Comprehensive assessment of the content of polycyclic aromatic hydrocarbons and dependence of their accumulation in meat products

AbstractDependences of the quantity of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) on the conditions for the formation of components of smoke compositions, the type of wood, the formulation, the technology of production, and the type of packaging material have been studied. An increase in temperature from 450 to 700 °C lead to a 2-3-fold increase in the amount of PAH in meat products. It has been established that the use of a polyamide coating reduced the total carcinogenicity of sausages by 2.0-3.7 fold compared with protein and natural shells, which in terms of PAH accumulation were the most dangerous. Fibrous shell was able to provide a reduction in PAH level in the product up to 40% compared to natural one. The permeability of the fat fraction of the product for PAH was up to 10 fold higher than that of proteins and carbohydrates. The data obtained made it possible to determine the safety criteria for smoked meat products, taking into account the potential carcinogenic hazard of each PAH. The optimal indicators of the presence of PAH in the product are 8 PAH (benz[a]pyrene, chrysene, benz[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[g,h,i]perylene, dibenz[a,h]anthracene, indeno[1,2,3-c,d] pyrene). The PAH exposure on the human body has been determined under the constant consumption of smoked meat products. The prospective use of barrier protection technologies, substances possessing antiradical activity, and protective films to reduce residual PAH content has been proved. The results of the studies showed a 5-fold decrease in the total amount of PAH when using films impregnated with fat-containing micro anemulsion of vegetable or animal fat. The effect increased when meat was marinateв in a 9% solution of acetic acid or 3% solution of ascorbic acid.

Keywords:polycyclic aromatic hydrocarbons, smoked meat products, high performance liquid chromatography, food products

Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (6): 125-133.

Коптильный дым возникает в процессе пиролиза дре­весины. В основе пиролиза лежат свободнорадикальные реакции термодеструкции гемицеллюлоз, цел­люлозы и лигнина, протекающие при температуре выше 200 °C. Составные части древесины - около 50% целлю­лозы, почти 25% лигнина и около 25% гемицеллюлозы (не считая воды) - превращаются при этом в фенолы, спирты, карбонильные соединения. Положительными эффектами попадания в продукт коптильных веществ и физико-химических превращений в нем являются образование вкуса и аромата копчености, консервиру­ющее действие (бактерицидный, антиокислительный и антипротеолитический эффекты). Однако копчение пищевых продуктов сопровождается образованием ток­сикологически вредных компонентов дыма, а имен­но полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) [1].

ПАУ оказывают ярко выраженные канцерогенные, мутагенные и тератогенные действия на организм че­ловека [2]. Проблема ПАУ особенно остра, поскольку они обладают свойством аккумуляции, и для них не­льзя установить предельные величины, ниже которых эти вещества не будут обладать канцерогенным потен­циалом [3].

В странах ЕС ужесточаются нормы содержания ПАУ, расширяется список контролируемых веществ. Так, с сентября 2012 г. в обязательном порядке наряду с уже установленным максимально допустимым со­держанием бенз[а]пирена (5 мкг/кг), контролируются 4 ПАУ: бенз[а]пирен, бенз[а]антрацен, бенз[b]флуорантен и хризен, суммарное содержание которых не должно превышать 30 мкг/кг. А с сентября 2014 г. предельно допустимая норма для бенз[а]пирена - не более 2 мкг/кг, для 4 ПАУ - не более 12 мкг/кг [4]. В Российской Федерации, согласно ТР ТС 021/2011 и ТР ТС 034/2013, остаточное содержание бенз[а]пирена не должно превы­шать 1 мкг/кг, содержание других ПАУ при этом не нор­мируется. Высокая канцерогенная активность минорных ПАУ, их химическая устойчивость и синергетический эф­фект воздействия нескольких ПАУ подтверждают необхо­димость жесткого контроля их содержания в мясной про­дукции.

Цель работы - выявление зависимостей остаточ­ного содержания ПАУ в мясной продукции от условий формирования компонентов дымных композиций, вида древесины, рецептуры, технологии производства и типа упаковочного материала, а также поиск потенциальных путей снижения накопления ПАУ.

