The evaluation of biological value and immunochemical characteristics of the coagulated chicken egg white

Abstract

The aim of the study was to investigate in vivo the biological value of the coagulated chicken egg white on growing rats and a comparative immunochemical evaluation in vitro of its antigenic power. The experiment was carried out on 50 growing Wistar male rats with a body weight of 80±5 g. The animals were randomly divided into 3 groups (n=16): control group G1 and two experimental groups G2 and G3. The animals of the control group (G1) received a basic isocaloric and isonitrogenous (20% protein of casein by caloric content) semi-synthetic diet. The animals of the experimental groups G2 and G3 received the same semi-synthetic diet in which casein was replaced by chicken egg white (CEW) and coagulated CEW, respectively. The average food intake of group G3 animals, who received the CEW coagulate, was significantly lower (13.7±0.6 g per day, p<0.05) in comparison with the control group G1 (18.4±0.6 g) and the experimental group G2 (19.2±0.5 g). Moreover, body weight gain of animals treated with coagulated CEW didn't differ significantly from the control G1 animals. Already on the 8th day of the experiment, the body weight gain of G2 animals, who consumed native CEW, was significantly higher in comparison with both other groups. The protein efficiency ratio (PER) for animals of the G3 group was significantly higher (1.96±0.04) than the values for the animals of the control group G1 receiving casein (1.49±0.05, p<0.01), and for the animals of the experimental group G2 receiving CEW (1.60±0.02, p<0.05). The results of immune-enzymatic testing of the initial antigenic power of ovalbumin in native CEW indicated that its content was 33.0% relative to the standard ovalbumin value, antigenic power of which was assumed to be 100%. The developed process of coagulation contributed to a decrease in antigenic power to 2.17%. The obtained data indicate a high biological value and low antigenic power of the coagulated CEW, which makes it prospective for the usage in the composition of food products of mass demand and specialized food products.

Keywords:coagulated chicken egg white, biological value, protein efficiency ratio, true digestibility, antigenic power

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (1): 44-50. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10005.

Сбалансированный аминокислотный состав белка куриного яйца (БКЯ) определяет перспективы его эффективного использования в качестве функцио­нального пищевого ингредиента (ФПИ) в составе широ­кого спектра специализированных пищевых продуктов высокой биологической и пищевой ценности. Раз­работанная технология получения коагулированного БКЯ направлена на расширение ассортимента функ­циональных пищевых яйцепродуктов, характеризуе­мых высокими органолептическими показателями [1]. Проведенное ранее исследование свидетельствует, что в коагулированном яичном белке, получаемом тепловой обработкой и подкислением органическими кислотами яичной массы, содержание незаменимых аминокислот существенно не отличалось от исходного охлажденного белка, за исключением некоторого снижения содержания триптофана вследствие пере­хода этой аминокислоты в сыворотку [2]. Показатели биологической ценности белка, как известно, зависят и от его аминокислотного скора, и от его усвояемости и наиболее обоснованно определяются в биологи­ческом эксперименте на растущих животных или в исследовании с привлечением добровольцев [3]. Важ­ным показателем перспективности применения белка в составе продуктов для питания детей (особенно ран­него возраста) является снижение его потенциальных аллергизирующих свойств, зависящих в определен­ной степени от сохранения исходной антигенности [4]. Соответственно целями нашей работы в плане харак­теристики коагулированного БКЯ стали исследованиеего биологической ценности in vivo на растущих кры­сах-самцах линии Вистар и сравнительная иммунохимическая оценка его антигенности in vitro.

Материал и методы

Коагулированный БКЯ получен отделением от желт­ка куриного яйца, перемешиванием жидкой белковой массы, подкислением лимонной кислотой с добавле­нием хлористого натрия (0,13 и 0,8% соответственно), выдерживанием при комнатной температуре (24 °С) в течение 15 мин и последующей тепловой обработкой смеси в одну стадию до достижении структуры зерненого творога при постоянном перемешивании [5]. После отделения жидкой фазы полученный коагулят был ох­лажден и лиофильно высушен. Нативный БКЯ получен отделением от желтка куриного яйца и лиофильно высушен. В рационе контрольной группы использовали казеин пищевой кислотный ("Тагрис Молоко", РФ, 90% белка).

