистических программ Micro­soft Ехсеl 2010 и Statistica 13. Результаты исследований представлены в виде средней величины (М) и ошибки среднего (m). Достоверность найденных отличий сред­них величин между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни (для не­зависимых групп, различия считали статистически зна­чимыми при р<0,05).

Результаты и обсуждение

Для подтверждения целесообразности применения облепихового порошка из листьев Hippophae rhamnoides L. в производстве мучных кондитерских изделий была проведена выпечка и оценка потребительских достоинств кекса с добавкой облепихового порошка. На основе органолептической оценки и анализа физико-химических свойств изделия были обоснованы объемы ввода порошка из листьев облепихи в рецептуру кекса. Оценку проводили по органолептическим и физико-хи­мическим показателям качества изделий.

Установлена целесообразность внесения добавки в пределах 15,0%. При этом происходят изменения пи­щевой ценности изделия, обогащение БАВ (табл. 1).

Цитогенетический анализ костного мозга белых крыс показал (табл. 2), что однократное внутрибрюшинное введение цитостатика достоверно увеличивало количес­тво клеток с хромосомными аберрациями до 12,1±0,7%, тогда как уровень спонтанных аберраций у интактных животных не отличался от данных литературы и соста­вил в среднем 1,0% [12]. Среди структурных нарушений хромосом наблюдались одиночные и парные фрагменты, а также обмены. В контрольной группе количес­тво ахроматических пробелов в клетках костного мозга увеличилось в 7,6 раза по сравнению с показателями животных интактной группы.

Скармливание животным кондитерского изделия, со­держащего порошок из листьев облепихи, способство­вало снижению количества поврежденных клеток на 45%, доли клеток с множественными разрывами хромо­сом - на 50% по сравнению с показателями животных контрольной группы. Число ахроматических пробелов у животных опытной группы на 52% ниже такового у крыс контрольной группы.

Установлено, что однократная инъекция животным циклофосфана вызывает интенсификацию процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул, с последующим дисбалансом клеточного редокс-статуса (табл. 3). Так, в контрольной группе животных отме­чалось угнетение антиоксидантной системы организма, выражающееся в снижении активности каталазы и СОД в 1,5 и 2,1 раза соответственно, а также в уменьшении содержания восстановленного глутатиона на 40% по сравнению с показателями интактной группы. Следс­твием нарушения активности антиоксидантной системы стало повышение содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови на 31% по сравнению с таковым у интактных животных. Интенсификация процессов ПОЛ в контрольной группе животных, вероятно, связана с истощением глутатионовой системы организма, ак­тивацией микросомальных окислительных процессов, участвующих в метаболизме циклофосфана, угнете­нием процессов энергообеспечения клетки в результате прямого повреждения молекул энергетического обмена метаболитами цитостатика и, как следствие, наруше­нием процессов их биосинтеза [17].

Употребление животными кондитерского продукта, содержащего облепиховый порошок из листьев, на фоне однократного введения циклофосфана оказало защитное влияние на состояние эндогенной антиоксидантной системы, снижая содержание конечных про­дуктов ПОЛ и способствуя уменьшению выраженностиокислительного стресса. В опытной группе у животных статистически значимо повышались активность каталазы и СОД, а также уровень восстановленного глутатиона соответственно на 52, 33 и 26% по сравнению с кон­тролем (табл. 3). На фоне употребления исследуемого кондитерского изделия у животных отмечена тенденция к снижению уровня ТБК-активных продуктов.

Таким образом, полученные результаты свидетель­ствуют о том, что кекс с добавкой порошка из листьев облепихи Hiррoрhae rhamnoides L. обладает антиму­тагенными и антиоксидантными свойствами. Под его влиянием восстанавливается редокс-статус организма и ограничивается развитие более глубоких повреждений клеточных структур, индуцированных реакционно-спо­собными продуктами метаболизма циклофосфана, что обусловлено содержанием в нем широкого спектра БАВ, в том числе флавоноидов и каротиноидов, оказывающих выраженное антиоксидантное действие [18, 19].

Литература

1. Тутельян В.А., Киселева Т.Л., Кочеткова А.А. и др. Перспек­тивные источники фитонутриентов для специализированных пищевых продуктов с модифицированным углеводным профи­лем: опыт традиционной медицины // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 4. С. 46-60.

2. Бакиров А.Б., Бадамшина Г.Г., Тимашева Г.В. и др. Применение антиоксидантного напитка у здоровых лиц, работающих в условиях химической нагрузки // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 4. С. 82-86.

3. Цыбикова Д.Ц. Биологически активные вещества облепихи крушиновидной и перспективы их использования в медицине и пищевых отраслях. Улан-Удэ : Изд-во ВСГТУ, 2007. 280 с.

4. ГОСТ 10846-91. Зерно и продукты его переработки. Метод опре­деления белка.

5. ГОСТ 31902-2012. Изделия кондитерские. Методы определения массовой доли жира.

6. ГОСТ 5901-87. Изделия кондитерские. Методы определения массовой доли золы и металломагнитной примеси.

7. ГОСТ 5903-89. Изделия кондитерские. Методы определения сахара.

8. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарствен­ных растений. М. : Высшая школа, 1983. 176 с.

9. Методы биохимического исследования растений / под ред. Ермакова А.И. Л. : Агропромиздат, 1987. 428 с.

10. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М.: Медицина, 1990. 350 с.

11. Ринькис Г.Я., Римакс Х.К, Кушницкая Т.А. Методы анализа почв и растений. Рига, 1987. 95 с.

12. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятяна и др. М. : Гриф и К, 2012. 944 с.

13. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. и др. Метод опреде­ления активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.

14. Макаренко Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах у больныхс хроническими заболеваниями печени // Лаб. дело. 1988. 11. С. 48-50.

15. Akerboom T.P.M., Sies H. Assay of glutathione, glutathione disulfide and glutathione mixed disulfides in biological samples // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 373-382.

16. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современ­ные методы в биохимии. М., 1977. С. 67-69.

17. Кашуро В.А., Глушков С.И., Минаева Л.В., Новикова Т.М. Фар­макологическая коррекция цитофлавином циклофосфаниндуцированного токсического поражения тканей печени и почек в эксперименте // Антибиотики и химиотер. 2010. № 9. С. 29-32.

18. Дадали В.А., Тутельян В.А., Дадали Ю.В., Кравченко Л.В. Каротиноиды. Биодоступность, биотрансформация, антиоксидантные свойства // Вопр. питания. 2010. № 2. С. 4-18.

19. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества растительного происхождения. флаваноны: пищевые источни­ки, биодоступность, влияние на ферменты метаболизма ксено­биотиков // Вопр. питания. 2011. № 5. С. 4-7.