Research of the cadmium intoxication effect on the model of vitamin-mineral deficiency in rats

Abstract

The article presents the results of the study aimed at confirmation of the effectiveness of the rats' adaptive potential reduction under conditions of cadmium salt toxic effects. The 65-days experiment was conducted in male and female Wistar rats. Animals were divided into 6 groups of 3 control and 3 experimental, 30 males and females in each. In total 360 rats were used in the experiment (180 females and 180 males). Rats of the 1st control group received a diet with optimal (75% of the standard semisyntethic diet content) dosage of vitamins B1, B2, B3, B6 and mineral substances, Fe3+ and Mg2+, the rats of the 2nd and the 3rd control group - diets with marginal (30% for males and 28% for females) and submarginal (19% for males and 18% for females) doses of essential micronutrients. Animals of the 1-3th experimental groups received Cd2+ on the background of optimal, marginal and submarginal providing of essential micronutrients. The hematological, biochemical and morphological parameters and the antioxidant status of rats have been studied. The obtained results allowed to identify patterns of cadmium toxic effect strengthen on the background of essential nutrients reducing (in the row from optimal to submarginal). These changes showed erythrocyte and platelet blood profiles, and a set of indicators of the antioxidant defense system and lipid peroxidation of blood and liver. Thus, the activity of erythrocyte antioxidant enzymes - glutathione reductase, glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase in rats of the 1st experimental group were on average by 23% higher than in animals of the 1st control group, the rats of the 2nd and the 3rd experimental groups by 62 and 67% higher, respectively. The content of lipid peroxidation products in blood and liver of male and female rats showed a similar trend: an increase by 5% in the 1st experimental group by 9 and 25% in the 2nd and 3rd experimental groups respectively. Thus, the modification of the diets' vitamin-mineral composition may be usedas a model of adaptive potential reduction in rats in the toxicological research of objects with unknown toxicity, in particular novel food products.

Keywords:loading test, vitamin deficiency, adaptive potential, vitamin-mineral diet composition, laboratory animals, cadmium toxic impact

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (1): 63-71. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10007.

Одним из наиболее простых и эффективных способов снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является использование раци­она, дефицитного по содержанию эссенциальных пище­вых веществ [1]. Данное исследование было направлено на подтверждение эффективности модели дефицита витаминов группы В (тиамина, рибофлавина, ниацина и пиридоксина), солей железа и магния, биологическая роль которых к настоящему времени хорошо известна, для использования в токсикологических исследованиях: поскольку дефицит эссенциальных веществ и связан­ные с ним метаболические нарушения приводят к сни­жению адаптационных возможностей организма [2, 3], есть все основания предполагать, что вследствие этого может повыситься чувствительность к токсическому воздействию.

В качестве токсического фактора был выбран кадмий -токсический агент, действие которого на физиолого-биохимические показатели организма млекопитающих не вызывает сомнения и подробно охарактеризовано [4, 5]. На основании данных о характере проявления токсического действия в зависимости от дозы и времени экспозиции [6] была использована доза кадмия, токсическое действие которой установлено - 1-2 мг на 1 кг массы тела в зависимости от возраста крыс (в пересчете на Cd2+).

Цели настоящей работы - подтверждение эффектив­ности модели последовательного снижения адаптаци­онного потенциала крыс в условиях токсического воз­действия солями кадмия, а также выявление наиболее чувствительных физиолого-биохимических показателей.

Материал и методы

Эксперимент длительностью 65 дней проводили на самцах и самках крыс линии Вистар, исходный возраст ~30 дней. Животные были разделены на 6 групп -3 контрольных и 3 опытных по 30 самцов и самок в каж­дой. Всего в эксперименте было использовано 360 крыс (180 самок и 180 самцов). Животные 1-й контрольной группы получали рацион с оптимальной (75% от уровня стандартного полусинтетического рациона) дозировкой эссенциальных микронутриентов (витаминов В1, В2, В3, В6 и минеральных веществ - Fe3+ и Mg2+), животные 2-й и 3-й контрольных групп - рационы с маргинальной (30% для самцов и 28% для самок) и субмаргинальной (19% для самцов и 18% для самок) дозировками эссенциальных веществ. Животные 1-3-й опытных групп получали с кормом Cd2+ (в виде CdCl2) на фоне оптимальной, маргинальной и субмаргинальной обеспеченности эссенциальными пищевыми веществами соответственно. Экспериментальные рационы, представляющие собой полусинтетический казеиновый рацион [7, 8] с модифи­цированным составом витаминно-минеральных смесей (табл. 1), крысы получали на протяжении всего срока исследований.