Материал и методы

Определение ПАУ проводили методом высокоэффек­тивной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использова­нием хроматографической системы Ultimate 3000 ("Dionex", США) с флуоресцентным детектором RF2000 ("Dionex", США) и колонкой Supelco LC-PAH, 150x4,6 мм, 5 мкм. Для разделения смеси ПАУ использовали градиентные условия элюирования: элюент А (дистиллированная вода) от 40 до 0% за 30 мин; элюент В (ацетонитрил) с 60 до 100% за 30 мин. Объем вводимой пробы 20 мкл, скорость потока 1,2 мл/мин. Используемая хроматографическая колонка способна разделить структурные изомеры ПАУ благодаря силикагельным частицам, хи­мически модифицированным фенильными группами. Высокая чувствительность флуоресцентного детектора по отношению к ПАУ позволяет обнаружить даже сле­довые количества на уровне 0,01 мкг/кг. В качестве аналитического стандарта использовали смесь 15 ПАУ PAH-Mix 170 (Dr. Ehrenstrofer DRE-LA20950170AL, Герма­ния). Параметры идентификации для флуоресцентного детектора представлены в табл. 1.

Выделение ПАУ из мясного продукта проводили путем щелочного гидролиза 5 г пробы в 50 см3 2М КОН в эта­ноле. Экстракцию ПАУ проводили 50 см3 циклогексана с переэкстракцией целевой фракции ПАУ 50 см3 раствора диметилформамида с дистиллированной водой (9:1). Для очистки от жировой фракции в экстракт добавляли 50 см3 1% раствора NaCl в дистиллированной воде. Затем про­водили повторную переэкстракцию, добавляя дважды по 30 см3 циклогексана. Экстракт упаривали на роторном испарителе, вакуумируя при 40°С. Для очистки пробы от посторонних органических примесей использовали твер­дофазную экстракцию на силикагеле (Silica - SPE, Bulk Sorbent, Agilent, США) [5]. На рис. 1 представлена хроматограмма разделения стандартной смеси 15 ПАУ.

Анализ спиртов, карбоновых кислот, эфиров и фено­лов в копченой мясной продукции проводили на газовом хроматографе 7890A ("Agilent Thechnologies", США) с масс-спектрометрическим детектором 5975C VL MSD ("Agilent Thechnologies", США).

Результаты и обсуждение

Проводившиеся ранее исследования показали, что основную роль в специфике аромата играют фенольные и карбонильные вещества, а также β-лактоны. Ключевыми в аромате коптильного дыма являются следующие вещества: циклотен, вератрол, р-этилфенол, гваякол, 4-метилгваякол, 4-пропилгваякол, ме-тилсирингол [6]. Проведенные исследования мето­дом газовой хромато-масс-спектрометрии, помимо вышеперечисленных веществ, позволили обнаружить в копченой мясной продукции в значительных количест­вах терпеновые спирты - 0,01-0,1% (фитол, изофитол и др.), карбоновые кислоты - 0,01-0,05% (фталевая кис­лота и др.), фенольные вещества - 0,05-0,2% (фенол, дифенилметан, 3,3'-диметилбифенил, 2,2',3,3'-тетраме-тилбифенил и др.) и эфиры - 0,1-0,3% (дибутилфталат), образующие вкусоароматические свойства продукта, а также токсичные вещества, такие как ароматические амины, в количестве 0,01-0,05% (анилин), ациклические углеводороды 0,02-0,1% (генэйкозан), ароматические углеводороды 0,02-0,05% (нафталин) и канцерогеные ПАУ 5-50 мкг/кг.

Доля фенолов в формировании типичного аромата копчения в среднем составляет 66%, карбонильных веществ на 14%, а остальных составляющих на 20%. Ис­следования по обработке фенолами, изолированными из жидких коптильных препаратов (так называемое бездымное копчение), образцов хребтового шпика пока­зали, что в среднем около 75% фенольных веществ пре­парата по мере диффузии в жировую фракцию шпика, состоящую в основном из насыщенных триглицеридов, в дальнейшем не идентифицируются. Гипотеза химической нейтральности жиров по отношению к коптильным компонентам на сегодня не опровергнута. Пока бес­спорно доказано лишь участие белковых и углеводных составляющих в реакциях химического взаимодействия с коптильными веществами [7, 8]. Однако по результатам исследований количественного содержания ПАУ было показано, что в сырокопченых колбасах, содержащих в рецептуре хребтовый шпик, остаточное количество ПАУ до 30% выше, чем в продуктах данного типа копчения, в рецептуру которых хребтовый шпик не вклю­чен. Тенденция накопления канцерогенных ПАУ именно в жировой фракции продукта очевидна.