Содержание антигенных структур овальбумина (интактного овальбумина): в лиофилизированных образцах нативного БКЯ и диспергированного коагулированного БКЯ определяли непрямым иммуноферментным ме­тодом согласно [7], используя в качестве стандарта (интактного овальбумина) 5-кратно перекристаллизо­ванный овальбумин куриного яйца, поликлональные моноспецифические кроличьи антитела против этого белка и автоматический иммуноферментный анализа­тор "ЭФОС 9305" (ОАО "МЗ Сапфир", РФ). Для про­ведения иммуноферментного анализа 1 г образца коа­гулированного БКЯ был диспергирован в 10 см3 0,01 М K-фосфатного буфера рН 7,3±0,1 с 0,15 М NaCI (PBS) в течение 5 мин на установке "Т 25 basic" (Германия) до получения однородной мелкодисперсной взвеси. Затем к 1,0 см3 взвеси добавляли 9,0 см3 PBS, содержащего 0,5% нормальной лошадиной сыворотки.

Сравнительную оценку in vivo биологической и пище­вой ценности коагулированного БКЯ проводили в экспе­рименте на 50 растущих крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±5 г, полученных из филиала "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинс­ких технологий Федерального медико-биологического агентства". Исследования на животных выполнены в со­ответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 193н "Об утверждении правил надлежащей ла­бораторной практики" и требованиями, изложенными в Национальном стандарте РФ ГОСТ Р 53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики". Жи­вотные были адаптированы в лаборатории в течение 7 сут до начала эксперимента. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. В эксперимент были взяты животные без при­знаков отклонений здоровья.

Животных распределяли по группам с применением принципа рандомизации таким образом, чтобы сред­няя масса тела животных статистически не различа­лась между группами. После распределения по груп­пам животных содержали по 1 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 25±1 °С. Животные были разделены на 3 группы: контрольную 1-ю группу (n=16) соста­вили крысы с массой тела 119±1,5 г и две опытные, 2-ю и 3-ю группы (n=16), - крысы с массой тела соответс­твенно 118±2,3 и 118±1,9 г. Животные всех групп получали базовый изокалорийный (380 ккал/100 г сухого корма) и изоазотистый (20% белка казеина по калорийности) полусинтетический рацион. Животные 1-й контрольной группы (Г1) получали рацион, в котором в качестве источ­ника белка использовали казеин, животные опытных 2-й (Г2) и 3-й (Г3) групп получали рацион, в котором казеин был полностью заменен на БКЯ и коагулированный БКЯ соответственно. Состав полусинтетических рационов всех групп представлен в табл. 1.

Воду и корм животные получали ad libitum. На протя­жении всего исследования, длительность которого со­ставила 29 сут, определяли индивидуальные показатели поедаемости корма и прироста массы тела каждого жи­вотного: через сутки на протяжении всего эксперимента контролировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали.

С 24-х по 26-е сутки, в так называемый обменный пе­риод, помимо перечисленных показателей определяли количество азота в корме и выведенного с калом.

На 29-е сутки депривированных голодом в течение ночи животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. Собранную после декапитации животного кровь центрифугировали в те­чение 15 мин при 500g, сыворотку хранили при -20 °С.

В сыворотке крови на автоматическом анализаторе "Konelab 20i" ("Thermo Scientific", Финляндия) опреде­ляли концентрации триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП).

Сравнительное определение биологической ценности коагулированного белка куриного яйца, нативного белка куриного яйца и казеина "ростовыми" методами. Оце­нивали скорость роста лабораторных животных и оп­ределяли коэффициент эффективности белка (КЭБ) индивидуально для каждой крысы. Определяли при­рост массы тела у лабораторных животных в граммах на 1 г потребленного ими белка [3, 9, 10] и рассчитывали КЭБ по формуле (1):

где ΔW - прирост массы тела крысы (в граммах) за экспериментальный период, Wt - масса тела крысы (в граммах) в последние сутки экспериментального периода, W0 - масса тела крысы (в граммах) в первые сутки экспериментального периода; Ip - количество белка, потребленного крысой (в граммах) за экспери­ментальный период.