Доза кадмия различалась в зависимости от возраста крыс и составляла 1 мг на 1 кг массы тела с 0-го по 35-й день эксперимента и 2 мг на 1 кг массы тела с 36-го по 65-й день эксперимента. Для данного эксперимента были выбраны заведомо действующие дозы кадмия, не вызывающие острого токсического ответа [6]. Исходя из длительности исследования суммарная доза кад­мия, которую получило каждое подопытное животное, составляла 19,1-24,3 мг у самцов и 17,2-18,9 мг у самок (в зависимости от массы тела).

Крыс содержали в пластиковых клетках (по 2 особи в клетке) с древесной подстилкой в отапливаемом (температурный режим +21-23 °С) и вентилируемом по­мещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. В течение эксперимента вели наблю­дения за поедаемостью корма и общим состоянием животных. Массу тела измеряли еженедельно, постмортальную некропсию и отбор материала для гематоло­гических и биохимических исследований проводили на 65-й день эксперимента.

Для определения гематологических показателей использовали гематологический анализатор "Coulter AcTTM 5 diff OV" и реактивы ("Beckman Coulter", США). Биохимические показатели сыворотки крови определяли на биохимическом анализаторе ("Konelab 20i", Финлян­дия) с использованием реактивов фирмы "Thermo Fisher Scientific". Активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы опреде­ляли спектрофотометрическим методом, содержание малонового диальдегида (МДА) в крови и печени - спектрофотометрическим методом по [9-17]. В статье приве­дены только те показатели, которые демонстрировали значимые отличия от контроля.

Результаты приведены в виде М±m, где М - выборочное среднее измеряемых величин, а m - стандартная ошибка, а также в долях (в %) или в абсолютных числах.

Полученные данные обработаны методами парамет­рической статистики: характер распределения количес­твенных признаков определен с помощью х2-критерия Пирсона, равенство дисперсий - с помощью F-критерия Фишера. Достоверность различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсии, оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости (p) принят равным 0,05 [18]. В соответствии со структурой иссле­дования сравнивали количественные признаки опытных групп с соответствующими им контрольными группами.

Результаты и обсуждение

Общее состояние крыс контрольных и опытных групп было удовлетворительным, по внешнему виду, пове­дению и качеству шерстного покрова различий между группами не выявлено. Поедаемость корма самцами контрольных и опытных групп составляла ~14 г/сут на одно животное в начале эксперимента и ~21 г/сут в конце эксперимента, самками ~14 и ~16 г/сут соответственно. При анализе динамики массы тела эксперименталь­ных животных было отмечено, что масса тела самцов и самок 1-3-й опытных групп была во всех случаях ниже, чем у соответствующих животных 1-3-й контрольных групп (в диапазоне от 3 до 12% у самцов и от 1 до 9% у самок) (см. рисунок). Следует отметить, что разли­чия массы тела животных в контрольных группах были более выражены у самцов и варьировали от 5 до 18% и менее выражены у самок - от 9 до 11%.

При сравнении относительной массы внутренних ор­ганов самцов 1-й опытной группы с соответствующими показателями 1-й контрольной группы отмечены до­стоверные различия массы селезенки и легких; у жи­вотных 2-й опытной группы были выявлены различия в массе печени, почек, селезенки, сердца, мозга, семенников, надпочечников, гипофиза по сравнению с живот­ными 2-й контрольной группы; у животных 3-й опытной группы - различия в массе печени, почек, селезенки, сердца, легких, тимуса, мозга, семенников, надпочечни­ков, гипофиза по сравнению с животными 3-й контроль­ной группы. При сравнении массы внутренних органов самок 1-й опытной группы с соответствующими показа­телями 1-й контрольной группы отмечены достоверные различия массы печени, почек, сердца, легких; у жи­вотных 2-й опытной и 2-й контрольной групп выявлены различия массы печени, почек, сердца, легких, тимуса, мозга, надпочечников, гипофиза; у животных 3-й опыт­ной и 3-й контрольной групп - различия в массе пе­чени, сердца, легких, мозга, надпочечников, гипофиза (табл. 2). Следует отметить, что все отмеченные измене­ния массы внутренних органов находились в пределах физиологических колебаний (от 1 до 27%), характерных для крыс линии Вистар, и поскольку массы внутрен­них органов у животных опытных групп в большинстве случаев были выше, чем у животных соответствующихконтрольных групп, можно сделать вывод, что различия обусловлены снижением массы тела животных опытных групп (см. рисунок), а это повлияло на расчетный пока­затель относительной массы внутренних органов. Таким образом, выявленные различия нельзя расценивать как свидетельство негативного влияния токсического фактора.