Представляло интерес оценить влияние условий фор­мирования дымных компонентов распада древесины на содержание ПАУ в копченых мясных продуктах. По результатам исследования более высокая темпе­ратура образования дыма приводила к повышению концентрации ПАУ в пищевом продукте. Повышение температуры сопровождалось повышением содержания CO и CO2 и снижением концентрации кислорода. Со­держание ПАУ росло прямо пропорционально по мере увеличения температуры образования дыма и увеличе­ния концентрации CO и CO2 и обратно пропорционально концентрации кислорода.

На рис. 2 показан рост концентрации 15 ПАУ и отде­льно бензо]пирена в зависимости от увеличения тем­пературы образования дыма.

В табл. 2 приведено содержание индивидуальных ПАУ в зависимости от температуры пиролиза древесины. Как видно из представленных результатов, при увеличе­нии температуры происходит значительное накопление высокомолекулярных ПАУ, канцерогенность которых в разы выше, чем у бенз]пирена.

Анализ количественного содержания ПАУ в коп­ченой мясной продукции показал, что наиболее часто обнаруживаемыми были 8 ПАУ бенз[а]пирен, бенз[а]антрацен, бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуо-рантен, бенз[g,h,i]перилен, хризен, дибенз[а,h]антрацен и инден[1,2,3-сd]пирен. Суммарное содержа­ние вышеперечисленных 8 ПАУ в среднем превышало 75% от общего количества ПАУ. Еще одним фактором в пользу выбора вышеперечисленных 8 ПАУ в качестве индикатора присутствия ПАУ является высокая степень извлечения, которая варьирует в пределах от 79,2 до 91,4%. В то же время степень извлечения составила от 48,2 до 64,2% для дибензо[а,l]пирена, дибенз[а,е]пирена, дибенз[а,i]пирена, дибенз[а,h]пирена, которые по нор­мам ЕС (EU № 835/2011 от 19.08.2011) контролируются в копченых мясных продуктах. Суммарное содержание перечисленных 4 ПАУ находилось в пределах 60±5% от общего количества 15 ПАУ. Содержание бенза)пирена относительно определяемых 15 ПАУ составило 6±2%. Таким образом, бенз[а]пирен не является подходящим индикатором для контроля ПАУ в копченых мясных продуктах. Учитывая канцерогенный потенциал и воз­можные синергетические эффекты совместного при­сутствия ПАУ, лучшими индикаторами являются выше­перечисленные 8 ПАУ.

Вопрос определения суммарной канцерогенной опасности ПАУ является достаточно дискуссионным, и рядом исследователей были разработаны так называ­емые факторы токсичной эквивалентности (ФТЭ) ПАУ [9, 10]. Однако, несмотря на известную канцерогенную активность ПАУ, на сегодняшний день практически нет разработанных критериев для оценки индивидуального онкологического потенциала веществ данного класса. Анализируя данные ФТЭ, можно с обоснованной уве­ренностью предполагать, что минорные ПАУ играют не менее важную роль в риске возникновения опухолей, чем бенз]пирен, а с учетом их количественного содер­жания и синергетического эффекта смеси риски воз­растают. Проведенные исследования по определению профиля ПАУ позволяют рассчитать суммарную канцерогенную опасность пищевого продукта. В качестве факторов (коэффициентов) токсичной эквивалентности были использованы данные, полученные при исследова­нии ПАУ Калифорнийским управлением оценки эколо­гической опасности для здоровья (OEHHA). Для оценки общей канцерогенности (К, усл. ед.) копченого мясного продукта использовали формулу:

где ПАУi - среднее содержание индивидуального ПАУ, мкг/кг, Qi - фактор токсичной эквивалентности индиви­дуального ПАУ.