Количество белка, потребленного крысой (Ip), рассчи­тывали по его экспериментально определенному содер­жанию в съеденном крысой корме. Съеденный крысой корм (поедаемость) определяли по разности между количеством корма, полученным крысой за весь экспе­риментальный период, и суммарным не съеденным ею остатком этого корма.

Сравнительное определение истинной усвояемости коагулированного белка куриного яйца, нативного белка куриного яйца и казеина. Метод расчета истинной усво­яемости азота (Dист) основан на определении доли ис­тинно абсорбированного в желудочно-кишечном тракте крысы азота (Аист), выраженной в процентах от азота, потребленного животным с пищей (I). Значение истин­ной усвояемости азота соответствует значению истин­ной усвояемости белка. Количество азота, выделяемого с калом в течение суток крысой, находящейся на без­белковом рационе, принимали равным 0,023 г [10].

Истинную усвояемость белка рассчитывали по фор­муле:

где Dист - истинная усвояемость (в %), I - общее коли­чество азота, потребленного крысой с пищей в течение балансового периода (в граммах), F - количество азота, экскретированного с калом крысой в течение балансо­вого периода (в граммах), Fk - количество азота, экскретированного с калом крысой, находившейся на безбелковой диете в течение такого же балансового периода (в граммах), Аист. - истинное количество азота, абсорбированного в желудочно-кишечном тракте у крысы в течение балансового периода (в граммах).

Истинную усвояемость белка рассчитывали индивиду­ально для каждой крысы.

Содержание общего азота в рационе и фекалиях оп­ределяли методом Кьельдаля (с предварительной мине­рализацией) [6] с применением автоматического анали­затора "Kjeltec 8100" ("FOSS Analytical AB", Швеция).

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20, используя непара­метрический ранговый критерий Мана-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

На протяжении всего эксперимента с использованием растущих крыс линии Вистар по сравнительному опре­делению биологической и пищевой ценности коагули­рованного БКЯ, исходного нативного БКЯ и эталонного белка - казеина коровьего молока - общее состояние всех животных по внешнему виду, качеству шерстного покрова и поведению при ежедневном осмотре было удовлетворительным.

Средняя поедаемость корма для животных контроль­ной 1-й группы за весь период составила 18,4±0,6 г, для животных опытной 2-й группы - 19,2±0,5 г и для живот­ных 3-й опытной группы - 13,7±0,6 г. Средняя поедаемость корма животными опытной 3-й группы, получав­шими коагулят БКЯ, была статистически значимо ниже по сравнению как с животными 1-й контрольной группы, так и с животными 2-й опытной группы Г2 (р<0,05).

На рис. 1 приведен график изменения массы тела жи­вотных всех групп за весь период эксперимента.

Как видно из представленных данных, уже на 8-е сут­ки эксперимента прирост массы тела животных 2-й опыт­ной группы, получавшей БКЯ, был статистически значимо выше по сравнению с параметром обеих других групп, причем средняя потребляемость корма животными этой группы от контрольной группы достоверно не отличалась. Прирост массы тела животных 3-й опытной группы, полу­чавших коагулированный БКЯ, достоверно от 1-й конт­рольной группы не отличался при статистически значимо более низкой потребляемости корма.

В табл. 2 представлены результаты определения пока­зателей липидного обмена и глюкозы сыворотки крови.

Из представленных данных видно, что статистических различий таких показателей липидного обмена, как концентрации холестерина, триглицеридов и ЛПНП, для всех групп не обнаружено. Концентрация ЛПВПу крыс из 3-й группы было выше (р<0,01) по срав­нению с показателем животных 2-й опытной группы и при этом находилась в пределах нормы для данного вида животных. ЛПВП в первую очередь обеспечивают функцию обратного транспорта холестерина, помимо этого выполняют ряд других протективных функций: осуществляют транспорт полиненасыщенных жир­ных кислот, обладают антиоксидантной активнос­тью, регулируют активность глюкокортикоидов. Выявленное повышение содержания ЛПВП в сыворотке крови животных, потреблявших коагулят БКЯ, отра­жает благоприятное влияние этого белка на липидный обмен.

Концентрация глюкозы натощак у животных опытной группы Г2 была достоверно ниже по сравнению с пока­зателем животных контрольной группы.