Биохимические показатели сыворотки крови у самцов 1-й опытной группы не имели достоверных отличий от контроля. Животные 2-3-й опытных групп демонстри­ровали целый ряд статистически значимых различий с аналогичными показателями у крыс соответствующих контрольных групп [концентрация глобулина, уровни триглицеридов, общего билирубина, мочевины, креатинина, глюкозы, холестерина, активности лактатдегидрогеназы, креатинфосфокиназы, аланинамино-трансферазы (АЛТ), содержание кальция, магния, железа, фосфора]. Выявленные различия находились в диапа­зоне физиологических колебаний и варьировали от 4 до 63%, что, согласно опыту наших предыдущих иссле­дований, не является однозначным свидетельством при­сутствия негативного воздействия, поскольку различия биохимических показателей могут быть весьма значи­тельны и у животных, получавших идентичные по со­ставу рационы без токсической нагрузки. В то же время было отмечено, что содержание железа в сыворотке крови самцов 2-й и 3-й опытных групп было ниже нормы в 2,2 и 2,5 раза соответственно. По сравнению с анало­гичными показателями животных 2-й и 3-й контрольных групп концентрация железа была соответственно на 59 и 63% (p<0,05) ниже. У крыс 1-й опытной группы содер­жание железа не выходило за пределы нормы и было ниже контрольных значений на 13% (p>0,05) (табл. 3).

Биохимические показатели сыворотки крови у самок 1-3-й опытных групп также демонстрировали статистически значимые различия с аналогичными показате­лями у крыс соответствующих контрольных групп (кон­центрация глобулина, уровни триглицеридов, общего и прямого билирубина, мочевины, мочевой кислоты, креатинина, глюкозы, холестерина, активности лактатдегидрогеназы, креатинфосфокиназы, АЛТ, аспартатаминотрансферазы, содержание кальция, магния, железа, фосфора). Выявленные различия в целом находились в диапазоне физиологических колебаний и варьировали от 6 до 67%. Уровень содержания железа в сыворотке крови самок 2-й и-3-й опытных групп был ниже нормы в 1,1 и 1,4 раза соответственно. По сравнению с анало­гичными показателями 2-й и 3-й контрольных групп уро­вень железа был соответственно на 63 и 67% (p<0,05) ниже. У крыс 1-й опытной группы содержание железа не выходило за пределы нормы и было ниже контроль­ных значений на 28% (p<0,05) (табл. 3).

Оценка результатов гематологических исследований животных 1-3-й опытных групп позволила выявить оп­ределенные закономерности изменений показателей эритроцитарного профиля: концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее со­держание гемоглобина в эритроците в целом были на 11-44% (p<0,05) ниже, чем соответствующие показатели животных 1-3-й контрольных групп. Общее количество эритроцитов у животных 2-й и 3-й групп было ниже кон­трольных значений на 23 и 25% у самцов и на 10 и 16% у самок соответственно, при этом в 1-й опытной группе значение данного показателя было на ~10% выше, чем у самцов и самок контрольных групп. Средняя концент­рация гемоглобина в эритроците животных 2-3-й опыт­ных групп была выше на 5-6% у самцов и 1-6% (p<0,05) у самок, а животных 1-й опытной группы - на 3 и 3% (p<0,05) ниже таковой у самцов и самок соответствую­щих контрольных групп. Значения показателей тромбоцитарного профиля у крыс опытных групп были зна­чительно выше, чем у крыс контрольных групп: общее количество тромбоцитов и тромбокрит - на 40-156% (р<0,05), средний объем тромбоцита - на 8-26% (р<0,05) (табл. 4).

Показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов эритроцитов у крыс 1-3-й опытных групп проявляли линейные изменения (повышения концентрации) в ряду понижения содер­жания эссенциальных микронутриентов в рационах (табл. 5). Так, у самцов 1-3-й опытных групп активность глутатионпероксидазы возрастала на 38, 71 и 100%, каталазы - на 27, 62 и 117%, супероксиддисмутазы -на 25, 68 и 82% (р<0,05), у самок - на 19, 63 и 69%; 9, 62 и 81%; 19, 55 и 60% (р<0,05) соответственно. Активность глутатионредуктазы в эритроцитах самцов и самок 1-й и 2-й опытных групп демонстрировала сходную тен­денцию и была выше аналогичных показателей у крыс 1-2-й контрольных групп на 26 и 64% (у самцов) и 18 и 52% (у самок). Вопреки сложившемуся тренду у сам­цов 3-й опытной группы активность глутатионредуктазы была лишь на 18% (р<0,05) выше, чем у самцов 3-й контрольной группы, у самок разница составляла 6% (р>0,05).