Полученные данные представлены в табл. 3.

Таким образом, общая канцерогенность (К, усл. ед.) копченого мясного продукта составляет в сред­нем 3,99±0,80 усл. ед., при этом канцерогенность бенз[а]пирена равна 0,60±0,12 усл. ед., т.е. канцероген­ная опасность копченого мясного продукта не может быть оценена по содержанию бенз]пирена, так как в значительной мере обусловлена присутствием других ПАУ. Следовательно, бенз]пирен не может рассмат­риваться как лимитирующий показатель загрязнения мясных продуктов ПАУ.

Следующим этапом исследований стал поиск воз­можных путей снижения канцерогенной нагрузки при потреблении мясных копченых продуктов.

Для этого были проанализированы данные по со­держанию ПАУ в продуктах, подвергшихся копчению в различных видах упаковочного материала (табл. 4, 5). В мясных изделиях дымного копчения без оболочки суммарное содержание 15 ПАУ в среднем на 25% выше, чем в продуктах, изготовленных в натуральной (черевы, синюги) и искусственных (белковая и фиброузная) обо­лочках, вне зависимости от типа копчения. Наименее проницаемой для канцерогенных веществ показала себя фиброузная оболочка. Длительность копчения также влияет на содержание ПАУ: так, в сырокопченых мясных продуктах в натуральной оболочке содержание ПАУ в среднем на 30% выше, чем в полукопченых, изго­товленных в натуральной оболочке.

Следует отметить, что в зависимости от оболочки меняется не только количественное содержание ПАУ, но и профиль ПАУ, т.е. содержание отдельных ПАУ относительно других ПАУ. При этом содержание бенз[а]пирена весьма стабильно и составляет 6,0±0,5%. Натуральные оболочки наиболее проницаемы для низкомолекулярных наименее канцерогенных ПАУ. Содер­жание высокомолекулярных наиболее канцерогенных дибенз[а]пиренов в продукции, выработанной в бел­ковой оболочке, сравнимо с остаточным количеством дибенз[а]пиренов в продукции в натуральной оболочке. Снижение дибенз[а]пиренов до 2 раз наблюдалось лишь в фиброузных оболочках. Поэтому, хотя остаточное количество ПАУ в продукции в белковой оболочке в среднем на 30% ниже, чем в натуральной, общая канцерогенность продукта в натуральной и белковой оболочках не столь различна. В продукте без оболочки содержание ПАУ в значительной степени зависит от толщины продукта, которая в свою очередь влияет на степень проникновения коптильных веществ. Наличие оболочки является серьезной преградой для проникно­вения ПАУ, особенно низкомолекулярных.

Развитие современных технологий очистки летучих выбросов и сточных вод позволили добиться многократ­ного снижения содержания ПАУ путем фотоокисления и микробной утилизации. Однако применить данные технологии для пищевых продуктов не представляется возможным. Одним из возможных путей снижения коли­чественного содержания ПАУ может быть использова­ние барьерных технологий. Под барьерной технологией понимается пленочная, мембранная защита или компо­зиционная оболочка, препятствующие или существенно снижающие диффузию ПАУ из газо-воздушной среды в продукт.

Термическое разложение древесины проводили, нагревая древесные опилки разных пород при 400­450 °С с последующей обработкой полученной дымной фракцией пищевого продукта в течение 6 ч с темпе­ратурой нагрева обрабатываемого продукта 30-35 °С. В качестве защитных пленок использовали натуральную оболочку по SN 32/34 ЕВР, белковую из коллагена спилка говяжьих шкур и фиброузную на бумажной ос­нове с натуральным целлюлозным покрытием оболочки по ГОСТ 16131-86, бумагу писчую плотностью 80 г/м2, на поверхность которой наносили 20% жиросодержащую микронаноэмульсию растительного или животного жира. Дополнительно для защиты обрабатываемого пищевого материала от дымных компонентов продукт предварительно выдерживали сутки при температуре 4±2 °С в 9% растворе уксусной кислоты или 3% растворе аскорбиновой кислоты. Данные результатов исследова­ний приведены в табл. 6.