В табл. 3 представлены результаты определения из­менений массы тела животных, поедаемости ими корма и истинной усвояемости казеина, БКЯ и коагулята БКЯ в обменный период.

В так называемый обменный период крысы всех групп продолжали набирать массу тела, хотя средние значения этого показателя достоверно не различались. Важно отметить, что при этом более низкой прибавке массы тела животных 3-й опытной группы как по срав­нению с животными контрольной, так и с животными другой опытной группы соответствовала более низкая потребляемость корма.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что среднее количество коагулированного БКЯ, потреб­ляемого крысой с кормом за обменный период, было более чем в 1,5 раза меньше такового для живот­ных, потреблявших стандартный казеиновый рацион и содержащий БКЯ рацион, а истинная усвояемость всех трех белков при этом практически не разли­чалась.

На рис. 2 показаны средние значения коэффициента эффективности казеина, БКЯ и коагулята БКЯ, опреде­ленные за весь период эксперимента.

Как видно из представленных данных, КЭБ для жи­вотных 3-й группы, получавших коагулят БКЯ, был ста­тистически значимо выше по сравнению со значениями КЭБ как для животных контрольной группы, получавших казеин (р<0,01), так и для животных 2-й опытной группы, получавших БКЯ (р<0,05). В свою очередь КЭБ для животных, получавших БКЯ, был также достоверно, хотя и незначительно, выше по сравнению с его значением для животных контрольной группы, получавших казеин (Р<0,05) Результаты иммуноферментного тестирования со­хранности исходной антигенности овальбумина в нативном БКЯ свидетельствовали, что его содержание составило 33,0% относительно стандарта интактного овальбумина, антигенность которого принята за 100%. Разработанный процесс коагуляции способствовал сни­жению антигенности (также относительно антигенности стандарта интактного овальбумина) до 2,2%.

Заключение

Совокупность полученных данных свидетельствует о высокой биологической ценности коагулированного БКЯ, полученного с использованием кислотно-солевого гидролиза и теплового нагрева. Результаты иммуноферментного тестирования сохранности исходной антигенности овальбумина в коагулированном БКЯ (показателя потенциальной аллергенности) свидетельствуют о том, что тепловое воздействие в сочетании с подкислением раствора привело к снижению этого показателя в ко­агулированном белке по сравнению с нативным БКЯ более чем в 15 раз. Этот результат является важным дополнительным аргументом перспективности использования коагулята БКЯ в составе пищевых продук­тов массового спроса и специализированных пищевых продуктах.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-04047).

Литература

1. Гущин В.В., Стефанова И.Л., Клименкова А.Ю. Разработка новых видов продуктов из яичного белка // Птица и птицепродукты. 2015. № 2. С. 22-24.

2. Стефанова И.Л., Клименкова А.Ю. Обоснование технологии производства коагулированного яичного белка и продуктов на его основе // Птица и птицепродукты. 2016. № 3. С. 37-40.

3. Высоцкий В.Г. Экспериментальное обоснование потребностей человека в белке : автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 1977.

4. Ногаллер А.М., Гущин И.С., Мазо В.К., Гмошинский И.В. Пищевая аллергия и непереносимость пищевых продуктов. М. : Медици­на, 2008. 336 с.

5. Гущин В.В., Кулишев Б.В., Стефанова И.Л., Агафонычев В.П., Юхина И.А, Шахназарова Л.В. Способ получения яичного белко­вого продукта. Пат. РФ 2406371, 2008.

6. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М. : Медицина, 1998. С. 37-42, 183-185.

7. Круглик В.И., Зорин С.Н., Гмошинский И.В. Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со сред­ней степенью гидролиза. Пат. РФ 2375910, 2009.

8. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Сар­кисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценкаобогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 46-55.

9. Высоцкий В.Г., Яцышина Т.А., Рымаренко Т.В., Мамаева Е.М. О методах определения биологической ценности белков // Мед. реферат. журн. 1976. Разд. VII, № 6. С. 24-35.

10. Высоцкий В.Г., Мамаева Е.М. К оценке эндогенных потерь азота у белых крыс различного возраста // Вопр. питания. 1979. № 3. С. 48-53.