Содержание МДА в печени крыс опытных групп также повышалось от 1-й к 3-й группе: у самцов отличия от соответствующих показателей 1-3-й контрольных групп составляли 14, 21 и 35% <0,05), у самок - 6, 11 и 25% <0,05). Содержание МДА в эритроцитах самцов 1-3-й опытных групп было выше, чем у контрольных животных на 4, 4 и 24% <0,05), у самок - на 7, 16 и 35% <0,05) соответственно. Концентрация МДА в сыворотке крови самцов и самок 1-2-й опытных групп не имела значимых отличий от контроля, животные 3-й опытной группы демонстрировали некоторое повышение этого показателя: самцы - на 16%, самки - на 14% (р<0,05).

Таким образом, основные цели данного эксперимента были достигнуты: подтверждено снижение адаптацион­ного потенциала и формирование у крыс гипо-, нормо- и гиперчувствительности к воздействию токсических факторов (на примере воздействия солями кадмия), сформирован проект перечня физиолого-биохимических параметров (биомаркеров), реагирующих на токси­ческое воздействие, включающий показатели эритроцитарного и тромбоцитарного профиля крови, содержание железа в сыворотке крови, показатели системы антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов крови и печени. В последующих двух модельных исследованиях, которые будут проведены по аналогич­ной схеме с этанолом и четыреххлористым углеродом в качестве токсикантов, будет окончательно опреде­лен перечень биомаркеров, подлежащих обязательному изучению в токсикологических экспериментах.

Работа проведена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 16-16-00124).

Литература

1. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии, при оценке опасности химических соединений. М. : Медицина, 1975. 328 с.

2. Сидорова Ю.С., Бекетова Н.А., Вржесинская О.А., Коденцова В.М. и др. Влияние витаминной обеспеченности на протекание общего адаптационного синдрома у растущих крыс // Вопр. питания. 2014. Т.83, № 5. С. 20-25.

3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Сото С.Х. и др. Биохимические показатели плазмы крови и некоторые параметры антиоксидантого статуса крыс при полигиповитаминозах разной степени // Бюл. экспер. биол. 2012. № 10. С. 439-442.

4. Волкова Н.А., Карплюк И.А. Изучение мутагенной активности кадмия при пероральном поступлении // Вопр. питания. 1990. № 1. С. 74-76.

5. Goyer R., Klaassen C., Waalkes M. Metal toxicology. Michigan: Aca­demic Press, 1995. 525 p.

6. El-Mansy A.A., Mazroa S.A., Hamed W.S. et al. Histological and immunohistochemical effects of Curcuma longa on activation of rat hepatic stellate cells after cadmium induced hepatotoxicity // Biotech. Histochem. 2016. Vol. 91, N 3. P. 170-181.

7. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. С. 30-38.

8. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: Методические указания (МУ 2.3.2.2306-07). М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.

9. Костюк В.А., Потапович А.И. Определение продуктов перекисного окисления липидов с помощью тиобарбитуровой кислоты в анаэ­робных условиях // Вопр. мед. химии. 1987. Т. 33, № 3. С. 115-118.

10. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, № 2. С. 56-58.

11. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 40, 2. С. 59-61.

12. Ernster L., Nordenbrandt K. Microsomal lipid peroxidation // Meth­ods in Enzymology. Oxidation and Phosphorylation. New York: Ac. Press. 1967. Vol. 10. P. 574-580.

13. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. Vol. 23, N 3. P. 302-311.

14. Mills G.C. The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. P. 502-506.

15. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46, N 2. P. 849-854.

16. Oshino N., Chance B. The role of H2O2 generation in perfused rat liver and the reaction of catalase compound I and hydrogen donors // Arch Biochem Biophys. 1973. Vol. 154, N 1. P. 117-131.

17. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. Effect of riboflavin depletion and repletion on the erythrocyte glutathione reductase in the rat // J. Nutr. 1971. Vol. 101, N 11. P. 1459-1466.

18. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2006. 312 с.

19. Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А., Тышко Н.В., Пашорина В.А. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. 2. С. 10-16.

20. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology reference data - Wistar rat. Amsterdam: Elsevier, Norrth-Holland biochemical, 1981. P. 358.

21. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington: Elsevier Academic Press, 2006. 912 p.

22. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. Lond.: Taylor & Francis Limited, 1997. 272 p.