Данные по количественному содержанию ПАУ были получены при анализе 486 проб готовой продукции в рамках добровольной сертификации с 2011 по 2017 г. в условиях повторяемости. Результатом проведенных исследований стала разработка проекта ГОСТа "Мясо и мясные продукты. Метод определения полициклических ароматических углеводородов". ФГУП "ВНИИМС" про­вел метрологическую экспертизу и оценку показателей точности методики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725­2002. По результатам предоставленных данных были рассчитаны границы относительной погрешности, предел повторяемости и предел воспроизводимости. Методика позволяет достоверно определять ПАУ в присутствии пос­торонних примесей и системных пиков подвижной фазы.

По результатам работы можно сделать вывод, что снижения содержания ПАУ можно добиться несколькими путями. Одним из них является снижение со­держания жира в рецептуре копченых продуктов. При этом снижение содержания ПАУ не связано со сниже­нием фенольных веществ, отвечающих за вкус и аро­мат копчености. Основным параметром, влияющим на образование ПАУ, является температура образования дыма.

Из полученных данных очевидны преимущества использования белковых и, особенно, фиброузных оболочек по сравнению с натуральными. Белковая и фиброузная оболочки являются более плотными по структуре, их протеиноцеллюлозная основа не яв­ляется сильно жиронабухающей, но проницаемость ПАУ через такие барьеры во многом затруднена. Про­веденные предварительные исследования показали, что целый ряд ингредиентов способствует получению копченых мясных изделий с пониженным содержа­нием ПАУ. К таким ингредиентам относятся многие виды специй, аскорбиновая кислота и ряд природных стабилизаторов. Полученные данные относительно ко­личественного содержания 15 ПАУ позволили выявить индикаторы присутствия ПАУ, которыми являются 8 вышеперечисленных ПАУ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-16-10000).

Литература

1. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Some Non-heterocyclic Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Some Related Exposures, Lyon, 2010. Vol. 92.

2. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food. Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain (Question N° EFSA-Q-2007-136) // EFSA J. 2008. Vol. 724. P. 1-114.

3. Чернуха И.М., Федулова Л.В., Котенкова Е.А., Василевская Е.Р., Лисицын А.Б. Изучение влияния воды с модифицированным изотопным (D/H) составом на репродуктивную функцию, формирование и развитие потомства крыс // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 5. С. 50-57.

4. Сommission Regulation (EU) N 835/2011 of 19 August 2011 amending regulation (EC) N 1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in foodstuffs // Official Journal of the European Union. 20.08.2011. Vol. L 215. P. 4-8.

5. Kulikovskii A.V., Vostrikova N.L., Chernukha I.M., Savtchuk S.A. Methodology of the determination of polycyclic aromatic hydrocar­bons in foods // J. Anal. Chem. 2014. Vol. 69, N 2. Р. 205-209.

6. Иванкин А.Н., Панферов В.И., Фахретдинов Х.А., Вострикова Н.Л., Куликовский А.В. Химические вещества запаха растительных материалов на основе сосны и березы // Лесной вестн. 2015. Т. 19, № 1. С. 46-53.

7. Wretling S., Eriksson A., Eskhult G.A., Larsson B. Polycyclic aro­matic hydrocarbons (PAHs) in Swedish smoked meat and fish // J. Food Compos. Anal. 2010. Vol. 23, N 3. P. 264-272.

8. Roseiro L.C., Gomes A., Patarata L., Santos C. Comparative sur­vey of PAHs incidence in Portuguese traditional meat and blood sausages // Food Chem. Toxicol. 2012. Vol. 50, N 6. P. 1891­1896.

9. Nisbet I.C., LaGoy P.K. Toxic equivalency factors (TEFs) for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) // Regul. Toxicol. Pharmacol. 1992. Vol. 16. P. 290-300.

10. Thorslund T.W., Farrar D. Development of relative potency estimates for PAH and hydrocarbon combustion product fractions compared to benzo[a]pyrene and their use in carcinogenic risk assessment. EPA/600/R-92/134, Dept. Commerce, NTIS, 1990.